自然殺傷細(xì)胞與丙型肝炎病毒感染的Huh7.5細(xì)胞體外共培養(yǎng)后的功能變化

胡　姚　張　婷　葉穎子　王曉紅　俞　蕙

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·論著·

自然殺傷細(xì)胞與丙型肝炎病毒感染的Huh7.5細(xì)胞體外共培養(yǎng)后的功能變化

胡姚1張婷2葉穎子1王曉紅1俞蕙1

目的探討體外丙型肝炎病毒(HCV)感染對NK細(xì)胞功能產(chǎn)生的影響及其可能的機制。方法 利用質(zhì)粒JC1-Flag2體外轉(zhuǎn)錄得到的HCV感染性顆粒(HCVcc)以MOI4.8感染Huh7.5細(xì)胞(Huh7.5-HCVcc)，與健康人外周血分離得到的NK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。與Huh7.5-HCVcc細(xì)胞共培養(yǎng)前后，采用ELISA法和MTT比色法分別檢測NK分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平和細(xì)胞殺傷活性，以評估HCV感染對NK細(xì)胞功能的影響。結(jié)果與MOI4.8的Huh7.5-HCVcc細(xì)胞共培養(yǎng)，NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10水平受到抑制，其中IFN-γ在共培養(yǎng)6 h(P<0.001)、9 h(P<0.001)、12 h(P<0.001)受到顯著抑制，TNF-α在共培養(yǎng)6 h(P<0.001)、9 h(P<0.001)、12 h(P=0.001)受到顯著抑制，IL-10在共培養(yǎng)6 h(P<0.001)、9 h(P=0.006)受到顯著抑制；且NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的功能均在共培養(yǎng)6 h受到的抑制效應(yīng)最大，平均抑制率分別為24.1%、20.7%和24.3%。NK細(xì)胞殺傷活性在共培養(yǎng)6 h(P=0.023)受到抑制，平均抑制率為16.6%。結(jié)論在體外與MOI4.8的Huh7.5-HCVcc細(xì)胞共培養(yǎng)，NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-10)和細(xì)胞殺傷功能均受到抑制，且在不同時間點受到的抑制程度不同，提示NK細(xì)胞在HCV感染的不同階段可能起到不同的作用。

自然殺傷細(xì)胞；丙型肝炎病毒；Huh7.5細(xì)胞；共培養(yǎng)

AbstractObjectiveThe numbers, subsets and function of natural killer (NK) cells altered in chronic hepatitis C virus (HCV) infected patients which indicating its association with chronic HCV infection, but the exact mechanisms remain unclear. To explore the functional effect of HCV infection on NK cells in vitro and the possible mechanism behind it.MethodsHuman hepatoma Huh7.5 cells were transfected with genomic RNA from cell culture adapted JC1 genotype 2a HCV strain (Huh7.5-HCVcc) and co-cultured with NK cells isolated from whole peripheral blood of concentrated healthy donors. The functional effect of HCV infection on NK cells was assessed by testing cytokine-secreting and cytotoxicity before and after co-culture.ResultsWhen co-cultrued with Huh7.5-HCV of MOI 4.8, the levels of IFN-γ, TNF-α and IL-10 secreted by NK cells were inhibited. The inhibition of secreting IFN-γ was specially significant at 6(P<0.001), 9(P<0.001) and 12(P=0.001) hours co-cultured with Huh7.5-HCV. The inhibition of secreting TNF-α was specially significant 6 h(P<0.001), 9 h(P<0.001) and 12 h(P=0.001) after co-cultured with Huh7.5-HCVcc. And the significant inhibition of secreting IL-10 appeared at 6 h(P<0.001) and 9 h(P=0.006) after co-cultured with Huh7.5-HCVcc. The strongest cytokine-secreting inhibition appeared 6 h after co-cultured with Huh7.5-HCVcc, the inhibition rate was 24.1%, 20.7% and 24.3%, respectively. The cytotoxicity decreased significantly 6 h after co-cultured with Huh7.5-HCVcc(P=0.023), and the average inhibition rate was 16.6%.ConclusionWhen in vitro cocultrued with Huh7.5-HCVcc of MOI 4.8, the NK cells functions of IFN-γ, TNF-α and IL-10 cytokine-secreting and cytotoxicity were inhibited. The degree of inhibition was different at different time points, which indicated that NK cells may act differently during HCV infection.

