武漢酒曲中可培養(yǎng)霉菌的分離鑒定及酒釀營養(yǎng)成分分析

陳　璐，姚淑敏，閆華文

武漢酒曲中可培養(yǎng)霉菌的分離鑒定及酒釀營養(yǎng)成分分析

陳璐，姚淑敏*，閆華文

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

從酒曲中分離純化可培養(yǎng)霉菌，對其進(jìn)行18S rDNA分子鑒定并測定發(fā)酵產(chǎn)物甜酒釀的總糖、酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮含量。結(jié)果表明，從酒曲中分離得到5株霉菌分別命名為FJ-M-1、FJ-M-2、FJ-M-3、FJ-M-4、FJ-M-5，經(jīng)鑒定，F(xiàn)J-M-1和FJ-M-5與印度毛霉JN974020相似度達(dá)到98%，F(xiàn)J-M-2與單卷毛霉KF805740相似度達(dá)到99%，F(xiàn)J-M-3與單卷毛霉KF805739相似度達(dá)到99%，菌株FJ-M-4與Pilaira anomala菌株相似度為99%。對發(fā)酵產(chǎn)物甜酒釀營養(yǎng)成分分析得到，總糖含量先升高，后降低，發(fā)酵60 h時達(dá)到最高值，為246 g/L；總酸含量呈逐漸升高的趨勢，發(fā)酵84 h時達(dá)到最高值為7.6 g/L；氨基酸態(tài)氮的含量先升高，然后趨于穩(wěn)定，84 h時甜酒釀中達(dá)到最高為0.3 g/L；酒精度逐漸升高，48 h后趨于穩(wěn)定，酒精度達(dá)到8.0%vol。

酒曲；甜酒釀；18S rDNA；霉菌；營養(yǎng)成分

甜酒釀又稱江米酒、酪糟、米酒、伏汁酒、糯米酒、甜米酒、酒釀兒等，是一種富含脂肪酸、低聚糖、微量元素及乳酸菌、酵母菌的低酒精度飲品。其所含的低糖成分極易被人體吸收，具有快速補(bǔ)充能量、健胃健脾的功效；適量的有機(jī)酸和各種維生素、礦物質(zhì)亦能被人體快速吸收利用，達(dá)到均衡營養(yǎng)保健的作用［1-4］。

霉菌作為一種在各種酒曲中都存在的功能菌，是我國酒曲微生物的重要組成部分，具有糖化力強(qiáng)、能產(chǎn)生多種影響酒類風(fēng)味的物質(zhì)，在酒的發(fā)酵過程中發(fā)揮著不可替代的作用。常用于釀酒的霉菌主要包括根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）、犁頭霉屬（Absidia）、青霉屬（Penicillium）等［5-9］。

于博等［10］對廣東肇慶傳統(tǒng)小曲的優(yōu)勢霉菌進(jìn)行了分離，得到糖化酶活力強(qiáng)的菌株F6，經(jīng)鑒定為米根霉；周光來等［11］從恩施酒曲中也分離得到了具有較高的糖化酶和液化酶活性的根霉菌株；喻鳳香等［12］從酒曲中分離到30株根霉菌，其中RhizopusRN-1、RhizopusRA-1、RhizopusRS-1、RhizopusRQ-1能產(chǎn)生低聚糖酶，其糖化酶和液化酶活力比菌株Q303高；姚淑敏等［13］從湖南、福建酒曲中分別分離到5株霉菌，主要是根霉。

DUNG N T P等［14］從米酒中分離鑒定出5株酵母菌和魯氏毛霉（Amylomyces rouxii）、少孢根霉（Rhizopus oligosporus）、米根霉（Rhizopus oryzae）等霉菌。YANG S等［15］對韓國的39種Nuruk樣品進(jìn)行研究，從中分離得到174株絲狀真菌。由此可見，霉菌在酒釀的發(fā)酵過程中起到重要的作用。

