灰樹花胞外多糖脫蛋白工藝研究

朱思潔，吳天祥，楊祖滔，黃　忠

灰樹花胞外多糖脫蛋白工藝研究

朱思潔，吳天祥*，楊祖滔，黃忠

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

以脫蛋白效率和多糖損失率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察Sevag法、酶法和三氯乙酸法三種脫蛋白方法對(duì)灰樹花胞外多糖的脫蛋白效果的影響。結(jié)果顯示，三氯乙酸法脫蛋白優(yōu)于Sevag法和酶法，三氯乙酸的最佳添加量為3%，此時(shí)的脫蛋白效率為68.40%，多糖損失率為21.11%。紫外光譜掃描結(jié)果顯示，經(jīng)過三氯乙酸脫蛋白處理后的灰樹花胞外多糖在波長(zhǎng)200～600 nm范圍沒有明顯吸收峰，表明粗多糖中的蛋白已基本除去。三氯乙酸法可作為灰樹花胞外多糖純化的一種有效的脫蛋白方法。

灰樹花；胞外多糖；脫蛋白

灰樹花（Grifola frondosa）在日本稱之“舞茸”，美國(guó)稱之為“林雞”，是一種食用藥用型真菌，隸屬擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，子實(shí)體肉質(zhì)［1］?；覙浠I(yíng)養(yǎng)豐富、生物活性物質(zhì)含量高，其中灰樹花胞外多糖（exopolysacccharides，EPS）是其重要的生物活性物質(zhì)之一，近年來研究表明，灰樹花多糖具有抗腫瘤［2-3］、清除自由基［4］、抗艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）［5］、抗氧化［6］、降低體內(nèi)血糖水平［7］等生物活性。本課題組前期已對(duì)灰樹花深層發(fā)酵液中提取胞外多糖制得粗多糖工藝做了研究［8］。但粗多糖中通常含有無機(jī)鹽、單糖、寡糖、低分子質(zhì)量的非極性物質(zhì)及高分子質(zhì)量的有機(jī)雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、木質(zhì)素）等［9］。為獲得灰樹花胞外多糖純品需對(duì)粗多糖制品分離純化，其中脫蛋白是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前，國(guó)內(nèi)外的脫蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法和酶法等［10］。Sevag為最常用的方法，但需多次重復(fù)處理，且此法使用的氯仿是有毒物質(zhì)，容易造成多糖活性下降和溶劑殘留；三氯乙酸法除蛋白比Sevag法效果好，而且可以同時(shí)除掉部分色素；Sevag法和酶法聯(lián)用脫蛋白可降低多糖損耗，減少操作次數(shù)，處理效果優(yōu)于單一的Sevag法，但酶具有專一性且存在酶殘留及酶降解產(chǎn)物的去除問題。本實(shí)驗(yàn)采用Sevag法、酶法、三氯乙酸法3種方法脫除灰樹花胞外多糖，篩選出灰樹花胞外多糖去蛋白最佳工藝，為進(jìn)一步分析灰樹花胞外多糖種類和單糖組成及其活性多糖功能活性研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

灰樹花（Grifola frondosa）（菌種編號(hào)5.404）：中國(guó)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2化學(xué)試劑

牛血清蛋白：美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)：美國(guó)Amresco公司；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）：美國(guó)Sciencelab公司；氯仿（分析純）：重慶川東化工集團(tuán)有限公司；正丁醇（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨2 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，瓊脂20 g/L；pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏6 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏6 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L；pH自然。

培養(yǎng)基滅菌條件：121℃、30 min。

1.2儀器與設(shè)備

BXM-30R立式滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；TDL-40B高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TS-2102C恒溫振蕩器：上海天呈儀器有限公司；UV-1800雙光速紫外可見光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1斜面種子培養(yǎng)

于母種試管中切取黃豆粒大小的菌絲塊接于PDA斜面中部，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)斜面。

1.3.2液體種子培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的斜面菌種用接種扒切取蠶豆大小顆粒，接種于液體種子培養(yǎng)基中，一支PDA斜面接種一瓶。裝液量100 mL/250 mL，25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)4～7 d。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)基

按10%的接種量接種。用移液管量取液體種子，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中。裝液量為1 L/2 L，25℃、150 r/min搖床培養(yǎng)9 d。