在慢性丙肝患者外周血和肝臟中，NK細(xì)胞的細(xì)胞總數(shù)、占外周血淋巴細(xì)胞數(shù)的比例較健康者均有不同程度的下降，NK細(xì)胞亞群也發(fā)生了變化，CD56brightNK細(xì)胞亞群比例呈上升趨勢，CD56dimNK細(xì)胞亞群比例下降[1～4]，且隨著病程進(jìn)展而發(fā)生變化[5]，提示其可能與慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染相關(guān)。但由于HCV不能直接感染NK細(xì)胞，缺乏理想的HCV體外感染模型，目前大多數(shù)研究多為對慢性丙肝患者外周血中NK細(xì)胞數(shù)量、亞群比例和功能等做初步研究，關(guān)于NK細(xì)胞在HCV感染發(fā)病過程中所起作用的具體機制尚不明確，使得在患者體內(nèi)進(jìn)一步的深入研究可操作性不高且不同患者存在個體差異。本研究采用體外構(gòu)建的HCV感染性顆粒(HCVcc) 感染Huh7.5細(xì)胞，建立有效的HCV體外感染系統(tǒng)，并與健康人外周血中分離的NK細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，探討HCV感染對NK細(xì)胞功能的影響，以期建立一個體外穩(wěn)定有效的HCV感染NK細(xì)胞的模型，為體外研究NK細(xì)胞在HCV感染發(fā)病機制中的作用優(yōu)化條件。

1　方法

1.1HCVcc的構(gòu)建HCV全長基因組克隆質(zhì)粒JC1-Flag2(由日本W(wǎng)akita T教授惠贈)經(jīng)體外酶切、線性化、轉(zhuǎn)錄后得到HCV RNA，將其電轉(zhuǎn)入人肝癌來源細(xì)胞Huh7.5，所得HCVcc經(jīng)連續(xù)稀釋、HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A染色(一抗：anti-NS5A-9E10，二抗：goat-anti-mouse-HRP)后，計數(shù)NS5A染色陽性細(xì)胞(即HCV感染的細(xì)胞)，按Reed和Muench方法測定病毒滴度。Huh7.5細(xì)胞株和anti-NS5A-9E10抗體均由美國Rockerfeller大學(xué)Charlies Rice教授惠贈。

1.2HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞各取5×105·mL-1的Huh7.5細(xì)胞2 mL鋪于8塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，12 h細(xì)胞貼壁后，培養(yǎng)板各孔分別加入感染復(fù)數(shù)(MOI)為0(無病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞孔)、0.8、1.6、3.2和4.8的病毒感染細(xì)胞，8 h后用1×PBS洗滌細(xì)胞3次去除殘余病毒后，更換新的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育72 h，采用CELISA法定量檢測病毒蛋白NS3的表達(dá)量。選取轉(zhuǎn)染效率(即NS3表達(dá)量)最高的MOI時的Huh7.5-HCVcc細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)作為實驗組，以MOI為0作為對照組。

1.3HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞后產(chǎn)生病毒應(yīng)激顆粒檢測HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞72 h后，采用HCV的RNA結(jié)合蛋白G3BP1和翻譯相關(guān)蛋白eIF4G，共同標(biāo)記HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞后誘生的病毒應(yīng)激顆粒，在熒光顯微鏡下觀察。

1.4感染HCVcc后Huh7.5細(xì)胞的代謝活動和增殖變化檢測HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞72 h后，采用MTT比色法檢測Huh7.5細(xì)胞對人紅白血病細(xì)胞K562的特異性裂解率，以評估Huh7.5細(xì)胞的代謝活動；分別用DAPI染料和HCV核抗體對Huh7.5細(xì)胞核和HCV核心蛋白進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察Huh7.5細(xì)胞的增殖活動。

1.5NK細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定取健康志愿者(25～30歲，18人次)新鮮外周血30 mL，EDTA抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離得到外周血單個核細(xì)胞(PBMC)。向所得PBMC中加入10 mL D-Hank′s液重懸，用5 mL 苯丙氨酸甲酯(5 mmol·L-1)室溫處理40 min，去除富含溶酶體的單個核巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等，加入rhIL-2調(diào)整終濃度至200 U·mL-1，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。采用BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀對上述分離所得NK細(xì)胞進(jìn)行鑒定和純度檢測。

1.6NK細(xì)胞與HCVcc感染的Huh7.5細(xì)胞共培養(yǎng)的功能變化

1.6.1NK細(xì)胞與Huh7.5-HCVcc共培養(yǎng)取實驗組和對照組感染72 h后的Huh7.5-HCVcc細(xì)胞(濃度為1×10-1·mL-1)和分離培養(yǎng)72 h的NK細(xì)胞(濃度為1×106·mL-1)各1 mL于8塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中共培養(yǎng)，每組2個復(fù)孔。同時設(shè)置單獨NK細(xì)胞培養(yǎng)孔(只加2 mL NK細(xì)胞懸液)和調(diào)零孔(RPMI 1640完全培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)液各1 mL)，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。

