超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定雞飼料中黃曲霉毒素B1

□ 葉日金　馮志強(qiáng)　莊俊鈺　陳　茹　廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站　馮志強(qiáng)　莊俊鈺　林　丹　廣東省食品工業(yè)研究所葉日金　林 丹　陳 茹　廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定雞飼料中黃曲霉毒素B1

□ 葉日金馮志強(qiáng)莊俊鈺陳茹廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站馮志強(qiáng)莊俊鈺林丹廣東省食品工業(yè)研究所
葉日金林 丹陳 茹廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室

建立一種用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞飼料中黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法，并對(duì)廣州市售11種雞飼料進(jìn)行了分析。試樣經(jīng)70%甲醇-水溶液超聲提取，黃曲霉毒素B1免疫親和柱凈化；以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm ×1.7 μm）色譜柱分離，電噴霧正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。結(jié)果表明：該方法的黃曲霉毒素B1檢出限為0.5 ng/ mL，線性范圍為0.5000～50.00 ng/ mL，相關(guān)系數(shù)為0.993 7，以空白樣品為基質(zhì)3個(gè)加標(biāo)水平下黃曲霉毒素B1的平均回收率為88.8%～93.5%，RSD＜5.0%。該方法準(zhǔn)確高效，重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)雞飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；黃曲霉毒素B1；雞飼料

真菌毒素是霉菌等真菌在其所污染的食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物[1]。目前已知的真菌毒素有300多種，黃曲霉毒素為最常污染飼料的真菌毒素之一，其中以AFTB1的毒性最強(qiáng)[2-5]。

文獻(xiàn)顯示黃曲霉毒素B1在蛋禽配合飼料中檢出率最高，雛禽配合飼料和蛋禽配合飼料中超標(biāo)最嚴(yán)重，超標(biāo)率分別為11.0%和14.0%[6]。黃曲霉毒素感染能使雛雞機(jī)體免疫機(jī)能下降，生長(zhǎng)受阻，抗體水平降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡[7]。

黃曲霉毒素檢測(cè)主要以薄層色譜和酶聯(lián)免疫法快速檢測(cè)為主，高效液相法及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為輔[8，9]。薄層色譜和酶聯(lián)免疫法方法簡(jiǎn)單、快速，對(duì)人員的要求不高，但準(zhǔn)確性不高，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性等，不能作為最終確證的方法。液相色譜法往往需要柱前衍生或配備專用衍生器，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)不適用于大批量的檢測(cè)。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速、高效、集定性定量于一體，是近年來(lái)黃曲霉毒素研究的主要方向[10]，并且已經(jīng)應(yīng)用到檢測(cè)當(dāng)中。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（三重四級(jí)桿）針對(duì)雞飼料中黃曲霉毒素B1檢測(cè)的研究。

本研究運(yùn)用超高效液相-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定雞飼料中黃曲霉毒素B1。樣品經(jīng)70%甲醇水溶液提取、免疫親和柱凈化，正離子模式下使用乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，采用Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱分離，外標(biāo)法定量。該方法準(zhǔn)確高效，重現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)雞飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品

收集廣州市售11種雞飼料（分別為肉小雞料、肉大雞料、肉中雞料、快大型黃雞小雞料、快大型黃雞中雞料、快大型黃雞大雞料、快大型雞小雞料、快大型雞大雞料、育肥雞料和種雞料）共24批次。

1.1.2主要儀器與試劑

Waters H-class Xevo TQD液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ESI源)；色譜柱：Waters Acquity UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×50 mm ×1.7 μm)。萬(wàn)分之一天平AG204，KQ-500DE型超聲波清洗，日立CF15RXⅡ離心機(jī)。

AFTB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，25.00 μg/mL，廣州泛宏貿(mào)易有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，飛世爾（Fisher）公司；甲酸，色譜純，上海安譜科學(xué)儀器公司；黃曲霉毒素免疫親和柱，3 mL，BIOSTEST公司；50 mMPBS溶液。

1.2方法

1.2.1樣品制備

稱取樣品20 g于50 mL比色管中，加入100 mL 70%甲醇水，渦旋混合、超聲20 min，10 000 r/min，離心5 min，收集上清液。

1.2.2樣品純化

取5 mL樣品提取液，加入20 mL PBS（pH=7.4）溶液，渦旋混勻1 min，將試液以1 mL/min的流速全部通過(guò)免疫親和柱，加入50 mM PBS/甲醇，90/10 V/V以3 mL/min的流速淋洗免疫親和柱去掉雜質(zhì)。準(zhǔn)確加入1 mL甲醇，等待30 s，收集樣品洗脫液，用微孔過(guò)濾膜（0.22 μm）過(guò)濾后供進(jìn)樣。

