物理處理玉米皮渣對(duì)酶法提取阿魏酰低聚糖的影響

解春艷，游雪嬌，侯曉強(qiáng)，吳智艷，*，曹 戈，段秀霞（.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)院，河北廊坊065000；2.河北省高校食藥用真菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北廊坊065000；.廣東省微生物研究所，廣東廣州50000）

物理處理玉米皮渣對(duì)酶法提取阿魏酰低聚糖的影響

解春艷1，2，游雪嬌3，侯曉強(qiáng)1，2，吳智艷1，2，*，曹 戈1，段秀霞1
（1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)院，河北廊坊065000；2.河北省高校食藥用真菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北廊坊065000；3.廣東省微生物研究所，廣東廣州510000）

以玉米皮渣為原料，考察物理處理對(duì)其水解獲得阿魏酰低聚糖產(chǎn)量的影響。通過(guò)測(cè)定不同方法處理前后玉米皮渣細(xì)胞壁組成和其結(jié)構(gòu)變化及阿魏酰低聚糖（Feruloyl oligosaccharides，F(xiàn)Os）產(chǎn)量關(guān)系，探討物理處理影響FOs生成的原因。結(jié)果表明：高壓蒸煮處理使酶解玉米皮渣生成FOs產(chǎn)量提高了1.5倍，原因是高壓蒸煮改變了玉米皮渣細(xì)胞壁的組成，其中纖維素和果膠質(zhì)得以釋放，增加了纖維素酶和木聚糖酶與底物的接觸幾率；微波和膨化處理均使玉米皮結(jié)構(gòu)裂解，F(xiàn)Os產(chǎn)量無(wú)顯著變化。

玉米皮渣，阿魏酰低聚糖，物理處理，酶解

阿魏酰低聚糖（Feruloyl oligosaccharides，F(xiàn)Os）是阿魏酸（Ferulic acid，F(xiàn)A）與糖的羥基通過(guò)酯鍵連接成的一類(lèi)重要的功能性低聚糖［1］，具有增強(qiáng)免疫力的功效，對(duì)包括癌癥在內(nèi)各種疾病的預(yù)防具有很好的功效［1］，具有較強(qiáng)的抗氧化活性［2］，對(duì)腸道雙歧桿菌增殖作用顯著［3］，可改善腸道菌群、預(yù)防腸癌。目前，國(guó)內(nèi)外阿魏酰低聚糖的研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室水平，尚未有該低聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)，故其發(fā)展空間巨大。

報(bào)道稱(chēng)FOs廣泛存在于禾本科植物細(xì)胞壁［4］。玉米是禾本科植物的一種，是我國(guó)種植面積最大的糧食作物之一。玉米淀粉加工業(yè)產(chǎn)生大量玉米皮渣工業(yè)副產(chǎn)物，尚未得到有效利用［5］。玉米皮渣中含有膳食纖維（52.6%～86.0%）、蛋白質(zhì)（5.0%～13.0%）、淀粉（4.0%～20.0%）和酚類(lèi)化合物（2.0%～5.5%）等［5］。玉米

皮渣總酚類(lèi)化合物中，阿魏酸及其聚合物占90%以上［6］。FOs是FA的羧基與糖羥基通過(guò)酯鍵連接而成的一類(lèi)低聚糖，采用化學(xué)法、酶法和微生物轉(zhuǎn)化法均可獲得，目前，常用酶法制備［7］。然而，在玉米種皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，半纖維素與纖維素以及半纖維素與木質(zhì)素的連接，是制約外源酶酶解禾本科植物組織的主要原因［8-9］。本研究擬通過(guò)物理方法對(duì)玉米皮渣進(jìn)行處理，以期改變玉米皮渣緊密連接的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)外源酶的酶解，提高FOs生成量。研究結(jié)果將有助于促進(jìn)FOs的工業(yè)化進(jìn)程，提高玉米皮渣的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米皮渣 購(gòu)自河北省滄州市淀粉加工廠；木聚糖酶、纖維素酶 由寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供，酶活分別為600萬(wàn)ug/min·g和140萬(wàn)ug/min·g；NaOH、濃HCl、無(wú)水乙醇、磷酸等 為國(guó)產(chǎn)分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈 為國(guó)產(chǎn)色譜級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司；Hitachi S-3000N掃描式電子顯微鏡、Hei-VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；安捷倫1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Milli-Q純水機(jī) 美國(guó)Merck Millipore公司；MLS-3750全自動(dòng)立式滅菌鍋 日本Sanyo公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 常州朗越儀器制造有限公司；P70D20TP-C6微波爐 廣東格蘭仕集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同物理方法處理玉米皮渣 以玉米皮渣為原料，分別對(duì)其進(jìn)行高壓蒸煮、膨化和微波處理。

