一種檢測動物組織中呋喃西林代謝物快速檢測檢測卡的研制

□ 扶　勝　楊　梅　鄧傳玉　羅雪粵　貴州勤邦食品安全科學技術有限公司

一種檢測動物組織中呋喃西林代謝物快速檢測檢測卡的研制

□ 扶勝楊梅鄧傳玉羅雪粵貴州勤邦食品安全科學技術有限公司

利用膠體金免疫層析技術研制一種快速檢測動物組織中呋喃西林代謝物的膠體金試紙卡，檢測卡包含了膠體金標記物的制備，樣品墊和反應膜的制備，檢測卡的組裝等研究步驟，所研制出的呋喃西林代謝物膠體金快速檢測卡，對動物組織的檢出限達到0.5 μg/kg，檢測時間為10 min，假陽性率小于5%，假陰性率為0%，該試紙卡能夠準確、可靠。簡便地檢測動物組織中呋喃西林代謝物，適合大量樣品的現(xiàn)場檢測。

呋喃西林代謝物；快速檢測；膠體金檢測卡；動物組織

呋喃西林（Nitrofurazone）是硝基呋喃類藥物的一種，是一種人工合成的具有5-硝基呋喃結構的廣譜抗菌藥，呋喃西林以及其代謝物均具有很強的毒性和致癌作用，已引起世界各國的高度重視[1]。我國農業(yè)部發(fā)布的第193號公告中規(guī)定呋喃唑酮和呋喃它酮禁止所有用途，在所有食品動物中禁用[2]，目前歐盟對硝基呋喃類代謝物的檢測方法靈敏度規(guī)定為1 μg/kg[3]。目前呋喃西林及其代謝物的檢測方法主要有免疫檢測法和理化檢測法[4,5]，如液相色譜-質譜法[6,7]、紫外分光光度法[8,9]、液質聯(lián)用技術[10,11]等，儀器方法前處理復雜、繁瑣、成本高和操作技術要求高，膠體金免疫層析技術（GICA）的快速診斷試紙條具有靈敏度高、檢出限低、特異性強和穩(wěn)定性好，并且簡便快速、無需檢測儀器，且成本低、無污染的優(yōu)點，適用于現(xiàn)場大規(guī)模地對動物源食品中呋喃西林代謝物殘留的篩檢，也適用于食品生產加工企業(yè)進行自檢。

呋喃西林在動物體內代謝速度較快，代謝物與蛋白結合成為結合態(tài)，在弱酸條件下可以從蛋白質中釋放出來，因此當含有呋喃西林抗生素殘留的產品被人食用后，SEM可以在胃酸作用下從蛋白質中釋放而嚴重危害人體健康。但由于該藥物價格低廉和治療效果好[12]，仍然被部分國家使用，中國進口的禽肉和水產品中陸續(xù)檢測出呋喃類藥物殘留，從2003—2006年，歐盟共發(fā)布200次有關硝基呋喃類藥物殘留警報，其中約47%為呋喃西林代謝物殘留[13]，本實驗研究制備一種快速檢測卡，擬建立快速、簡便、準確和靈敏度高的方法檢測水產養(yǎng)殖中殘留的呋喃西林代謝物。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

魚肉、蝦肉、豬肉和雞肉當地市場購買；呋喃西林代謝物、牛血清白蛋白（BSA）、2-硝基苯甲醛，美國Sigma公司；檸檬酸三鈉、氯金酸，美國Sigma公司；硝酸纖維素膜、樣品吸收墊、吸水墊和PVC背板，江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司；乙酸乙酯、甲醇、正己烷、三水合磷酸氫二鉀、碳酸鉀、氫氧化鈉和三氯乙酸，國藥集團化學試劑有限公司，分析純；呋喃西林代謝物單克隆抗體、抗原，自制；8010S勻漿機，上海斯伯明儀器設備有限公司；HGC-12D氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；XH-B漩渦混合器，上海皓莊儀器有限公司；Isoflow劃 膜 儀，Imagene Technology INC；微量移液器（單道20～200 μL、100～1000 μL），美國Thermo公司，2000SBL電子天平，美國Setra公司；UV7502PC紫外可見分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司；DHP-600生化培養(yǎng)箱，臺灣全信電子儀器有限公司；10 L/H實驗室超純水機，沃爾奇環(huán)保股份有限公司；08-2T電熱套攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；CT300數控切條機，上海金標生物科技有限公司；Z32HK-臺式高速離心機，德國賀默公司。