1.2.3空白基質(zhì)溶液的配置

分別稱取與待測(cè)樣品基質(zhì)相同且不含待測(cè)成分的樣品，按1.2.1及1.2.2制備方法操作，制備空白基質(zhì)溶液。

1.2.4儀器條件

液相條件：色譜柱：Waters Acquity UPLC?RBEH C18柱(2.1 mm×50 mm× 1.7 μm)；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃；流速0.40 mL/min；流動(dòng)相：0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧源ESI+，脫溶劑氣溫度550 ℃，脫溶劑氣流速1000 L/min，錐孔氣50 L/min，毛細(xì)管電壓2.50 kV。黃曲霉毒素B1MRM 檢測(cè)的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析中常用的兩大流動(dòng)相體系（甲醇-水和乙腈-水）對(duì)黃曲霉毒素色譜的影響。同時(shí)由于黃曲霉毒素B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)诮Y(jié)構(gòu)上更容易得到質(zhì)子，因此，實(shí)驗(yàn)選擇正離子模式。實(shí)驗(yàn)表明：在正離子模式下（流動(dòng)相中含0.1%甲酸），甲醇在色譜分離系統(tǒng)效果較乙腈要好，但其離子化程度受到較大的抑制，乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的離子化程度高，響應(yīng)值、靈敏度等均比甲醇要好。因此本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，梯度洗脫。

2.2樣品前處理的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別研究了甲醇-水系列（體積分?jǐn)?shù)分別為35%、60%、70%、84%和90%）和乙腈系列（體積分?jǐn)?shù)分別為35%、、60%、70%、84%和90%）作為提取劑進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇體積分?jǐn)?shù)增加至70%時(shí)黃曲霉毒素B1提取率不再增加，乙腈體積分?jǐn)?shù)84%提取效率最好，但考慮到有機(jī)相比例太高會(huì)影響免疫親和柱的活性，且甲醇的毒性相對(duì)乙腈較低，價(jià)格亦相對(duì)便宜，因此選擇70%的甲醇水溶液為提取劑。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

移取適量AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相稀釋定容，得到濃度為100.0 ng/ mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用液。并移取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，用空白基質(zhì)溶液配制成濃度分別為0.500 0、1.000、5.000、10.00、20.00 ng/mL和50.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線供LC-MS /MS檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)工作液峰面積y為縱坐標(biāo)，濃度x(ng/ mL)為橫坐，標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法檢出限(LOD)依3倍基線噪音S/N=3所得。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表1　以乙腈和0.1%甲酸-水溶液為流動(dòng)相的梯度洗脫程序表

表2　黃曲霉毒素B1MRM質(zhì)譜采集參數(shù)

表3　黃曲霉毒素B1的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表4　黃曲霉毒素B1的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

在空白樣品中加入0.5 ng/mL黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品，依據(jù)黃曲霉毒素B1定量子離子圖響應(yīng)值的信噪比為4 147，方法檢出限滿足檢測(cè)要求。

圖1　黃曲霉毒素的MRM色譜圖（添加水平為0.5 ng/mL）

2.4方法的回收率及精密度

在空白樣品中，分別向其中分別添加1.000 ng/mL、10.00 ng/mL、20.00ng/mL 3個(gè)水平的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)條件平行處理6次，分別測(cè)定樣品添加標(biāo)準(zhǔn)品后的濃度，根據(jù)每次測(cè)的實(shí)際值計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5實(shí)際樣品的檢測(cè)

本方法收集了24批次廣州市售不同類別的雞配合飼料樣品，對(duì)其中的黃曲霉毒素B1含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，24份雞配合飼料有23份黃曲霉毒素B1的含量低于本法檢出限（0.5 ng/mL），1份雞飼料(肉中雞料3)有檢出微量黃曲霉毒素B1、含量為0.70 ng/mL。陽(yáng)性樣品見(jiàn)圖2（B）。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)溶液（A，1.000 ng/mL）和陽(yáng)性樣品（B）中黃曲霉毒素B1的MRM譜圖

3　小結(jié)

本研究建立的運(yùn)用超高效液相分離結(jié)合三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)雞飼料中黃曲霉毒素B1，可作為今后進(jìn)一步研究雞飼料中黃曲霉毒素B1污染情況的監(jiān)測(cè)以及雞飼料原料及其配方的比例與真菌毒素產(chǎn)生的關(guān)系和規(guī)律提供理論依據(jù)。

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廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：201508020084）。