1.2.1.1 高壓蒸煮處理 取200 g玉米皮渣，添加100 mL蒸餾水，置于500 mL三角瓶中，于高壓滅菌鍋中，采用121℃下處理20 min，溫度降至70℃時(shí)，取出，于60℃烘箱中烘干待用。

1.2.1.2 膨化處理 取200 g玉米皮渣，置于小型爆米花機(jī)，加熱并進(jìn)行瞬間膨化處理，膨化時(shí)壓力為10 MPa。

1.2.1.3 微波處理 取200 g玉米皮渣置于家用微波爐中進(jìn)行微波處理，采用中高火，微波功率為525 W，微波處理時(shí)間為5 min。

1.2.2 酶解玉米皮渣制備FOs 按上述方法對(duì)玉米皮渣分別進(jìn)行高壓蒸煮、膨化和微波處理，然后烘干、粉碎后過(guò)80目篩，同時(shí)取已過(guò)80目篩的未處理樣品，分別置于50 mL三角瓶中，按料液比1∶10比例添加磷酸緩沖溶液（50 mmol/L，pH為5.0），并添加纖維素酶（10 g/L）和木聚糖酶（10 g/L），于60℃酶解1 h，95℃滅酶10 min，4000 r/min離心15 min，分別測(cè)定上清液中FOs含量［10］。

1.2.3 玉米皮渣電鏡掃描 對(duì)不同方式處理過(guò)的玉米皮渣進(jìn)行電子顯微鏡掃描（scanning electron microscope，SEM），加速電壓15.0 kV，放大倍數(shù)1500×，通過(guò)電鏡掃描圖觀察物理處理前后玉米皮渣原料縱橫切面形態(tài)的變化。

1.2.4 玉米皮渣細(xì)胞壁的提取 分別取5 g經(jīng)高壓蒸煮、膨化和微波處理及未處理的玉米皮渣，經(jīng)研缽研磨后轉(zhuǎn)入離心管中，加50 mL磷酸緩沖液（0.5 mol/L，pH為7.0），振蕩混勻后于4000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用50 mL上述緩沖液洗兩遍，再用蒸餾水洗1次后，沉淀用50 mL氯仿甲醇溶液（體積比1∶1）［11］，于室溫下浸提30 min，4000 r/min離心10 min，再用氯仿甲醇溶液沖洗2次，沉淀用50 mL苯酚/乙酸/水溶液室溫振蕩（100 r/min）浸提30 min，4000 r/min離心10 min，再用苯酚/乙酸/水溶液沖洗2次（離心去上清），再加蒸餾水50 mL，按照玉米皮渣0.2%的添加量添加α-淀粉酶，離心后，再用蒸餾水淋洗細(xì)胞殘留物，重復(fù)操作兩次后，獲得的沉淀物于60℃烘干備用。

1.2.5 FOs的測(cè)定

1.2.5.1 FOs含量 阿魏酰低聚糖是阿魏酸與低聚糖以酯鍵形式連接，經(jīng)堿解后可釋放阿魏酸，現(xiàn)報(bào)道的FOs結(jié)構(gòu)中阿魏酸與低聚糖組成比例相同［4］，即阿魏酸摩爾含量與FOs摩爾含量相同，故本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定FOs樣品液及其堿解液中阿魏酸含量，換算得出FOs的摩爾含量［12］。

1.2.5.2 FOs堿解處理 分別取不同物理處理下的玉米皮渣酶解液1 mL于10 mL離心管中，添加1 mL濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，于100℃水解90 min，冷卻后用1 mol/L的鹽酸溶液中和。

1.2.5.3 阿魏酸的液相色譜測(cè)定條件 采用AgilentTCC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），30℃，進(jìn)行HPLC分離，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器（UV）；洗脫液為0.1%磷酸水（V/V）（A）和乙腈（B），兩者比例為17∶83，流速為1.0 mL/min，進(jìn)液量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

