氨基酸添加對荔枝酒發(fā)酵動力及品質(zhì)影響

商玉薈，朱　萍，鐘秋平

氨基酸添加對荔枝酒發(fā)酵動力及品質(zhì)影響

商玉薈1，朱萍2，鐘秋平1*

（1.海南大學(xué) 食品學(xué)院，海南 海口 570228；2.海南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，海南 ?？?570228）

分別添加質(zhì)量濃度范圍為60～480 mg/L的D-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺于荔枝汁中，測定其對荔枝酒的發(fā)酵動力及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的非揮發(fā)性成分以及揮發(fā)性成分的影響。結(jié)果顯示：添加不同種類與濃度的氨基酸可以不同程度加快可溶性固形物的消耗速率，縮短酵母發(fā)酵時間，且總醇類含量增加，酸類和酯類均有明顯變化。乙醇含量由空白樣的10.52%vol升高到處理樣的10.71%vol～11.68%vol，而甘油的含量由6.33 g/L下降至4.17～6.04 g/L，乙醛的含量也明顯降低。不同種類與濃度的氨基酸對荔枝酒的影響不同。

荔枝酒；發(fā)酵；氨基酸；揮發(fā)性成分

荔枝酒是由新鮮或凍藏荔枝為原料經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵而成，產(chǎn)品呈金黃色，清亮透明，甜潤爽口，且富含人體所需的各種氨基酸、多種維生素及礦物質(zhì)，營養(yǎng)價值高［1-2］。

氮源是滿足酵母生長和發(fā)酵的兩大重要營養(yǎng)素之一，果汁中的氮化物影響酵母的發(fā)酵速率、發(fā)酵持續(xù)時間及發(fā)酵風(fēng)味等，對酵母的生長發(fā)酵及酒的品質(zhì)具有重要的影響［3-5］。果酒發(fā)酵過程中酵母優(yōu)先利用可同化氮素，包括銨態(tài)氮、游離α-氨基酸（脯氨酸除外）和小分子多肽，但同化氮素含量不足可能會引起發(fā)酵緩慢或終止［6-7］。游離氨基酸是果酒中發(fā)酵香氣的主要前體物質(zhì)，其本身具有酸、甜、苦、鮮等味道，不僅給荔枝酒提供了豐富飽滿的感官特征，還與酒中的醇類、酯類、有機(jī)酸、萜烯化合物等協(xié)同構(gòu)成了酒的特有風(fēng)味［8］。因此，可以采取添加氨基酸的方式來保證果酒在發(fā)酵過程中所需可同化氮素的充足性，并賦予果酒獨特的風(fēng)味。

目前，國內(nèi)外的研究主要集中于添加氨基酸對葡萄酒的發(fā)酵動力學(xué)、香氣成分以及品質(zhì)的影響，而關(guān)于氨基酸的添加對荔枝酒發(fā)酵及風(fēng)味影響的研究鮮有報道。因此，本實驗通過在荔枝酒釀造過程中添加不同種類不同濃度的氨基酸，來研究氨基酸的添加對荔枝酒的發(fā)酵動力以及品質(zhì)的影響，旨在進(jìn)一步提高荔枝酒的感官品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金澄無核荔枝：市售，去皮后冷凍保藏。

果膠酶、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DV10：上海杰兔工貿(mào)有限公司。

D-丙氨酸（D-Ala）、L-精氨酸（L-Arg）、L-谷氨酰胺（L-Glu）（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；甲醇（色譜純）：瑞典歐森巴克化學(xué)公司；焦磷酸鈉、磷酸二氫鈉等（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

酒精、乙酸和甘油測定試劑盒：德國拜發(fā)公司；丙酮酸試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2儀器與設(shè)備

GI54DW立式壓力蒸汽滅菌器：致微儀器有限公司；DS-200組織搗碎機(jī)：上海壘固儀器有限公司；HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；ILRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械有限公司；AR124CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；BiofugePrimoR高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技有限公司；TG16-WS高速離心機(jī)：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PAL-1手持糖度計：愛宕科學(xué)儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；Agilent 1260液相色譜儀、Agilent 6890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司。

1.3方法

1.3.1荔枝汁的制備

將解凍后的荔枝果肉打漿，根據(jù)果漿的質(zhì)量添加0.2 g/kg果膠酶，酶解2 h，紗布過濾除去果渣，添加蔗糖與蘋果酸，調(diào)整荔枝汁的糖度與pH值分別為22.8°Bx和3.56。根據(jù)所得的果汁體積添加1 g/L皂土，靜置24 h，取上清液進(jìn)行硅藻土抽濾，離心后得澄清荔枝汁，接種前添加120 mg/L的SO2（以偏重硫酸鈉的形式添加）。