1.6.2共培養(yǎng)前后NK細(xì)胞殺傷活性的變化分別于共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24 h收獲各孔細(xì)胞，置于1.5 mL離心管中(每組2管細(xì)胞)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106·mL-1備用。每組取1管細(xì)胞懸液，采用MTT比色法以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞、E/T=40∶1測定NK細(xì)胞殺傷活性。

1.6.3共培養(yǎng)前后NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平變化于共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24 h分別收集各孔培養(yǎng)上清1 mL，用0.22 μm的濾膜過濾后分裝在1.5 mL離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA試劑盒(Abcam公司)檢測上清中IFN-γ、TNF-α和IL-10水平，分別做出各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到IFN-γ、TNF-α和IL-10的可信范圍分別為50～400、62.5～2 000和500～5 000 pg·mL-1。

2　結(jié)果

2.1不同MOI時HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞時病毒蛋白NS3的表達(dá)水平以MOI為0作為對照，MOI為0.8、1.6、3.2和4.8時，病毒蛋白NS3的表達(dá)水平分別為1.7、3.1、4.8和5.5。故以MOI為4.8時Huh7.5-HCVcc細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)作為實驗組。

2.2HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞后產(chǎn)生的病毒應(yīng)激顆粒圖1顯示， 以MOI為0作為對照組 ，MOI為4.8的HCVcc

感染Huh7.5細(xì)胞72 h后，約95%的細(xì)胞均產(chǎn)生典型的HCV應(yīng)激顆粒，該顆粒均同時含有G3BP1和eIF4G這2種HCV應(yīng)激顆粒關(guān)鍵蛋白。

圖1HCV感染Huh7.5細(xì)胞后產(chǎn)生的應(yīng)激顆粒

注A: MOI=0; B: MOI=4.8

2.3感染HCVcc后Huh7.5細(xì)胞的代謝活動和增殖變化圖2顯示，MOI為4.8時Huh7.5細(xì)胞代謝活性受到的抑制最大，抑制率為28.6%。與對照組相比，實驗組Huh7.5細(xì)胞的增殖未受到明顯影響。

圖2HCV感染時Huh7.5細(xì)胞的增殖活動

注A: MOI=0; B: MOI=4.8；藍(lán)色顆粒為DAPI染色，綠色顆粒為HCV核抗體染色

2.4NK細(xì)胞的分離及鑒定圖3顯示，采用流式細(xì)胞儀對NK細(xì)胞進(jìn)行鑒定和純度檢測，結(jié)果顯示所得NK細(xì)胞純度≥90%。

2.5共培養(yǎng)前后NK細(xì)胞殺傷活性的變化如圖4所示，共培養(yǎng)前NK細(xì)胞的殺傷活性最強。隨著共培養(yǎng)時間的延長，兩組NK細(xì)胞的殺傷活性均逐步受到抑制，且實驗組在共培養(yǎng)后任意一個時點均較對照組抑制率更大。由于NK細(xì)胞的衰減，故僅分析 3、6、9、12、15 h這5個時點的數(shù)據(jù)，NK細(xì)胞殺傷活性在共培養(yǎng)6 h(P=0.023)受到抑制，平均抑制率為16.6%。

2.6共培養(yǎng)前后NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平變化由于NK細(xì)胞的衰減，在第18 h及之后的時點的測定值低于可信范圍(圖4)，

圖3NK細(xì)胞流式細(xì)胞圖

注A: 以淋巴細(xì)胞為門; B: 以NK細(xì)胞為門

圖4共培養(yǎng)前后NK細(xì)胞殺傷活性

故僅對共培養(yǎng)3、6、9、12、15 h這5個時點的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖5顯示，以MOI為0作為對照，NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10水平受到Huh7.5-HCVcc(MOI=4.8)的抑制，其中IFN-γ在共培養(yǎng)6 h(P<0.001)、9 h(P<0.001)、12 h(P=0.001)受到顯著抑制，TNF-α在共培養(yǎng)6 h(P<0.001)、9 h(P<0.001)、12 h(P=0.001)受到顯著抑制，IL-10在共培養(yǎng)6 h(P<0.001)、9 h(P=0.006)受到顯著抑制；且NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的功能均在共培養(yǎng)6 h受到的抑制最大，平均抑制率分別為24.1%、20.7%和24.3%。

圖5共培養(yǎng)前后NK細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平

3　討論

本研究以MOI為0作為對照，MOI為4.8時Huh7.5細(xì)胞代謝活性受到一定程度的抑制，但其增殖活動未受到明顯影響。故Huh7.5細(xì)胞可用于建立有效的HCV體外感染細(xì)胞模型。