1.3.4灰樹花胞外多糖提取方法

灰樹花發(fā)酵培養(yǎng)液過濾菌絲體獲得發(fā)酵液，用4倍體積體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇4℃醇沉24 h，再經(jīng)過4000r/min離心15 min，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇清洗2次后用真空冷凍干燥獲得灰樹花胞外粗多糖。

1.3.5灰樹花胞外粗多糖脫蛋白方法

（1）Sevag法

用蒸餾水配制1%的粗多糖溶液，多糖溶液與Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V）按照4∶1體積比混合，振蕩30 min，離心取沉淀。取5份10 mL樣品用上述步驟分別重復(fù)處理1～5次，再苯酚硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法分別測(cè)定每組樣品上清液中多糖含量和蛋白含量，計(jì)算多糖損失率和脫蛋白效率。

（2）木瓜蛋白酶法

用蒸餾水配制1%的粗多糖溶液，分別在不同的木瓜蛋白酶添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、pH（4、5、6、7、8）、酶解溫度（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）、酶解時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）條件下處理，沸水浴滅酶5 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液中加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇醇沉24 h，4 000 r/min離心15 min，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇清洗2次后用真空冷凍干燥獲得粗多糖，加入10 mL蒸餾水復(fù)溶，測(cè)定每組樣品多糖含量和蛋白含量。以多糖溶液中多糖含量和蛋白含量為考察指標(biāo)來確定最佳酶用量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH值。

（3）三氯乙酸法

配制1%的粗多糖溶液，取5份10mL樣品分別加入TCA使其體積分?jǐn)?shù)為1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，振搖30 min，4℃靜置過夜，去沉淀，測(cè)定上清液蛋白質(zhì)和多糖含量。

1.3.6檢測(cè)分析

（1）蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［11］，以牛血清白蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，以牛血清白蛋白含量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.005 1X-0.001 7（R2=0.995 6），線性范圍為0～70 μg/mL。

（2）多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法［12］，以葡萄糖含量（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=3.398 3X+0.003 6（R2=0.995 8），線性范圍為0.01～0.08 mg/mL。

（3）紫外光譜掃描

取脫蛋白前后的多糖水溶液在波長(zhǎng)200～600 nm范圍進(jìn)行紫外光譜掃描。

（4）脫蛋白效率和多糖損失率計(jì)算

式中：X為脫蛋白效率，%；C前、C后為脫蛋白前后蛋白含量，μg/mL。

式中：Y為多糖損失率，%；C前、C后為脫蛋白前后多糖含量，mg/L。

2　結(jié)果與分析

2.1 Sevag法脫蛋白效果

對(duì)灰樹花胞外粗多糖溶液進(jìn)行5次脫蛋白處理，每次處理后的脫蛋白效率和多糖損失率如圖1所示。

圖1　Sevag法脫蛋白效果Fig.1 Deproteinization efficiency of Sevag method

由圖1可知，隨著脫蛋白次數(shù)增加，脫蛋白效率逐漸升高，處理4次后脫蛋白效率繼續(xù)增加但變化不明顯。脫蛋白處理2次后，多糖損失率曲線斜率增加，多糖損失明顯，在第五次多糖損失達(dá)到最大，由于Sevag試劑中氯仿屬于有機(jī)有毒試劑，應(yīng)盡可能避免多次使用導(dǎo)致多糖損失嚴(yán)重。所以綜合考慮選擇Sevag脫蛋白4次為最佳，此條件下脫蛋白效率為26.46%，多糖損失率為29.45%。結(jié)果表明，Sevag法蛋白脫除率低，這與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道中指出的Sevag法脫蛋白溫和，大部分蛋白仍與多糖結(jié)合未能去除，脫蛋白效果不明顯一致［13-15］。

2.2木瓜蛋白酶脫蛋白效果

2.2.1不同酶用量對(duì)脫蛋白效果的影響

在酶解溫度50℃，pH值為6.0的反應(yīng)體系中，分別選用加酶量為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，水解2 h后，結(jié)果見圖2。由圖2可知，多糖損失率隨酶用量的增加逐漸增大，脫蛋白效率隨酶濃度增大而降低。當(dāng)酶用量為0.1%時(shí)，脫蛋白效率達(dá)到最高，而此時(shí)的多糖損失率最小，這可能是由于超過0.1%的酶用量時(shí)，木瓜蛋白酶不能繼續(xù)酶解底物，溶液中過多的蛋白酶抑制了蛋白酶的活性，故選擇酶用量為0.1%。

