中國漢族人群COPD吸煙史患者HHIP基因多態(tài)性與肺癌的相關(guān)性研究*

王海濤　許靖　張舒　肖中　蔡峰　范艷紅　李挺　生淑紅　付佑輝　池峰　周晨

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 上海 200137)

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·論著·

中國漢族人群COPD吸煙史患者HHIP基因多態(tài)性與肺癌的相關(guān)性研究*

王海濤許靖張舒肖中蔡峰范艷紅李挺生淑紅付佑輝池峰周晨

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 上海 200137)

目的探討中國漢族人群COPD吸煙史患者HHIP基因多態(tài)性與發(fā)生肺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。方法以672例COPD患者作為研究對象，依據(jù)病情分為試驗(yàn)組(COPD合并肺癌患者，n=265)和觀察組(單純COPD患者，n=207)，采用連接酶檢測反應(yīng)法對患者HHIP基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420進(jìn)行多態(tài)性分析。對連鎖不平衡性分析及SNP點(diǎn)基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果HHIP基因位點(diǎn)rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420經(jīng)Hardy·Weinberg平衡檢驗(yàn)，均符合H.W平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性。以是否合并肺癌為因變量，各研究位點(diǎn)基因型多態(tài)性為自變量，行Logistic回歸分析(年齡、性別、吸煙狀況進(jìn)行校正)，結(jié)果顯示，HHIP基因位點(diǎn)rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420與COPD患者是否并發(fā)肺癌無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論本研究未發(fā)現(xiàn)HHIP基因的6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與中國漢族COPD患者的肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有明確相關(guān)性。

COPD；HHIP；基因多態(tài)性分析；肺癌；LDR

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)和肺癌是吸煙患者所導(dǎo)致的呼吸道最常見疾病，研究表明：吸煙所產(chǎn)生的尼古丁等有害物質(zhì)及患者的基因易感性是導(dǎo)致這兩種疾病在吸煙人群中高發(fā)的重要原因。近年來有研究表明：伴有吸煙史的COPD患者中有高比例患者會(huì)發(fā)生肺癌：有50%～90%的肺癌患者都有明確的COPD病史，有約40%～77%的COPD患者及15%～25%的肺癌患者有遺傳傾向[1-2]。有學(xué)者認(rèn)為：伴有吸煙史的部分COPD患者及肺癌患者可能存在共同的病理過程和易感基因。且有研究報(bào)道人認(rèn)為HHIP(human hedegehoginteratting protein,HHIP)基因多態(tài)性與COPD患者發(fā)生肺癌相關(guān)[3-5]。但目前研究報(bào)道對象均為歐美人群，無亞洲人群和中國人群的研究報(bào)告，而國外所報(bào)道的研究結(jié)果是否符合亞洲及中國人群的基因特點(diǎn)目前仍不清楚。因此本研究以中國漢族COPD及COPD合并肺癌患者為主要研究對象，對HHIP基因的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，旨在從分子水平上探索HHIP基因多態(tài)性與漢族COPD患者發(fā)生肺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2013年1 月至2015年7月期間在上海市第七人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科及腫瘤科住院治療的慢性阻塞性肺疾病患者672例作為研究資料，所有患者均有明確的吸煙史，吸煙史以包×年為單位，其中男性529例，女性143例，年齡54～70歲，均為漢族，彼此無親緣關(guān)系，依據(jù)病情分為兩組，465例COPD合并肺癌患者(試驗(yàn)組)和207例單側(cè)COPD患者(觀察組)，見表1。

表1　兩組患者一般情況比較

1.2方法

1.2.1患者DNA的提取所有患者均在入院即刻抽取外周血靜脈5mL，采用枸櫞酸管抗凝保存，選取全血基因組DNA提取試劑盒(美國Promega試劑盒)，參照試劑盒說明書，對全血基因組DNA進(jìn)行提取，之后立即于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計(jì)于http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap_B36/(國際人類基因組單倍圖計(jì)劃)網(wǎng)站，參數(shù)設(shè)置：r2>0.8，MAF>0.05，目標(biāo)人群為中國人群；為了反映整個(gè)基因的信息，我們選擇了該基因的所有的6個(gè)標(biāo)簽SNPs：rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420，查閱相關(guān)文獻(xiàn)選擇設(shè)計(jì)HHIP基因引物[6-10]，并交由上海瀚宇生物工程有限公司最后合成，具體序列見表2。

