液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷方法的建立

□ 鄭　鈺　廖建萌　黃國(guó)方　湛江市食品藥品檢驗(yàn)所　邢　華　湛江市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所　羅　林　湛江市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷方法的建立

□ 鄭鈺廖建萌黃國(guó)方湛江市食品藥品檢驗(yàn)所邢華湛江市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所羅林湛江市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局

建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷的方法，采用ESI負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定蘆薈苷的分子離子峰為417.2，定量離子為297.2，定性離子為268.2和250.2；對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷的線性R=0.999 4，出限為1.0 nμg/L，精密度RSD≤3%，是一種理想的檢測(cè)方法，為蘆薈制品質(zhì)量檢測(cè)、食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、合成分析研究、代謝研究提供數(shù)據(jù)及技術(shù)手段。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；蘆薈苷；ESI負(fù)離子模式

1　蘆薈苷概述

蘆薈苷屬蒽醌類(lèi)化合物，是蘆薈中的有機(jī)活性成分。據(jù)醫(yī)學(xué)報(bào)導(dǎo)，蘆薈苷有利于腸道內(nèi)廢物排除，研究發(fā)現(xiàn)蘆薈苷具有殺菌、消炎解毒、促進(jìn)傷口愈合等作用[3]。如今國(guó)家已正式將蘆薈列入保健食品原料可利用的中藥名單中，蘆薈原料的安全評(píng)價(jià)列入食品安全專(zhuān)項(xiàng)研究課題中。

現(xiàn)有的檢測(cè)蘆薈苷方法有分光光度法，高效液相色譜紫外檢測(cè)法（HPLC-UV）、液質(zhì)聯(lián)用、薄層掃描法等方法。目前液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定蘆薈飲料中的蘆薈苷未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文將用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈飲料中的蘆薈苷，為產(chǎn)品的檢測(cè)方法提供數(shù)據(jù)及技術(shù)手段支持。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器及試劑

LCMS-8030液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）、C18液相色譜柱（日本島津公司）、XS205電子分析天平（METTELER TOLEDO）。

甲醇:高效液相色譜純（天津大茂化學(xué)試劑廠）。乙腈：高效液相色譜純（天津大茂化學(xué)試劑廠）。氨水、乙酸銨：優(yōu)級(jí)純（廣州化學(xué)試劑廠）。

2.2實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

2.2.1色譜條件

色譜柱：C18，150 mm×2.1 mm，5 μm。柱溫：30℃。流動(dòng)相：20%甲醇-80% 5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%氨水）。流量：300.0 μL/min。進(jìn)樣體積：10.0 mL。運(yùn)行時(shí)間：10 min。

2.2.2質(zhì)譜條件

檢測(cè)模式：ESI負(fù)離子，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。電噴霧電壓（IS）：4 500 V。離子傳輸溫度（TEM）：400℃。霧化氣流量：3.0 L/min。干燥氣流量12.0 L/min。

2.3結(jié)果與討論

2.3.1分子離子峰的確定

將質(zhì)譜儀調(diào)整到最佳狀態(tài)，配制1.0 μg/mL的蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 mL，分別在ESI正、ESI負(fù)離子的模式下進(jìn)行全掃描監(jiān)測(cè)，掃描范圍100 ~500 u，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，419.2 u和436.2 u的響應(yīng)較高。4417.2 u為負(fù)離子模式下[M-H]-分子離子峰。考慮到正離子模式下蘆薈苷形成分子離子峰并不唯一，且正離子模式受到的干擾多使測(cè)定的靈敏度及穩(wěn)定性下降，負(fù)離子模式測(cè)定蘆薈苷含量的靈敏度更高，更穩(wěn)定，因此選擇負(fù)離子模式，417.2 u作為蘆薈苷測(cè)定的母離子。

2.3.2二級(jí)質(zhì)譜

配制1.0 μg/mL的蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 mL，掃描模式為Q1全掃描-質(zhì)子掃描，能量（CE）范圍為10 ev~50 ev，結(jié)果如圖1所示。圖1中，蘆薈苷分子離子417.2產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜較穩(wěn)定的有297.2、268.2和250.2，其中相對(duì)豐度最高的為297.2，因此確定297.2作為蘆薈苷測(cè)定的定量離子，268.2和250.2作為定性參考離子。

圖1　蘆薈苷測(cè)定的定量離子及定性參考離子

2.3.3離子傳輸及碰撞能量的優(yōu)化

碰撞區(qū)發(fā)生在Q2，合適的碰撞能量能夠產(chǎn)生穩(wěn)定，相對(duì)豐度高的定量及定性離子。配制1.0 μg/mL的蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10 μL，儀器自動(dòng)優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1中，Q1主要對(duì)417.2傳輸，有相同的預(yù)偏轉(zhuǎn)電壓均為20 v；Q3傳輸?shù)念A(yù)偏轉(zhuǎn)電壓分別為21 v、19 v和30 v。

圖2　蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1　蘆薈苷測(cè)定LC-MS/MS質(zhì)譜檢測(cè)條件

表2　蘆薈苷相關(guān)系數(shù)表

表3　精密度表

表4　定量限以及信噪比

圖3　蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液離子流圖

圖4　蘆薈苷樣品溶液離子流圖

2.3.4線性關(guān)系

配制的蘆薈苷濃度為0.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL的 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以峰面積計(jì)數(shù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖2所示，相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。相關(guān)系數(shù)為0.999 3，可以看出液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷在1~100 ng/mL內(nèi)線性良好。

2.3.5精密度試驗(yàn)

重復(fù)取樣11次，又在此后的10日內(nèi)每日進(jìn)樣1次，得到日內(nèi)與日間精密度見(jiàn)表3。由表3可知，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷精密度RSD%<3.0%，能夠滿(mǎn)足分析要求（RSD%<5.0%）。

2.3.6最低檢出限

當(dāng)濃度為1.0 ng/mL時(shí)有良好的響應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表4，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷的檢出限為1.0 ng/mL。

2.4樣品的測(cè)定

飲料樣品在10 000 r/min下均質(zhì)1分鐘，然后稱(chēng)取5.0 g，加甲醇約45 mL,超聲提取10分鐘，冷卻到室溫后定容50 mL,過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

蘆薈苷主要有兩種同分異構(gòu)體，在實(shí)際樣品的測(cè)定時(shí)，可以改變流動(dòng)相的比例將兩種同分異構(gòu)體在同一時(shí)間出峰，如圖3所示。要將兩個(gè)峰加和，如圖4所示。

3　結(jié)論

對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蘆薈苷的線性關(guān)系R=0.999 3，出限為1.0 ng/mL,精密度RSD≤3%,是一種理想的檢測(cè)方法，為蘆薈苷的產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)、食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、合成分析研究、代謝研究提供技術(shù)數(shù)據(jù)及技術(shù)手段。

［1］王富麗.蘆薈的研究與臨床應(yīng)用［J］.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2001（1）：55-56.

［2］王勇，王宗偉，黃兆勝，等.蘆薈多糖對(duì)腫瘤化療的增效和減毒作用研究［J］.中藥新藥和臨床藥理，2002，13（2）：89～91.

［3］吳鋒，趙喜，薛華，等.蘆薈靈芝膠囊的潤(rùn)腸通便作用［J］.交通醫(yī)學(xué)，2008，22（4）.

備注：邢華為第二作者