圖2　不同酶用量對(duì)脫蛋白效果的影響Fig.2 Effect of different enzyme addition on deproteinization efficiency

2.2.2不同酶解pH值對(duì)脫蛋白效果的影響

圖3　不同酶解pH值對(duì)脫蛋白效果的影響Fig.3 Effect of different enzymolysis pH on deproteinization efficiency

在反應(yīng)溫度50℃，加酶量為0.1%，分別選pH值為4、5、6、7、8的反應(yīng)體系中，水解2 h后，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)pH值為6時(shí)，脫蛋白效率最高，多糖損失率最小。說明此時(shí)酶的活性最高，與底物作用的效果最好。酶的催化過程，pH環(huán)境可直接影響酶的活性，過酸或過堿都會(huì)使酶的活性降低甚至失去活性，故選擇pH 6為最適宜pH。

2.2.3不同酶解時(shí)間對(duì)脫蛋白效果的影響

在反應(yīng)溫度50℃，加酶量為0.1%，pH值為6的反應(yīng)體系，酶解時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）條件下處理，結(jié)果見圖4。由圖4可知，酶解時(shí)間在1.5 h時(shí)脫蛋白效果最好，說明此時(shí)酶的活性最高，而反應(yīng)時(shí)間＞1.5 h后，隨著酶解時(shí)間增加多糖繼續(xù)損失，脫蛋白效率也明顯降低。故選擇1.5 h為最佳酶解時(shí)間。

圖4　不同酶解時(shí)間對(duì)脫蛋白效果的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis time on deproteinization efficiency

2.2.3不同酶解溫度對(duì)脫蛋白效果的影響

圖5　不同酶解溫度對(duì)脫蛋白效果的影響Fig.5 Effect of different enzymolysis temperature on deproteinization efficiency

在加酶量為0.1%，pH值為6的反應(yīng)體系，酶解時(shí)間1.5h，酶解溫度分別為（40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）條件下處理，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)酶解溫度為50℃時(shí)脫蛋白效果最好，盡管酶解溫度高于50℃以后多糖損失率變化不明顯，但繼續(xù)升高酶解溫度脫蛋白效率降低，說明可能由于溫度升高酶活性降低或者部分失活導(dǎo)致脫蛋白效率降低。故選擇50℃為最佳酶解溫度。

綜上所述，木瓜蛋白酶脫去灰樹花胞外多糖蛋白質(zhì)的最佳工藝為酶用量0.1%、酶解pH6、酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度50℃。此條件下，脫蛋白效率為46.86%，多糖損失率為59.91%。酶法脫蛋白效果不佳，這可能與酶的專一性有關(guān)。酶法的多糖損失率高，這與粗多糖中的雜蛋白可能以糖蛋白的形式結(jié)合存在，酶法去蛋白的同時(shí)部分糖蛋白也損失。

2.3三氯乙酸脫蛋白效果

圖6　三氯乙酸法脫蛋白效果Fig.6 Deproteinization efficiency of trichloroacetic acid method

由圖6可知，隨著TCA添加量的增加，脫蛋白效率和多糖損失率均呈上升趨勢(shì)，當(dāng)TCA添加量在3.0%時(shí)脫蛋白效率達(dá)到最大，繼續(xù)增加TCA添加量脫蛋白效率變化不明顯，但多糖損失率升高，為盡可能降低多糖損失，故選擇TCA最佳添加量3.0%，此條件下脫蛋白效率為68.40%，多糖損失率為21.11%。而溶液中殘留的三氯乙酸可在多糖的進(jìn)一步純化過程中通過凝膠柱層析法洗脫。此項(xiàng)研究結(jié)果在其他文獻(xiàn)報(bào)道中得到證實(shí)，王金玲等［16］在樺褐孔菌胞外多糖脫蛋白工藝比較研究中通過對(duì)比Sevag法、酶法、三氯乙酸法三種脫蛋白方法也得出三氯乙酸法脫蛋白效果相對(duì)較好，蛋白質(zhì)脫除率為68.15%，多糖損失率為21.45%。朱美靜等［17］在猴頭多糖脫蛋白方法的研究中對(duì)比了Sevag法和三氯乙酸法，也表明三氯乙酸法效果最好，一次即可使蛋白脫除率達(dá)到80%，且多糖損失率小于Sevag法脫蛋白時(shí)的損失率。

