高效液相色譜法測(cè)定酵母細(xì)胞壁中甘露聚糖和β-葡聚糖

徐婷婷，劉　艷，張子健，周雪玲，陳志穎

高效液相色譜法測(cè)定酵母細(xì)胞壁中甘露聚糖和β-葡聚糖

徐婷婷，劉艷，張子健，周雪玲，陳志穎*

（唐山拓普生物科技有限公司，河北 唐山 063000）

建立了利用高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)酵母細(xì)胞壁中的甘露聚和β-葡聚糖含量的方法。色譜條件為采用Welch Sugar-Ca（7.8 mm× 300 mm）色譜柱，以純水為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，柱溫為80℃，示差折光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，甘露聚糖和β-葡聚糖在200～1 000 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1.15%，回收率為98%～100%。該方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確方便，適用于酵母細(xì)胞壁中甘露聚糖和β-葡聚糖含量的檢測(cè)。

β-葡聚糖；甘露聚糖；高效液相色譜；酵母細(xì)胞壁

酵母甘露聚糖（yeast mannan）和β-葡聚糖（β-glucan）是酵母細(xì)胞壁的重要組成成分，二者的總量大約占細(xì)胞壁總干質(zhì)量的85%［1］，其中甘露聚糖位于細(xì)胞壁的外層，約占細(xì)胞壁干質(zhì)量的40%～45%［2］，而β-葡聚糖則位于細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)，占細(xì)胞壁干質(zhì)量的26%～30%［3］。

酵母β-葡聚糖是一種以β-1，3-D糖苷鍵為主鏈，β-1，6-D糖苷鍵為側(cè)鏈的活性多糖［4］。它能夠刺激釋放白介素以增強(qiáng)機(jī)體防御有害物質(zhì)的能力，提高人體免疫力［5-7］。同時(shí)具有抗輻射［8］、抗癌［9］、調(diào)節(jié)血脂、降低膽固醇［10］和促進(jìn)傷口愈合［6］等功能。酵母甘露聚糖又稱甘露糖蛋白，由兩種糖肽鍵組成，主鏈為單鏈，糖苷鍵以α-1，6形式連接，主鏈上有豐富的支鏈［10］。甘露聚糖具有免疫調(diào)節(jié)［12］、改善腸道健康［13］、選擇性吸附病原微生物［14］等功能。

酵母β-葡聚糖和甘露聚糖的檢測(cè)一般采用不同的方法分開進(jìn)行檢測(cè)，酵母β-葡聚糖檢測(cè)多采用苯酚-硫酸法［14-16］和高效液相色譜法［17-19］進(jìn)行，甘露聚糖的檢測(cè)多采用總糖檢測(cè)方法和紫外分光光度法［20-22］。但此方法靈敏度較低，不能準(zhǔn)確的分辨出甘露聚糖和β-葡聚糖以及其他多糖，檢測(cè)結(jié)果存在誤差。本研究采用高溫水解-高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定酵母細(xì)胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖的含量，確定了最佳水解條件，并采用凝膠多糖（curdlan）和甘露聚糖為對(duì)照品，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正，為酵母細(xì)胞壁中甘露聚糖和β-葡萄糖的含量測(cè)定提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

酵母細(xì)胞壁：唐山拓普生物科技有限公司；鹽酸（體積分?jǐn)?shù)36%～38%）：天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；凝膠多糖（純度≥99.00%）、甘露聚糖（純度≥99.00%）：美國Sigma公司；D（+）-甘露糖（純度≥99.99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

UltiMate3000高效液相色譜儀：美國戴安公司；BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司；微型漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上?？祪x儀器有限公司；JHH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器制造有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品處理方法

精密稱取0.400 0 g酵母細(xì)胞壁樣品置于50 mL具塞試管中，準(zhǔn)確加入一定量的鹽酸，將試管置于漩渦混合器上混合均勻。置于35℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，每隔10 min取出于混合器中混合20 s。然后將混合均勻的樣品轉(zhuǎn)移到250 mL Schott-瓶中，用純水定容至150 mL，振蕩混勻后置于121℃高壓滅菌鍋中水解60 min。

將水解后的樣品取出，冷卻至室溫，用50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6～7。將調(diào)好pH值的溶液轉(zhuǎn)移至200 mL的容量瓶中并定容，用0.45 μm濾膜過濾，高效液相色譜法測(cè)定葡聚糖和甘露聚糖含量。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.200 0 g經(jīng)98～100℃干燥2 h的葡萄糖和甘露糖，用純水溶解并定容至100 mL，搖勻得到質(zhì)量濃度為2 g/L的葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別吸取1.0 mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL上述溶液于10mL容量瓶中，用純水定容，搖勻得到質(zhì)量濃度分別為200μg/mL、400μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1 000 μg/mL的葡萄糖和甘露糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45 μm濾膜過濾，高效液相色譜法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度與色譜峰面積之間的回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3色譜條件

Sugar-Ca色譜柱：（7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：純水（一級(jí)水）；流速：0.5 mL/min；柱溫：80℃；進(jìn)樣量：50 μL。