1.2.3連接酶檢測反應(yīng)法分析HHIP基因多態(tài)性其中DNA模板1 μL，10×Buffer 2 μL，MgCl0.6 μL，dNTP 2 μL，上下游引物混合2 μL，Taq酶0.2 μL，補(bǔ)水至20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；65 ℃ 3 min。連接反應(yīng)：PCR產(chǎn)物4 μL，10×Taq DNA、Ligase Buffer 1 μL，TaqDNA Ligase(2 U/μL)0.05 μL，探針(2P)1 μL/條，補(bǔ)H2O至10 μL。連接條件：94 ℃ 15 s，50 ℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。取1 μL延伸產(chǎn)物，加8 μL Loading Buffer，94 ℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀。

表2　相關(guān)SNP位點(diǎn)的引物序列

2　結(jié)果

2.1連鎖不平衡性分析本研究中的HHIP基因位點(diǎn)rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420經(jīng)Hardy·Weinberg平衡檢驗(yàn)，均符合H.W平衡定律(P>0.05)，具有群體代表性，見表3。

表3　兩組患者SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡性分析結(jié)果

2.2SNP點(diǎn)基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)Logistic回歸以是否合并肺癌為因變量，各研究位點(diǎn)基因型多態(tài)性為自變量，行Logistic回歸分析(年齡、性別、吸煙狀況進(jìn)行校正)，結(jié)果顯示，HHIP基因位點(diǎn)rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420與COPD患者是否并發(fā)肺癌無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系(P>0.05)，見表4。

表4各SNP點(diǎn)基因型與肺癌風(fēng)險(xiǎn)Logistic回歸分析結(jié)果

Table 4Logistic regression analysis of SNP genotype and lung cancer risk

SNP位點(diǎn)基因型觀察組(n=465)對照組(n=207)P矯正前矯正后矯正OR值(95%CI)rs1489758AA2041010.6110.5721AC170511.162(0.87～1.352)CC90541.207(0.724～1.578)rs1489759CC1971150.5940.5531CT182551.148(0.889～1.425)TT86371.117(0.751～1.766)rs10519717CC2171210.4891CT155520.4111.368(0.953～1.507)TT93341.462(0.751～1.690)rs13131837CC1891030.1610.1561CT177601.962(0.766～1.209)TT99340.700(0.486～1.009)rs1492820AA2051070.5590.4181AG174521.159(0.925～1.453)GG86481.120(0.751～1.671)rs7689420CC1991090.5450.4651CT181611.126(0.899～1.412)TT85371.113(0.746～1.661)

3　討論

COPD合并肺癌是近年的研究熱點(diǎn)，通過對年輕人、健康吸煙者與COPD和肺癌高危人群的研究，或許可以進(jìn)一步揭示COPD與肺癌的復(fù)雜分子生物學(xué)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)早期癌變過程中新的分子生物學(xué)標(biāo)志物，從分子和細(xì)胞水平篩查出有支氣管癌前病變的高危人群及肺癌患者[10-11]。為肺癌的甲期診斷和治療提供手段，甚至實(shí)現(xiàn)肺癌的預(yù)防，在伴有吸煙史的肺癌及COPD患者中所進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAs)結(jié)果表明：在所發(fā)現(xiàn)有意義的染色體位點(diǎn)中，15q25、4q31及6q31在這2種疾病中出現(xiàn)重疊[12-13]。因此對于吸煙患者，這些重疊染色體位點(diǎn)所編碼的基因則可能成為這2種疾病的共同易感基因。4q31染色體位點(diǎn)編碼的HHIP基因是Hedgehog(Hh)信號通路的關(guān)鍵調(diào)解因子. Hh信號通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅胚胎中，在多種組織中均有表達(dá)，參與組織的發(fā)生、修復(fù)和異常增生，Hh信號通路激活的同時(shí)，可通過Hh蛋白激活HHIP基因的表達(dá)，HHIP蛋白與Hh信號通路中的3個(gè)Hh蛋白(即Shh、Dhh、Ihh)相結(jié)合使其失活，從而反饋抑制Hh信號通路的活性[14-15]。

對于吸煙的COPD患者，煙草產(chǎn)生的尼古丁等有害物質(zhì)可破壞呼吸道上皮的完整性。生理情況下，Hh信號通路的再激活可能與氣道上皮對尼古丁等有害物質(zhì)產(chǎn)生的刺激應(yīng)答有關(guān)，呼吸道上皮受到損傷后，其組織內(nèi)Hh信號通路被再激活，通過調(diào)控干細(xì)胞及祖細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)一步誘導(dǎo)再生的遠(yuǎn)端肺間質(zhì)細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞，從而促進(jìn)組織修復(fù)[16-17]。然而，再激活的Hh信號通路需要通過HHIP基因的負(fù)反饋抑制而正常下調(diào)，其負(fù)反饋機(jī)制一旦出現(xiàn)異常，則會(huì)失去對上述分化過程的正確調(diào)控，導(dǎo)致上皮細(xì)胞生長分化缺陷。Madison等的研究發(fā)現(xiàn)：HHIP基因表達(dá)異常的胎兒期小鼠，其小腸上皮表現(xiàn)出異常的泛平滑肌化；如果類似的變化出現(xiàn)于小氣道，就可能影響氣道平滑肌層的厚度，引起肺組織結(jié)構(gòu)塌陷，從而在一定程度上導(dǎo)致氣流受限[18]。