近年來，除了對甜酒曲中微生物進(jìn)行研究，大批的國內(nèi)學(xué)者致力于研究甜酒釀發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及甜酒釀中營養(yǎng)成分的分析，對其中含有的營養(yǎng)成分進(jìn)行定性和定量分析，為進(jìn)一步提高和優(yōu)化甜酒釀的品質(zhì)提供了參考。楊勇等［16］使用3株米根霉菌株發(fā)酵甜酒釀，通過測定發(fā)現(xiàn)灰分含量為0.44～0.46g/100mL，粗蛋白為1.50～1.60g/100mL，粗脂肪含量和酸度均為0.34～0.46 g/100 mL，而還原糖含量為35.76～37.34 g/100 mL，酒精度為2.1%vol，并重點(diǎn)研究了氨基酸種類及含量，19種氨基酸總含量達(dá)到（1 100～1 700 mg/100 mL，其中谷氨酸含量最高，必需氨基酸的比例達(dá)到32.00%～35.45%。田亞紅等［17］以市售的安琪甜酒曲為發(fā)酵劑制作甜酒釀，分別對糖化酶的活力、還原糖、乙酸和乙醇在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。

本研究通過分離純化技術(shù)得到酒釀中的霉菌，利用18SrDNA進(jìn)行分子鑒定，目的是了解武漢酒曲中霉菌的多樣性。進(jìn)一步對發(fā)酵酒釀的營養(yǎng)成分進(jìn)行定量分析，了解其營養(yǎng)元素、發(fā)酵特點(diǎn)和風(fēng)味，對甜酒釀品質(zhì)的進(jìn)一步提高以及甜酒釀的深加工提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

武漢酒曲：市售。

沙氏液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、葡萄糖40 g/L，pH=5.6±0.2；沙氏固體培養(yǎng)基：在沙氏液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L。

費(fèi)林甲液：稱取60.28 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）用蒸餾水溶解后，移入1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻過濾即成。

費(fèi)林乙液：稱取346 g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于約500 mL蒸餾水中；另稱取氫氧化鈉（NaOH）100 g溶于約200 mL蒸餾水中。將兩者混合，移入1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，放置2 d，如液面降低，需再加水至刻度，搖勻，過濾即成。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、次甲基藍(lán)指示劑、鹽酸、甲基紅指示劑、氫氧化鈉、甲醛、無CO2的水、氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞指示液：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾公司；RE52-99蒸餾裝置（直型冷凝回流管）：上海亞榮生化儀器廠；835型氨基酸自動分析儀：日立（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1霉菌的分離和純化

取1 g酒曲樣品，放入裝有99 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，振蕩20～30 min，即得稀釋度為10-2的稀釋液。用移液槍移取0.5 mL 10-2稀釋液到裝有4.5 mL無菌蒸餾水的小試管中，移液槍吹打，充分混勻，即制得稀釋度為10-3的稀釋液，采用同樣方法依次獲得稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液。分別將上述6個稀釋度的稀釋液，用移液槍移取0.1 mL到沙氏固體培養(yǎng)基上，用無菌涂布棒將其涂布均勻，分別做好標(biāo)記。置于28℃恒溫倒置培養(yǎng)，3～4 d后觀察并記錄結(jié)果，每個稀釋度設(shè)置3個重復(fù)。

選取菌落生長密度合適的平板進(jìn)行劃線分離，分別挑取菌落形態(tài)不同的孢子接種于空白的沙氏固體培養(yǎng)基上，劃線分離，直至長出狀態(tài)一致的菌落時為止。挑取適量孢子點(diǎn)種于新的平板上，待長出菌絲體后用無菌水沖洗孢子，制成10-1～10-6稀釋度的孢子懸液，分別取100 μL孢子稀釋液涂布于空白沙氏固體培養(yǎng)基上，平板上長出的單菌落即認(rèn)為該菌的純培養(yǎng)。

1.3.2霉菌基因組脫氧核糖核酸的提取方法［18］

參考《基因工程實驗指導(dǎo)》關(guān)于真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取方法，提取霉菌菌株的基因組DNA。