1.2.6 其他指標(biāo)及測(cè)定方法

1.2.6.1 細(xì)胞壁纖維素含量 細(xì)胞壁纖維素水解后采用蒽酮比色法測(cè)定［13］。

1.2.6.2 細(xì)胞壁果膠含量 細(xì)胞壁中果膠先螯合后，再采用蒽酮比色法測(cè)定［13］。

1.2.6.3 細(xì)胞壁木質(zhì)素含量 參照李靖等［14］的方法，采用溴乙酰比色法測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素、纖維素及果膠測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定并繪制，獲得木質(zhì)素、果膠和纖維素的回歸方程分別為y=0.0644x+0.0171，y=0.008x-0.0152和y=0.0042x-0.0294，各方程的R2分別為0.9907，0.9916和0.9911，可用于樣品中木質(zhì)素、果膠及纖維素含量的分析。

2.2 玉米皮渣阿魏酰低聚糖的測(cè)定

如圖1所示，阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品在液相色譜分析時(shí)的出峰時(shí)間為8.425 min，采用液相色譜對(duì)玉米皮渣酶解獲得的FOs樣液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其阿魏酸的出峰時(shí)間段有小峰出現(xiàn)，說(shuō)明在酶解液中有阿魏酸單體存在，其源于玉米皮渣原料或是物理處理后使阿魏酸

單體釋放仍需后續(xù)研究，當(dāng)用NaOH處理玉米皮渣酶解獲得的FOs樣液時(shí)，可見(jiàn)其阿魏酸出峰點(diǎn)的峰形明顯變大，其原因是堿處理使FOs中的阿魏酸酯鍵斷裂，阿魏酸游離析出，故本研究通過(guò)測(cè)定FOs樣液水解前后阿魏酸的增加量來(lái)計(jì)算FOs生成量。

圖1 酶解獲得FOs上清液堿解前后及阿魏酸標(biāo)品液相圖Fig.1 HPLC figures of FOs before and after hydrolysis and HPLC figure of ferulic acid standard

2.3 物理處理對(duì)酶解生成FOs生成量的影響

將不同物理處理后的玉米皮渣采用相同量的纖維素酶和木聚糖酶酶解處理，測(cè)定酶解產(chǎn)物中FOs的含量，結(jié)果如表1所示。

表1 不同物理處理酶解生成FOs量Table1 FOs yield by enzymatic method with maize bran of different physical methods

由表1可知，與原樣（未經(jīng)物理處理）相比，高壓蒸煮可顯著提高玉米皮渣中FOs的生成量，使其產(chǎn)量提高到原樣的1.5倍；微波處理和膨化處理后FOs產(chǎn)量與原樣相比差異不顯著。報(bào)道稱(chēng)物理處理可促進(jìn)外源酶對(duì)植物細(xì)胞壁的水解作用，進(jìn)而可提高FOs產(chǎn)量；而微波處理和膨化處理使玉米皮渣單位體積下受力或溫度較大，致使玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生裂解，這有可能使玉米皮渣中存在的阿魏酰低聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞［15］，故造成處理后的玉米皮渣再酶解所獲得的FOs產(chǎn)量變化不大。

2.4 物理處理對(duì)細(xì)胞壁成分的影響

由表2可知，經(jīng)各處理后，玉米皮渣細(xì)胞壁組成發(fā)生顯著變化。微波處理和高壓蒸煮使玉米皮渣細(xì)胞壁組成中纖維素和果膠含量明顯提高，纖維素含量分別提高為33.48 mg/g和31.62 mg/g，兩者間差異不顯著，但明顯高于未處理的23.99 mg/g，果膠含量由原來(lái)的3.54 mg/g分別提高為6.43 mg/g和8.98 mg/g，但木質(zhì)素含量變化不顯著。原因可能是高壓蒸煮處理主要利用熱效應(yīng)使玉米皮渣結(jié)構(gòu)壁組成發(fā)生改變，在高溫高壓蒸汽作用下，玉米皮細(xì)胞壁中果膠質(zhì)發(fā)生溶解，使其含量增加［16］，此結(jié)果與本研究中果膠含量規(guī)律變化相似。另有報(bào)道稱(chēng)高壓處理可使緊密結(jié)合的大分子結(jié)構(gòu)變得更加松散、多孔，顆粒力度減?。?7］，故在本研究中高壓蒸煮處理顯著提高了酶解后FOs的生成量。微波處理利用熱效應(yīng)和空穴效應(yīng)使玉米皮渣組成發(fā)生改變，其中熱效應(yīng)可能具有與高壓蒸煮相似的作用原理，使得玉米皮細(xì)胞壁組成變化相似。膨化處理的作用原理主要是機(jī)械效應(yīng)。機(jī)械效應(yīng)是秸稈在膨化機(jī)體內(nèi)彼此間相互擠壓、摩擦、剪切，于膨化口處突然減壓高速?lài)娚涠?，由于運(yùn)行速度和方向改變而產(chǎn)生很大的內(nèi)摩擦力。這種內(nèi)摩擦力加上高溫水蒸汽突然膨大而產(chǎn)生的脹力，使玉米皮撕碎，細(xì)胞間木質(zhì)素分布狀態(tài)改變，纖維素中糖苷鍵發(fā)生斷裂［18］，使其轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿涌扇苄岳w維［19］，溶出的纖維素轉(zhuǎn)變?yōu)槭沟眉?xì)胞壁中木質(zhì)素含量相對(duì)提高。