2.4三種脫蛋白方法的效果對(duì)比

由圖7可知，對(duì)比三種不同的脫蛋白方法，從脫蛋白效率方面可以看出脫蛋白效率最高的是三氯乙酸法可達(dá)到68.40%，其次是酶法可達(dá)到46.86%，脫蛋白效率最低的Sevag法，其脫除率為26.46%。從多糖損失率方面可以看出多糖損失率最低的是三氯乙酸法，損失率為21.11%，其次是Sevag法，損失率為29.45%，故綜合考慮應(yīng)選擇三氯乙酸法為最佳脫蛋白方法。

圖7　三種脫蛋白方法效果對(duì)比Fig.7 Comparison of deproteinization efficiency of three deproteinization methods

2.5紫外掃描的定性分析

取經(jīng)TCA法脫蛋白前后的灰樹花胞外粗多糖配制成1 mg/mL的水溶液在200～600 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖8。

圖8　灰樹花胞外多糖三氯乙酸法脫蛋白前（A）后（B）紫外吸收光譜Fig.8 Ultraviolet absorption spectrum of exopolysaccharides from G.frondosabefore（A）and after（B）deproteinization by trichloroacetic acid method

由圖8可知，灰樹花胞外多糖溶液脫蛋白前在波長(zhǎng)260～280 nm范圍內(nèi)有明顯吸收峰，說明其含有蛋白質(zhì)、多肽及核酸；經(jīng)TCA法處理后灰樹花胞外多糖溶液紫外掃描檢測(cè)，其結(jié)果顯示在波長(zhǎng)260～280nm范圍內(nèi)無紫外吸收，說明處理后的粗多糖溶液幾乎不含蛋白質(zhì)和核酸，TCA法可作為灰樹花胞外多糖脫蛋白的有效方法。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以脫蛋白效率和多糖損失率為指標(biāo)對(duì)比了Sevag法、酶法、三氯乙酸法三種脫蛋白方法對(duì)灰樹花胞外多糖的脫蛋白效果，其中三氯乙酸法相對(duì)Sevag法、酶法脫蛋白效果更好，脫蛋白效率為68.40%，多糖損失率為21.11%，TCA最佳添加量為3%，紫外光譜掃描結(jié)果表明TCA法脫蛋白效果明顯。此方法操作簡(jiǎn)單、切實(shí)可行，清除蛋白效果好，適用于灰樹花胞外多糖中蛋白質(zhì)的去除，為灰樹花胞外多糖的進(jìn)一步純化打下了基礎(chǔ)。

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Deproteinization technology of exopolysaccharide fromGrifola frondosa

ZHU Sijie，WU Tianxiang*，YANG Zutao，HUANG Zhong
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using the protein removal rate and polysaccharide loss rate as the evaluation indexes，the effects of deproteinization methods（including Sevag method，enzymatic method and trichloroacetic acid method on deproteinization efficiency of exopolysaccharide fromGrifola frondosawere investigated.The results showed that trichloroacetic acid method was superior to Sevag method and enzymatic method.In the condition of the optimum addition of trichloroacetic acid 3%，the protein removal rate and polysaccharide loss rate was 68.40%and 21.11%，respectively.The results of UV spectroscopy scanning showed thatG.frondosaexopolysaccharide with deproteinization treatment by trichloroacetic acid method had no obvious absorption peak in the range of 200-600 nm，which indicated that the proteins in crude polysaccharide were almost removed.Trichloroacetic acid method could be used as a kind of effective method of deproteinization in purification of extracellular polysaccharide fromG.frondosa.

Grifola frondosa；exopolysaccharide；deproteinization

TQ281

0254-5071（2016）07-0161-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.035

2016-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金（［2014］31460537號(hào)）

朱思潔（1991-）女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

吳天祥（1965-）男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。