1.3.2荔枝汁的發(fā)酵

釀酒酵母DV10于42℃條件下活化30 min，將活化好的酵母接種在滅菌（100℃滅菌15 min）后的荔枝汁中，20℃培養(yǎng)24 h，得到的酵母培養(yǎng)物以10%的比例接種，再分別添加60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L（添加量以氮計）的D-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺的荔枝汁中，20℃恒溫發(fā)酵，以不添加氨基酸的荔枝汁作為空白對照。

1.3.3生長曲線及糖耗曲線的繪制

取1mL荔枝汁發(fā)酵液，離心后取得酵母沉淀物，添加蒸餾水洗滌，離心兩次取得最終酵母沉淀物，以干重法（80℃烘干）每天測定酵母質(zhì)量。以酵母質(zhì)量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)繪得酵母生長曲線。

用手持糖度計每天測定可溶性固形物含量，以可溶性固形物含量為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)描述可溶性固形物變化趨勢。pH值：20℃恒溫發(fā)酵10 d，pH計測得。

1.3.4代謝產(chǎn)物的測定

丙酮酸、乙酸、甘油、乙醇的測定：分別取得各樣品1mL，6 000 r/min離心10 min，取上清液，稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后，按照檢測試劑盒說明書測定丙酮酸、乙酸、甘油、乙醇含量。

蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸的測定采用高效液相色譜法：色譜柱為Zorbax SB-aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.01 mol/L磷酸二氫銨（pH=2.62）∶甲醇=97∶3；柱溫30℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量15 μL；檢測波長215 nm。

1.3.5揮發(fā)性物質(zhì)的測定

采用氣質(zhì)聯(lián)用儀測定，AB-INowax（30.0 m×250 μm× 0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱。

色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃；初始柱溫45℃，保持2 min，以5℃/min升溫至230℃，保持20 min；載氣：高純He（99.999%）；柱流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1。

質(zhì)譜條件：電源方式為電子電離（electronic ionization，EI）；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；接口溫度280℃；掃描質(zhì)量范圍10～450 amu。

1.3.6數(shù)據(jù)分析

文中所有分析數(shù)據(jù)為各組處理三次重復(fù)的平均值，利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計處理，SPSS 18.0進(jìn)行方差分析，各平均值利用Duncan多重比較檢驗進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），繪圖軟件為Origin 8.0。

2　結(jié)果與分析

2.1氨基酸添加對酵母生長與發(fā)酵速率的影響

荔枝酒在發(fā)酵過程中，氨基酸缺乏會導(dǎo)致葡萄糖通透酶運轉(zhuǎn)能力下降，進(jìn)而降低發(fā)酵能力［9］。張斌等［10］認(rèn)為，添加適量氨基酸的荔枝酒中游離氨基酸總量減少，氨基酸的轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)，酵母發(fā)酵利用氨基酸的能力增強(qiáng)，進(jìn)而加快了發(fā)酵速率。不同氨基酸添加量的酵母生長曲線如圖1所示，氨基酸添加明顯加快了發(fā)酵速率，縮短了發(fā)酵時間。隨著氨基酸濃度的增加，發(fā)酵速率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。對于添加同種氨基酸，氨基酸添加量為60 mg/L的處理樣發(fā)酵速率明顯最低，而氨基酸添加量為240 mg/L的處理樣則呈現(xiàn)相反的趨勢。在發(fā)酵初期，與同水平的其他種類氨基酸相比，L-Gln處理樣的發(fā)酵速率最快，而D-Ala處理樣的發(fā)酵速率最慢。這說明濃度為240 mg/L的氨基酸添加量為荔枝酒中酵母發(fā)酵的最適添加量，添加氨基酸種類不同，發(fā)酵速率不同。

圖1　酵母生長曲線Fig.1 Growth curves of yeast

2.2氨基酸添加對非揮發(fā)性組分的影響

2.2.1可溶性固形物變化

添加氨基酸及對照荔枝酒（CK）發(fā)酵的可溶性固形物含量隨時間的變化結(jié)果見圖2。如圖2所示，在發(fā)酵過程中，發(fā)酵液中的可溶性固形物含量一直呈現(xiàn)下降趨勢，在發(fā)酵初期，這種趨勢最為明顯。在初始可溶性固形物含量相同的情況下，D-Ala處理樣的可溶性固形物含量始終高于L-Arg和L-Gln處理樣，說明D-Ala處理樣的發(fā)酵速率較慢。而發(fā)酵結(jié)束時，各樣品可溶性固形物的總含量差別不大。這說明，添加氨基酸后，可溶性固形物消耗增快，糖耗速率增快。