1.3.3霉菌18S rDNA片段擴(kuò)增

以真菌18S rDNA基因的通用引物作為序列擴(kuò)增引物，以上述提取的DNA樣品為擴(kuò)增模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaetion，PCR）擴(kuò)增。通用引物序列、反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增條件如下所示：

18S1：5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′18S2：5′-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3′

表1　18S rDNA基因的PCR擴(kuò)增體系Table 1 PCR amplification system of 18S rDNA gene

擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃、5 min，變性94℃、1 min，退火56℃、2 min，延伸72℃、1 min，最后延伸72℃、10 min，30個循環(huán)，4℃保存。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及測序

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。瓊脂糖凝膠濃度：1%，電泳緩沖液：1×TAE，電泳條件：100 V、40 min。通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，選取條帶較亮的樣品送至上海生物工程公司進(jìn)行測序。

1.3.5甜酒釀制備工藝流程

35℃保溫發(fā)酵，從發(fā)酵36 h開始，每隔12 h定時取樣，直到96 h，分別對米酒中的總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、酒精度、游離氨基酸等理化指標(biāo)進(jìn)行測定，研究其變化規(guī)律。

1.3.6測定方法

總糖、酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮含量測定方法：參考GB/T 13662—2008《黃酒國家標(biāo)準(zhǔn)》［19］。

游離氨基酸的測定：用氨基酸自動分析儀對樣品中的游離氨基酸種類和含量進(jìn)行測定。

2　結(jié)果與分析

2.1霉菌的分離純化

從樣品中共分離得到5株不同菌落形態(tài)的霉菌，分別命名為FJ-M-1、FJ-M-2、FJ-M-3、FJ-M-4、FJ-M-5，提取這5株霉菌的DNA，以霉菌的18S1和18S2為上游和下游引物，PCR擴(kuò)增霉菌的18S rDNA，如圖1所示。

圖1　菌株18S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of 18S rDNA PCR amplification product of strain

擴(kuò)增得到1 700 bp大小的片段，與已報道的18S rDNA擴(kuò)增的片段大小相似。將PCR產(chǎn)物回收，送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行BLAS比對分析，挑選與之相似度≥97%的菌株，利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果見圖2。FJ-M-1和FJ-M-5與印度毛霉（Mucor indicus）JN974020相似度達(dá)到98%，F(xiàn)J-M-2與單卷毛霉（Circinella simplex）KF805740相似度達(dá)到99%，F(xiàn)J-M-3與單卷毛霉KF805739相似度達(dá)到99%，菌株FJ-M-4與Pilaira anomala菌株相似度為99%。將獲得的序列提交至NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為FJ-M-1（KM527227）、FJ-M-2（KM527228）、FJ-M-3（KM527229）、FJ-M-4（KM527230）、FJ-M-5（KM527231）。

圖2　5株霉菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of five moulds

2.2甜酒釀總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、酒精度的測定結(jié)果

取分別發(fā)酵36 h、48 h、60 h、72 h、84 h和96 h的米酒，對其總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、酒精度等理化指標(biāo)進(jìn)行測定，測得結(jié)果見圖3。

圖3　甜酒釀中總糖（A）、總酸（B）、氨基酸態(tài)氮（C）、酒精度（D）的變化Fig.3 Changes of total sugar（A），total acid（B），amino acid nitrogen（C）and alcohol content（D）inJiuqu

由圖3A可知，總糖含量先升高、后降低，最后趨于穩(wěn)定；主要是由于發(fā)酵初期霉菌的糖化作用使總糖含量升高，發(fā)酵后期酒釀中的酵母菌利用糖產(chǎn)酒精和其他有機(jī)酸等使總糖含量降低；在發(fā)酵60 h時達(dá)到最高值，為246 g/L。這說明甜酒曲中霉菌的糖化能力較好。