吸煙是肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，尼古丁等有害物質(zhì)可破壞呼吸道上皮的完整性，通過再激活Hh信號通路來實(shí)現(xiàn)上皮細(xì)胞層修復(fù)?；罨腍h信號通路通過上調(diào)HHIP基因的表達(dá)，負(fù)反饋抑制Hh信號通路的持續(xù)活化。在病理?xiàng)l件下，則可出現(xiàn)Hh信號通路持續(xù)異常激活，導(dǎo)致Shh及Glil、Gli2呈現(xiàn)過度表達(dá)，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞增生失去調(diào)控，增生紊亂甚至惡變，過度活化致惡性腫瘤的發(fā)生[19]。Watkins等在肺癌組織中檢測到Shh和Glil的共表達(dá)及HHIP的表達(dá)下降，缺乏HHIP基因反饋抑制的Hh信號通路持續(xù)活化，維持惡性腫瘤細(xì)胞活性使其不斷增殖、生長[20]。

4　結(jié)論

吸煙是導(dǎo)致肺癌的主要危險(xiǎn)因素，但有約80%的吸煙人群不會(huì)罹患肺癌，同樣對于COPD患者，也有部分病例無并發(fā)肺癌的傾向[1]。那么對于不同遺傳背景的人群，研究其單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide poly morphism，SNP)有助于解釋個(gè)體的表型差異以及不同群體和個(gè)體對疾病的易感性。單核苷酸多態(tài)性是指在基因組內(nèi)某一特定核苷酸位置上存在轉(zhuǎn)換、顛換等變化，SNP的位點(diǎn)極其豐富，幾乎遍及整個(gè)基因組，不同人群中，SNP的分布存在差異。本研究以漢族人群中COPD合并肺癌患者465例為研究對象，同期單純COPD患者207例作為對照， 旨在通過對照設(shè)計(jì)研究探討HHIP基因多態(tài)性與COPD并發(fā)肺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，分別選取6個(gè)MAF大于5%的多態(tài)性位點(diǎn)rs1489758、rs1489759、rs10519717、rs13131837、rs1492820、rs7689420進(jìn)行分型和監(jiān)測。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以上多態(tài)性位點(diǎn)在2組患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因本研究樣本量較少，具有一定的局限性，還有加大樣本量后做進(jìn)一步的研究。

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Association of HHIP gene polymorphism and lung cancer in Chinese Han population with COPD smoking history

WANG Haitao,XU Jing,ZHANG Shu,et al

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheSeventhPeople′sHospitalofShanghai,UniversityofTCM,Shanghai200137,China)

ObjectiveTo investigate the association of HHIP gene (protein Hedgehog-interacting, HHIP) polymorphism with the risk of lung cancer in Chinese Han population with COPD smoking history. Methods672 patients with COPD were used as the research object. According to the condition of the patients, the patients were divided into test group (patients with COPD and lung cancer.n=265) and observation group (patients with unilateral chronic obstructive pulmonary disease (COPD),n=207). By using the ligase detection reaction (ligase detection reaction, LDR), polymorphism of HHIP gene at rs1489758, rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs1492820 and rs7689420 were detected. SNP genotype and lung cancer risk were analyzed. Results HHIP of rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs7689420, rs1492820 and rs1489758 were accord with Hardy·Weinberg equilibrium test (P>0.05), which were representative of the population. Logistic regression analysis showed that HHIP gene polymorphism of rs1489758, rs1489759, rs10519717, rs13131837, rs1492820 and rs7689420 were not related to and COPD patients with lung cancer (P>0.05). ConclusionThere is a clear correlation between the 6 polymorphisms of HHIP gene and the risk of lung cancer in Chinese Han COPD patients.

HHIP; COPD; Gene polymorphism analysis; Lung cancer; LDR

上海市衛(wèi)計(jì)委青年科研項(xiàng)目(20124y115)

許靖,E-mail:xujing311@163.com

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.021

2016-01-06； 編輯： 張文秀)