圖2　添加氨基酸對可溶性固形物消耗量Fig.2 Consumption of soluble solid contents with amino acid addition

2.2.2有機(jī)酸、甘油及酒精度的變化

添加不同氨基酸發(fā)酵10d后，荔枝酒的理化指標(biāo)見表1。如表1所示，L-Arg與L-Gln處理樣的蘋果酸質(zhì)量濃度隨著添加氨基酸含量的增加而減少，而D-Ala處理樣的蘋果酸含量無特別明顯的變化。與對照樣相比，隨著添加氨基酸濃度的增加，D-Ala與L-Gln處理樣的琥珀酸質(zhì)量濃度先減少后增加，而L-Arg則呈現(xiàn)小幅度的降低趨勢。各處理樣的丙酮酸含量均有所增加，且與氨基酸質(zhì)量濃度成正比，氨基酸種類不同而添加量相同的處理樣差異不顯著（P＞0.05）。D-Ala與L-Arg的添加對檸檬酸的含量無明顯影響，但L-Gln處理樣中的檸檬酸的含量增加，且與氨基酸濃度呈成正比趨勢。發(fā)酵結(jié)束后，各處理樣的pH值均有極小幅度的增加，且與氨基酸添加量成正比。

與空白樣相比，各處理樣的酒精度均顯著增加（P≤0.05），所有處理樣的酒精度均在氨基酸添加量為60 mg/L時達(dá)到最大值，L-Gln處理樣的酒精度升高程度最為顯著。直至發(fā)酵完全，氨基酸處理樣的甘油含量明顯低于空白樣。釀酒酵母在厭氧條件下生長，通過減少過剩的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）形成和增加生物合成中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的消耗可以減少甘油的形成并且增加酒精的產(chǎn)量［11］。甘油的主要作用是在高糖濃度或者其他壓力源存在的條件下調(diào)控滲透壓，在發(fā)酵的前兩天，在轉(zhuǎn)化酶存在的條件下，蔗糖進(jìn)行水解，增加了葡萄糖和果糖的含量，這可能增加了滲透壓進(jìn)而增加了甘油產(chǎn)量［12］。然而，氨基酸可以作為滲透壓保護(hù)劑進(jìn)而抑制了甘油生成的需要［13］。

表1　荔枝酒的理化指標(biāo)Table 1 Phsicochemical parameters of lychee wine

2.3氨基酸添加對揮發(fā)性組分的影響

如表2所示，荔枝酒中共檢測出27種揮發(fā)性物質(zhì)，大致分為七大類。其中醇類、酸類以及羧基化合物在揮發(fā)性化合物中占較大比例，尤其是醇類化合物占整個揮發(fā)性化合物的比例達(dá)到74%以上。

表2　荔枝酒中揮發(fā)性成分的相對含量Table 2 Relative constituents of volatile components in lychee wine　%

2.3.1醇類

高級醇是酵母酒精發(fā)酵階段自身代謝形成的，其主要生成途徑為氨基酸降解代謝和糖類物質(zhì)合成，雖然含量過高的高級醇會對人體造成危害，但酒中高級醇含量過少則會導(dǎo)致酒體風(fēng)味單薄［14-15］。添加氨基酸后高級醇的含量增加，這與氨基酸過剩在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，脫氨產(chǎn)生α-酮酸，α-酮酸在脫羧酶的作用下生成醛，而后醛在脫氫酶的作用下，進(jìn)一步還原為醇類有關(guān)。在中高質(zhì)量濃度的L-Arg與L-Gln處理樣中，正丙醇的含量有著較為明顯的增加，而在D-Ala處理樣中，其沒有明顯變化。與空白樣相比，處理樣中的異丁醇與1，2-丙二醇含量分別有不同程度的增加和減少，而2-甲基丁醇的含量并未出現(xiàn)明顯變化。作為荔枝酒含量最高的高級醇，2，3-丁二醇在L-Gln處理中變化范圍最為顯著，且其含量有著先降低后增加而后又有小幅度的降低趨勢。與此同時，D-Ala處理樣的3-甲基丁醇、苯甲醇以及4-羥基苯乙醇的含量明顯高于空白樣和其他處理樣，且其含量與氨基酸質(zhì)量濃度成正比，與D-Ala處理樣相比，其他兩種氨基酸的添加對這三種物質(zhì)的影響并不夠明顯。這說明，添加氨基酸后醇類變化較為明顯，且不同氨基酸對醇類的影響作用不同。