1.3.4計(jì)算公式

式中：X為樣品中葡聚糖或甘露聚糖含量，%；A1為根據(jù)樣品溶液的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品溶液的葡聚糖、甘露聚糖的含量，mg/L；A2為根據(jù)甘露聚糖或凝膠多糖的峰面積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的樣品溶液葡聚糖或甘露聚糖含量，mg/L；m1為稱取樣品的質(zhì)量，g；m2為稱取甘露聚糖對(duì)照品或葡聚糖對(duì)照品的質(zhì)量，g；0.2為樣品/甘露聚糖對(duì)照品定容后的體積，mL；0.9為將甘露糖換算成甘露聚糖（葡萄糖換算成葡聚糖）的系數(shù)；F為樣品酸水解中甘露聚糖或葡聚糖被破壞造成結(jié)果偏低的經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)償系數(shù)；P為甘露聚糖或凝膠多糖對(duì)照品的純度（依據(jù)試劑廠家提供的檢測(cè)報(bào)告）；W為甘露聚糖或凝膠多糖對(duì)照品的水分（依據(jù)試劑廠家提供的檢測(cè)報(bào)告）。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用1.3.2配制的葡萄糖和甘露糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并采用1.1.3的色譜分析條件進(jìn)行檢測(cè)，各質(zhì)量濃度的葡萄糖、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積見表1；以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

表1　葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC色譜峰面積Table1 HPLC chromatographic peak area of glucose and mannose standard solution

圖1　葡萄糖（A）和甘露糖（B）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose（A）and mannose（B）

結(jié)果表明，在200～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.014 13x-0.014 19，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 9，甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為：y=0.015 7x+ 0.061 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。并且在方法設(shè)定的色譜條件下，能夠完全將葡萄糖和甘露糖分開，采用同一檢測(cè)條件可同時(shí)檢測(cè)β-葡聚糖和甘露聚糖，排除了甘露聚糖對(duì)β-葡聚糖的干擾，檢測(cè)色譜圖見圖2、圖3。

圖2　葡萄糖（A）和甘露糖（B）標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of glucose（A）and mannose（B）

圖3　葡萄糖、甘露糖標(biāo)準(zhǔn)混合溶液（A）及酵母細(xì)胞壁水解液（B）HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of glucose and mannose standard mixed solution（A）and the hydrolysate（B）of yeast cell wall

2.2標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)

在確定酸用量、前期處理時(shí)間、溫度及水解時(shí)間等條件下，酵母細(xì)胞壁能夠完全水解為葡萄糖和甘露糖。但在此條件下，強(qiáng)酸可能會(huì)對(duì)β-葡聚糖和甘露聚糖產(chǎn)生一定的破壞，使其降解為了其他的物質(zhì)，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的偏差［13］。因此，需要采用凝膠多糖和甘露聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品來對(duì)水解條件進(jìn)行校正。

在已確定的水解條件下水解凝膠多糖和甘露聚糖，檢測(cè)后計(jì)算其含量，通過與理論值進(jìn)行比較得出一個(gè)校正因子F（使用1.3.4中的公式）。在采用本方法水解的條件下，檢測(cè)凝膠多糖和甘露聚糖的含量，檢測(cè)結(jié)果見表2、表3。

表2　凝膠多糖檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of curdlan

表3　甘露聚糖檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection results of mannan

由表2、表3可知，采用凝膠多糖和甘露聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的校正因子F分別為1.22、1.25。

2.3方法穩(wěn)定性及回收率

2.3.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

利用1.3.1中所描述的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理及檢測(cè)，重復(fù)檢測(cè)5次，檢測(cè)酵母細(xì)胞壁中的β-葡聚糖和甘露聚糖含量，結(jié)果見表4。

表4　方法穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of stability of the method

由表4可知，在相同的處理?xiàng)l件下，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)試，檢測(cè)到的β-葡聚糖和甘露聚糖相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.12%和1.07%，具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.2回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取樣品，加入葡萄糖和甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.1中的處理方法進(jìn)行樣品處理。將處理好的樣品與標(biāo)品混合物利用HPLC進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為50 μL按峰面積計(jì)算出平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），測(cè)定結(jié)果見表5。

表5　回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery rate experiments

由表5可知，此檢測(cè)方法中葡聚糖和甘露聚糖的平均回收率分別為98.54%和99.08%，回收率在90%～110%，測(cè)定過程中樣品損失程度較低，表示檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高。

3　結(jié)論

采用高溫處理-HPLC法同時(shí)測(cè)定酵母細(xì)胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖含量，最佳水解條件為：采用0.55 mol/L的鹽酸水解處理30 min，再121℃高溫高壓處理1 h，調(diào)節(jié)pH至中性。采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，確定最佳的色譜條件，凝膠多糖和甘露聚糖作為校準(zhǔn)品，校正酸水解對(duì)β-葡聚糖和甘露聚糖降解的影響，形成最優(yōu)酵母細(xì)胞壁中β-葡聚糖和甘露聚糖含量同時(shí)檢測(cè)的方法，重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高、簡(jiǎn)單易行。

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Determination of mannan and β-glucan in yeast cell wall by HPLC

XU Tingting，LIU Yan，ZHANG Zijian，ZHOU Xueling，CHEN Zhiying*
（Tangshan TOP Bio-Technology Co.，Ltd.，Tangshan 063000，China）

The determination method of mannan and β-glucan content in the yeast cell wall was established by HPLC.The chromatographic conditions were as follows：the chromatographic column Welch Sugar-Ca（7.8 mm×300 mm），mobile phase was pure water，flow rate was 0.5 ml/min，column temperature was 80℃，and the signal was detected by refractive index detector.The results showed that at the range of 20-1 000 μg/ml，the content of mannan and β-glucan had a good linear relationship with the peak area.The relative standard deviation of the method was less than 1.15%. The recovery rate was 98%-100%.The method was simple，accurate and convenient，which was suitable for the determination of mannan and β-glucan contents in yeast cell wall.

β-glucan；mannan；HPLC；yeast cell wall

TS261.1

0254-5071（2016）07-0180-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.039

2016-03-21

徐婷婷（1987-），女，本科，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。

陳志穎（1972-），女，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)榻湍讣敖湍秆苌铩?/p>