1.2實驗方法

1.2.1膠體金制備與質量鑒定

制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原法。量取297 mL的四蒸水裝入500 mL的錐形燒瓶，置于磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，加入1%氯金酸溶液3 mL，待溶液再次沸騰后迅速一次性加入6.0 mL檸檬酸三鈉溶液，氯金酸溶液由灰色逐漸變?yōu)榫萍t色，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱10 min，待溶液冷卻后，4℃保存[14]。制備好的膠體金無沉淀和漂浮物，并且外觀純凈、透亮。通過分光光度計掃描，獲得膠體金可見光吸收光譜，測定最大吸收波長（λmax），并在透射電鏡下觀察膠體金顆粒的均一程度，測量金顆粒粒徑[15]。

1.2.2膠體金標記抗體制備

取5 mL制備好的膠體金，加入150 μL 0.02 mol/L K2CO3，渦動混勻，再加入10 μL呋喃西林代謝物單克隆抗體，渦動混勻，放置20 min，加入10% BSA 150 μL，放置10 min。13 000 r/min、2 ℃離心30 min，棄去上清液，用金復溶液0.5 mL溶解金，得到的呋喃西林代謝物單克隆抗體-膠體金標記物溶液。

1.2.3樣品墊的處理

配置好含牛血清白蛋白濃度為0.4%、pH為7.5、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，將樣品吸收墊放置于配好的液體3 s，拿出后放置2 h，然后再放置在37 ℃烘2 h。

1.2.4C、T的包被

按19∶1的體積比用含2%乙醇的0.02 mol/L pH7.2的PBS稀釋呋喃西林代謝物至16 μg/mL，按79∶1的體積比用含2%乙醇的0.02 mol/L pH7.2的PBS稀釋羊抗鼠IgG抗體到50 μg/mL，用Isoflow劃膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的T線和C線上，包被量為1.0 μL/cm。包被好C、T線后將板放置于37 ℃條件下干燥2 h。

1.2.5檢測卡組裝

將制備好的樣品墊、金標墊、反應膜、吸水墊依次按圖1所示粘貼在所述PVC板上（見圖1），再將組裝好的試紙固定在卡殼上。

圖1　膠體金檢測卡結構圖

1.2.6樣本前處理方法

稱取2.0（±0.05） g均質樣本至15 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL水，再加入100 μL衍生化試劑，上下振搖至樣本混勻；將離心管放置于80 ℃水浴鍋中30 min；取出離心管，加入0.6 mL 1 mol/L HCl、0.5 mL 1 mol/L NaOH，蓋上離心管蓋，將樣本搖勻，加入5 mL乙酸乙酯，蓋上離心管蓋，上下翻轉離心管20～25 次(切勿渦旋震蕩)；3 000 rpm以上，室溫離心 5 min；取上層3 mL至10 mL玻璃試管或15 mL聚苯乙烯離心管中，于50～60 ℃水浴氮氣流下吹干（或空氣流下吹干）；加入0.8 mL正已烷，用渦旋儀渦動1 min，再加入0.5 mL樣本復溶液，渦動5～6 s充分混勻。取下層用于分析。

1.2.7檢測卡檢測方法

檢測卡平放，取待檢樣品70 μL加入檢測卡加樣孔中，液體流動開始計時，5～10 min觀察結果。T線顯色強于C線顯色或與C線顯色無明顯差異，表示組織樣本中不含有呋喃西林代謝物，T線顯色明顯弱于C線顯色或T線不顯色，表示組織樣本中呋喃西林代謝物濃度等于或高于檢出限，未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或檢測卡已失效。

1.2.8動物組織中呋喃西林代謝物的測定

通過確定試紙卡的穩(wěn)定性、對相似物質交叉反應、檢測卡的檢出限、檢測時的假陽性及假陰性最終實現(xiàn)產品對呋喃西林代謝物的檢測。

1.2.8.1檢測卡檢出限的測定

在各種樣本中添加不同濃度呋喃西林代謝物，將處理好的樣品液分別滴加到組裝好的檢測卡的加樣孔中。5～10 min后目測判斷結果。檢出限定義為能與陰性對照的檢測卡的檢測線有明顯顏色差別的呋喃西林代謝物的最小濃度。