2.3.2酯類

在荔枝酒發(fā)酵的酵母代謝過程中，酯類物質(zhì)主要由乙酰輔酶A化合物的酵解和氨基酸的碳骨架生成，它們賦予荔枝酒特殊的果香味和花香味［16］。如表2所示，D-Ala處理樣的乙酸丙酯含量明顯高于其他樣品，且隨著丙氨酸質(zhì)量濃度的增加而增加，而其它氨基酸處理樣的乙酸丙酯含量沒有表現(xiàn)出明顯變化。乙酸丙酯有著極為柔和的果香味，能夠賦予荔枝酒獨有的香氣。

2.3.3揮發(fā)酸

乙酸的含量影響著荔枝酒發(fā)酵過程中的酵母細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成及代謝等，乙酸體積分?jǐn)?shù)過高會給荔枝酒帶來明顯的苦味和酸味［16］。荔枝酒中乙酸的來源主要來自醋酸菌的氧化、酵母的代謝以及異型乳酸發(fā)酵。如表1所示，D-Ala處理樣的乙酸含量明顯降低，且隨著D-Ala添加量的增加而減少，L-Arg處理樣各水平間的乙酸含量沒有明顯變化。這說明，D-Ala的添加可以在一定程度上抑制揮發(fā)酸含量的升高，不同種類的氨基酸對荔枝酒中乙酸的產(chǎn)生影響不同，濃度范圍也要依據(jù)氨基酸的種類來定。氨基酸的添加使得荔枝酒中的辛酸由無到有。雖然辛酸具有令人不愉快的氣味，但它可以與醇類生成酯類，是優(yōu)化果酒品質(zhì)的重要保障［17］。氨基酸的添加并未對異山梨酸的含量產(chǎn)生明顯影響。

2.3.4硫化物

在極低濃度下，硫化物仍能產(chǎn)生使人不愉快的氣味，并且極難清除，極大地影響了荔枝酒的品質(zhì)［18］。如表2所示，添加氨基酸后，二甲基硫少量出現(xiàn)。D-Ala處理樣的3-甲硫基丙醇含量增加，其他兩種氨基酸處理樣的3-甲硫基丙醇含量在不同的氨基酸濃度下，沒有明顯變化或者未被檢出。

2.3.5羰基化合物

乙醛是果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，會給果酒帶來不成熟的口感甚至是辛辣感。因此，降低乙醛的含量對提升荔枝酒的品質(zhì)具有重要意義。如表2所示，與空白樣相比，處理樣的乙醛含量均有不同程度的降低，且隨著氨基酸質(zhì)量濃度的增大，含量呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢。添加氨基酸后，各處理樣的4，5-二甲基-1，3-二氧雜環(huán)戊烯-2-酮均有不同程度降低。

3　結(jié)論

在荔枝酒中添加不同質(zhì)量濃度以及種類的氨基酸，明顯改變了荔枝酒的發(fā)酵動力及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的非揮發(fā)性成分和揮發(fā)性成分，且不同種類與濃度的氨基酸對荔枝酒的的影響不同。特定濃度與種類氨基酸的添加不僅加快了釀酒酵母的發(fā)酵速率也增加了荔枝酒中的優(yōu)良組分，減少了不良組分。關(guān)于氨基酸添加對發(fā)酵荔枝酒的影響機(jī)制，還需更加長遠(yuǎn)的探索。畢竟不同釀酒酵母能夠產(chǎn)生不同風(fēng)味和香氣的醇類以及揮發(fā)性中間代謝物，不同的氨基酸對荔枝酒發(fā)酵的影響也不同，而且發(fā)酵所需的氨基酸濃度還與發(fā)酵溫度、pH值等密切相關(guān)。

［1］鐘秋平，黃盼盼，趙新河.葡萄冰酒干酵母R2發(fā)酵冰荔枝酒工藝條件的優(yōu)化［J］.中國釀造，2008，27（5）：95-98.

［2］曾英杰，鐘秋平，李從發(fā)，等.荔枝酒揮發(fā)酸控制技術(shù)研究進(jìn)展［J］.中國釀造，2013，32（5）：1-4.

［3］DAI C，JING Y C，LIU S Q.Impact of addition of aromatic amino acids on non-volatile and volatile compounds in lychee wine fermented with Saccharomyces cerevisiaeMERIT.ferm［J］.Int J Food Microbiol，2014，170（3）：12-20.