表2 不同物理處理時(shí)玉米皮渣細(xì)胞壁各成分含量Table2 Contents of maize bran cell wall composition treated by different physical methods

2.5 物理處理前后玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化

對(duì)物理處理后的玉米皮渣橫縱切面進(jìn)行掃描電鏡觀察（圖2），結(jié)果顯示不同物理方法處理后，玉米片細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，其中膨化處理使玉米

皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)橫向和縱向均出現(xiàn)斷裂，這與表2中所測(cè)玉米皮渣細(xì)胞壁組成變化相符，且玉米皮渣細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的變化與胡葉碧［20］論文中玉米皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化略有相似，由此說(shuō)明膨化處理使玉米皮渣細(xì)胞壁裂解；高壓蒸煮和微波處理后玉米皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯膨脹，且高壓蒸煮膨脹效果顯著高于微波處理，原因可能是兩者加熱方式以及加熱強(qiáng)度不同；與原樣相比，高壓蒸煮和微波處理在表面均有不同程度物質(zhì)的減少，可能是過(guò)膠物質(zhì)溶出造成樣品的缺失，這與表2測(cè)定結(jié)果相符；此外，微波處理后在玉米皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中亦有少量斷裂形成，這可能是微波處理的空穴效應(yīng)造成了樣品中某些物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，其中可能包含有FOs，因而在微波處理后，樣品酶解獲得FOs量未見(jiàn)顯著提高。

圖2 不同物理處理后玉米皮細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)圖Fig.2 SEM of maize bran cell wall treated by different physical methods

3 結(jié)論

物理處理可輔助酶解提高FOs的生成量，其中高壓蒸煮處理可使FOs量提高至原樣的1.5倍，其原因是高壓蒸煮改變了細(xì)胞壁組成，提高了外源酶與底物的接觸幾率；微波處理和膨化處理對(duì)FOs生成量影響不顯著，原因是兩處理較劇烈，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)裂解同時(shí)可能造成FOs的破壞。

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Influence of physical treatment on the yield of feruloyl oligosaccharides from maize bran by enzymatic hydrolysis

XIE Chun-yan1，2，YOU Xue-jiao3，HOU Xiao-qiang1，2，WU Zhi-yan1，2，*，CAO Ge1，DUAN Xiu-xia1
（1.Langfang Teachers University，Life Science College，Langfang 065000，China；2.Applied Technology Researcher Center of Medicinal and Edible Mushroom of Higher Education School of Hebei Province，Langfang 065000，China；3.Microbiology Institute of Guangdong Province，Guangzhou 510000，China）

The influence of physical treatment on the yield of FOs from maize bran was investigated in this paper.In order to explore the function of physical treatment on FOs yield，the changes of composition and structure of maize bran cell wall was determined and the production of FOs was measured.Results indicated that FOs yield was improved 1.5 folds after high pressure steaming，the reason was that the composition of wheat bran cell wall was changed by high pressure steaming，and cellulose and pectin were released，the contact probability of cellulose and xylanase with wheat bran was increased.Cell wall of maize bran was decomposed by microwave treatment and extrusion process，and FOs yield was no obvious change.

maize bran；feruloyl oligosaccharides；physical treatment；enzymatic hydrolysis

TS251.1

B

1002-0306（2016）08-0272-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.048

2015－09－29

解春艷（1983-），女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：xcy8046@163.com。

*通訊作者：吳智艷（1957-），女，碩士，教授，研究方向：微生物，E-mail：lfwuzhiyan@126.com。

河北省教育廳優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（YQ2013027）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（Z2014049）；河北省高校食藥用菌應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心項(xiàng)目（YF201411-321），河北省高等學(xué)校遺傳學(xué)重點(diǎn)發(fā)展學(xué)科項(xiàng)目（201221）；廊坊師范學(xué)院微生物學(xué)重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（201501）；廊坊師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目（LSLB201407）。