1.2.8.2檢測卡的假陽性率、假陰性率測定

通過測試各種陰性樣本至少30份，用至少3個批次的檢測卡進行檢測，和在各種樣本中添加0.5 μg/kg高標，用至少3個批次的檢測卡進行檢測，根據最終檢測結果計算出假陽性比例與假陽性比例。

1.2.8.3特異性實驗

用檢測卡分別將不同濃度（1、100、500 ppb）的硝基呋喃類代謝物CPAMOZ、CPAOZ、CPAHD滴加到試紙卡加樣孔中，判斷有無交叉反應。實驗結果均為陰性，表明膠體金層析試紙具有較高的特異性。

1.2.8.4保存實驗

將制備好的試紙卡在不同溫度（一般是4、25、37 ℃）中保存，通過不同時間測試陰性樣本和陽性樣本，根據檢測結果的穩(wěn)定性及檢測卡顏色情況判定檢測卡的穩(wěn)定性及穩(wěn)定時間。

2　結果與分析

2.1膠體金質量鑒定

將制備好的膠體金溶液在400～600 nm進行紫外掃描，掃描后得出最大吸收峰波長，通過最大吸收峰的峰寬和峰形，可知在523.0 nm處有最大吸收，用透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布均勻，金顆粒的粒徑為20 nm左右（如圖2所示）。膠體金電鏡掃描圖，如圖3所示。

2.2檢出限分析

按著1.2.6前處理方法做空白樣本添加呋喃西林代謝物濃度為0、0.25、0.5 μg/kg和1 μg/kg；按照1.2.7檢測步驟進行檢測，對添加的濃度分別測試3次，確定檢出限。T線顯色比C線顯色深或顯色一致判定為陰性，檢測線明顯弱于質控線判定為陽性，檢測結果如圖4所示，試驗結果見表1。

通過上表測試得出，該檢測卡對各種組織樣本中呋喃西林代謝物的檢出限為0.5 μg/kg。

2.3特異分析

用復溶液配置濃度為100 μg/kg的呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃它酮代謝物，滴2～3滴于加樣孔，5～10 min觀察結果發(fā)現(xiàn)C、T線顏色一致都為陰性，說明該檢測卡特異性較好。

2.4假陽性率、假陰性率分析

檢測卡假陽性率為0%；所檢陽性魚肉、蝦肉、豬肉、雞肉各30份樣品的檢測結果都是陽性，該檢測卡的假陰性率為0%，測試30份蝦肉樣品中有1份為陽性，其余都為陰性，說明檢測卡假陽性小于5%（見表2）。

2.5穩(wěn)定性試驗

圖2　膠體金紫外可見光分光光度計掃描圖

圖3　膠體金電鏡掃描圖（×100 000）

圖4　檢測卡檢出限試驗結果（蝦肉樣本）

表1　檢測卡檢測測結果

表2　檢測卡假陽性率、假陰性率測定結果

檢測卡在4、25、37 ℃環(huán)境下放置12個月，每個月進行1次實驗驗證，陰性陽性都較正常，超過12個月后，C線顏色有變淺現(xiàn)象，陽性樣本有梯度但不明顯，最后確定檢測卡在常溫下保存12個月正常，產品有效期為12個月。

3　結論

膠體金通過檸檬酸三鈉還原法制備后，用紫外掃描和透射電鏡觀察金顆粒大小及均一性，測定直徑為23 nm。用制備的膠體金標記呋喃西林代謝物單克隆抗體，通過優(yōu)化穩(wěn)定性、檢出限、特異性、假陽性、假陰性最終確定膠體金免疫層析法。通過實驗最終確定呋喃西林代謝物檢測魚肉、蝦肉、豬肉、雞肉樣本中的檢出限為0.5 μg/kg，與其他藥物沒有交叉反應，假陽性小于5%，達到要求，試紙卡通過目測即可判定結果。方法準確可靠，可用于現(xiàn)場快速篩查。在今后的獸藥殘留檢測領域將會起著越來越重要的作用，并會作為工商質檢、食品加工企業(yè)、出入境單位快速篩選的工具。

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扶勝（1983-），男，貴州興義人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢測。