有報道RNA病毒感染細(xì)胞后會在細(xì)胞中產(chǎn)生病毒應(yīng)激顆粒[6～9]。許多對HCV體外感染的研究中，為確認(rèn)細(xì)胞被HCV感染后誘導(dǎo)產(chǎn)生的應(yīng)激顆粒，多采用G3BP1和TIA1這2種HCV RNA結(jié)合蛋白中的一種或兩種標(biāo)記其應(yīng)激顆粒[10,11]。本研究受張飛等[12]的啟發(fā)，以RNA結(jié)合蛋白G3BP1和翻譯相關(guān)蛋白eIF4G兩種蛋白共同標(biāo)記HCV感染Huh7.5細(xì)胞產(chǎn)生的應(yīng)激顆粒。以MOI為0作為對照，MOI為4.8的HCVcc感染Huh7.5細(xì)胞72 h后，約95%的細(xì)胞產(chǎn)生典型的HCV應(yīng)激顆粒，該顆粒同時含有HCV的RNA結(jié)合蛋白G3BP1和翻譯相關(guān)蛋白eIF4G這2種HCV應(yīng)激顆粒關(guān)鍵蛋白，進(jìn)一步佐證了所得HCVcc能夠有效的感染Huh7.5細(xì)胞，建立HCV體外感染體系。

目前的研究對慢性HCV感染患者外周血NK細(xì)胞的功能缺陷已經(jīng)達(dá)成共識。從單細(xì)胞水平來看，慢性HCV感染患者外周血中NK細(xì)胞的殺傷功能受到的影響不大，甚至有所增強[13]，但總體CD56dimNK細(xì)胞亞群的數(shù)量下降，NK細(xì)胞的總體殺傷功能相對減弱[14～16]，而其分泌細(xì)胞因子功能下降；其機制可能為NK細(xì)胞受到了長期的慢性HCV感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的低劑量IFN-α反復(fù)刺激，導(dǎo)致其殺傷功能活化，抑制IFN-γ信號通路[4]，而IFN-γ是NK細(xì)胞清除HCV的有效方式，這可能是導(dǎo)致HCV感染慢性化的重要機制之一。由于臨床上獲取肝組織相比外周血困難，所以對慢性丙肝患者肝臟中NK細(xì)胞的研究尚不多。初步研究顯示慢性丙肝患者肝臟中的NK細(xì)胞功能減弱[5]。

Holder等[17]用毒株JFH1感染Huh7.5細(xì)胞后與NK細(xì)胞共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的水平受到顯著抑制，而IL-4和IL-10的分泌水平并未受到明顯影響，NK細(xì)胞殺傷活性亦受到抑制，但其研究僅檢測了共培養(yǎng)5 h NK細(xì)胞功能受到的影響，未對共培養(yǎng)后不同時間點進(jìn)行監(jiān)測。本研究中利用健康志愿者NK細(xì)胞在200 U·mL-1的rhIL-2作用下體外培養(yǎng)72 h后，與MOI為4.8的Huh7.5-HCVcc細(xì)胞共培養(yǎng)，對共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)后不同時間點NK細(xì)胞的功能進(jìn)行了監(jiān)測，NK細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平均受到Huh7.5-HCVcc的抑制，IFN-γ和TNF-α均在共培養(yǎng)6、9和12 h受到顯著抑制，IL-10在共培養(yǎng)6和9 h受到顯著抑制；NK細(xì)胞的殺傷活性僅在共培養(yǎng)6 h受到的抑制最為顯著。該結(jié)果與Holder等[17]研究的結(jié)果并不完全一致，可能與實驗所用病毒質(zhì)?？寺〔煌?、共培養(yǎng)監(jiān)測時間點不同等實驗條件有一定關(guān)系。本研究在體外用JC1感染Huh7.5細(xì)胞后與NK細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-10)和細(xì)胞殺傷功能均受到抑制，且在不同時間點受到的抑制程度不同，提示NK細(xì)胞在HCV感染的不同階段可能起到不同的作用，但有關(guān)NK細(xì)胞在HCV感染發(fā)病過程中所起到的作用及其具體機制尚需進(jìn)一步深入研究。

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(本文編輯：張萍)

Functional changes in natural killer cells co-cultured with Huh7.5 cells infected with the hepatitis C virus in vitro

HUYao1,ZHANGTing2,YEYing-zi1,WANGXiao-hong1,YUHui1

(1DepartmentofInfectiousDiseases,TheChildren′sHospital,FudanUniversity,Shanghai201102; 2DepartmentofGastroenterology,ShanghaiChildren′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200040,China)

YU Hui，E-mail:yuhui4756@sina.com.cn

Natural killer cells; Hepatitis C virus; Huh7.5 cells; Co-culture

上海市科委自然科學(xué)基金:12ZR1403500

1 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院感染科上海，201102；2 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科上海，200040

俞蕙，E-mail: yuhui4756@sina.com.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.04.010

2016-05-23

2016-08-06)