［4］VILANOVA M，SIEBERT T E，VARELA C，et al.Effect of ammonium nitrogen supplementation of grape juice on wine volatiles and nonvolatiles composition of the aromatic grape variety Albari?o［J］.Food Chem，2012，133（1）：124-131.

［5］TORREA D，VARELA C，UGLIANO M，et al.Comparison of inorganic and organic nitrogen supplementation of grape juice Effect on volatile composition and aroma profile of a Chardonnay wine fermented with Saccharomycescerevisiaeyeast［J］.Food Chem，2011，127（3）：1072-1083.

［6］繆成鵬，張暉，楊曉雁，等.可同化氮含量對赤霞珠葡萄酒發(fā)酵和香氣成分的影響［J］.中國釀造，2015，34（1）：131-136.

［7］GARDE-CERDáN T，MARTíNEZ-GIL A M，LORENZO C，et al.Implications of nitrogen compounds during alcoholic fermentation from some grape varieties at different maturation stages and cultivation systems［J］. Food Chem，2011，124（1）：106-116.

［8］沈穎，劉曉艷，白衛(wèi)東，等.荔枝酒釀造過程中氨基酸的變化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（5）：191-196.

［9］蓋寶川，籍保平，張泓，等.蘋果酒發(fā)酵過程中酵母對氨基酸利用的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（11）：34-38.

［10］張斌，曾新安，陳勇，等.添加谷氨酸對荔枝酒發(fā)酵過程的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，33（10）：54-57.

［11］NISSEN T L，KIELLAND-BRANDT M C，NIELSEN J，et al.Optimization of ethanol production inSaccharomyces cerevisiaeby metabolic engineering of the ammonium assimilation［J］.Metabolic Eng，2000，2（1）：69-77.

［12］BATISTA A S，MILETTI L C，STAMBUK B U.Sucrose fermentation bySaccharomycescerevisiaelackinghexose transport［J］.J Mol Microbiol Biotechnol，2004，8（1）：26-33.

［13］TAKAGI H.Proline as a stress protectant in yeast：physiological functions，metabolic regulations，and biotechnological applications［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，81（81）：211-223.

［14］程軍，秦偉帥，趙新節(jié).葡萄酒釀造中高級醇的形成機(jī)制與調(diào)節(jié)［J］.中國釀造，2011，30（12）：9-11.

［15］劉明，王頡，牟建樓.不同發(fā)酵條件對金絲小棗酒釀造過程中高級醇生成的影響［J］.食品科技，2009，41（4）：52-56.

［16］曾英杰，方佳，李從發(fā)，等.荔枝酒釀造中釀酒酵母同步代謝醋酸的研究［J］.熱帶作物學(xué)報，2015，36（5）：981-986.

［17］惠竹梅，呂萬祥，劉延琳.可同化氮素對葡萄酒發(fā)酵香氣影響研究進(jìn)展［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（24）：5058-5066.

［18］LANDAUD S，HELINCK S，BONNARME P.Formation of volatile sulfur compounds and metabolism of methionine and other sulfur compounds in fermented food［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，77（6）：1191-1205.

Effect of amino acids supplementation on fermentation dynamics and quality of lychee wine

SHANG Yuhui1，ZHU Ping2，ZHONG Qiuping1*
（1.College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China；2.College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228，China）

Supplementation of D-alanine，L-arginine，L-glutamine with different concentration in the range of 160-480 mg/L was added into lychee juice，respectively.The effects of supplementation on the fermentation dynamics，non-volatile and volatile constituents produced during the fermentation of lychee wine were investigated.The results showed that addition of different types and concentrations of amino acids increased the consumption rate of soluble solid contents at different degrees，while shortened the yeast fermentation time，increased total alcohols，and significantly changed acids and esters content.The ethanol content was slightly increased from 10.52%vol in the blank sample to 10.71%vol-11.68%vol in the treatment sample，whereas the glycerol content decreased from 6.33 g/L to 4.17-6.04 g/L，and the acetaldehyde content was also decreased obviously.Different type and amino acid concentration supplement had the different impact on lychee wine.

lychee wine；fermentation；amino acid；volatile constituents

TS261.4

0254-5071（2016）07-0166-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.036

2016-01-27

國家自然科學(xué)基金資助項目（No.31260398）

商玉薈（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品發(fā)酵。

鐘秋平（1966-），男，教授，博士，研究方向為食品發(fā)酵。