由圖3B可知，隨著發(fā)酵時間的延長，總酸含量呈逐漸升高的趨勢，發(fā)酵84 h時達(dá)到最高值為7.6 g/L，之后含量稍微降低，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能與其中的酵母有關(guān)，由于酵母在發(fā)酵過程中先產(chǎn)酸，后產(chǎn)醇。

由圖3C可知，氨基酸態(tài)氮的含量先升高，然后趨于穩(wěn)定：甜酒釀本身的氨基酸態(tài)氮的含量就偏低，在84 h時甜酒釀中氨基酸態(tài)氮達(dá)到最高，為0.3 g/L。

由圖3D可知，隨著發(fā)酵時間的延長，酒精度逐漸增加，48 h后趨于穩(wěn)定，酒精度達(dá)到8.0%vol；這主要與酒曲中酵母菌的無氧發(fā)酵以及霉菌的糖化作用有關(guān)，不同微生物種類決定了甜酒釀酒精度的高低。

2.3游離氨基酸成分分析

本實驗分別選取發(fā)酵36 h、60 h、72 h和96 h的米酒作為研究對象，以此來研究氨基酸的變化。結(jié)果見表2。

表2　不同發(fā)酵時間甜酒釀中氨基酸含量Table 2 Contents of amino acid with different fermentation time mg/100 mL

由表2可知，20種氨基酸中，除谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn），其余18種氨基酸均存在于甜酒釀中，武漢民間酒釀中含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的18種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸含量較高。氨基酸的總體趨勢是在發(fā)酵72 h時，氨基酸含量達(dá)到最高，之后的發(fā)酵中有所降低，這也充分說明，在民間米酒的發(fā)酵過程中48～72 h為最佳。

3　結(jié)論

從武漢民間酒曲中分離得到的5株霉菌中FJ-M-1、 FJ-M-2、FJ-M-3與FJ-M-5為毛霉，F(xiàn)J-M-4為Pilaira anomala。對發(fā)酵產(chǎn)物甜酒釀營養(yǎng)成分分析得到，總糖含量可達(dá)到246 g/L，總酸含量達(dá)到7.6 g/L，氨基酸態(tài)氮的含量最高為0.3 g/L，酒精度能夠達(dá)到8.0%vol。武漢民間甜酒釀中含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的18種氨基酸，其中人體必需的8種氨基酸含量較高。

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Isolation and identification of cultivable moulds in WuhanJiuquand analysis of nutritional components in fermented glutinous rice

CHEN Lu，YAO Shumin*，YAN Huawen
（Colloge of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China）

Cultivable strains were isolated and purified fromJiuqu.18S rDNA identification was conducted and the total sugar，alcohol，total acid，and amino acid nitrogen content was determined.Results showed that five mould strains isolated fromJiuquwere FJ-M-1，F(xiàn)J-M-2，F(xiàn)J-M-3，F(xiàn)J-M-4，F(xiàn)J-M-5.After identification，F(xiàn)J-M-1 and FJ-M-5 were similar with Mucor JN974020，and the similarity was 98%.FJ-M-2 was similar with Mucor KF805740，and the similarity was 99%.FJ-M-3 was similar with KF805739，and the similarity was 99%.FJ-M-4 was similar withPilaira anomala，and the similarity was 99%.For nutrient analysis of fermented products，the total sugar content increased to the maximum of 246 g/L at 60 h，and then decreased.The total acid content increased gradually，and reached maximum of 7.6 g/L at 84 h.Amino acid nitrogen content increased and then tend to stable，and it reached maximum of 0.3 g/L at 84 h.The alcohol content was stable after 48 h，and it reached maximum of 8.0%vol.

Jiuqu；fermented glutinous rice；18S rDNA；mould；nutritional components

Q939.9

0254-5071（2016）07-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.013

2016-02-29

山東省青年基金資助項目（ZR2013EEQ009）；曲阜師范大學(xué)實驗室開放基金項目（sk201407）

陳璐（1991-），女，碩士研究生，研究方向為微生物資源開發(fā)與利用。

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)和利用。