牡蠣肽鋅螯合物的制備工藝研究

劉 艷，魯 軍，陳 亮，王海軒，谷瑞增，蔡木易（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015）

牡蠣肽鋅螯合物的制備工藝研究

劉 艷，魯 軍，陳 亮，王海軒，谷瑞增，蔡木易*
（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京100015）

分析牡蠣肽氨基酸組成及相對分子質量分布，并以牡蠣肽為原料、硫酸鋅為鋅源對牡蠣肽鋅螯合物的制備工藝進行研究，通過測定鋅離子螯合率和螯合物得率衡量螯合效果。結果表明，牡蠣肽相對分子質量小于1000 u的組分高達92.34%，富含谷氨酸和天冬氨酸這兩種酸性氨基酸及其酰胺；保證螯合率及得率的最佳螯合條件為：肽與硫酸鋅質量比為20∶1，肽濃度為0.06 g/mL，反應溫度為50℃，沉淀劑乙醇為5倍反應液體積，pH5.33，反應時間60 min。在此條件下鋅離子的螯合率為89.55%±0.23%，螯合物得率為56.64%±0.55%。

牡蠣，肽，鋅，螯合物，制備工藝

鋅是人體必需的微量元素之一，在人體生長發(fā)育、生殖遺傳等重要生理過程中起到至關重要的作用。鋅存在于DNA聚合酶、堿性磷酸酶等80多種代謝相關酶中，直接關系到核酸及蛋白質合成及代謝、細胞再生與分裂、細胞代謝［1］。人體缺乏鋅元素時，會出現各種含鋅酶活性及免疫功能降低的現象。我國居民普遍存在鋅缺乏的問題，根據對19個省的調查表明，60%的學齡前兒童鋅攝入量僅為正常值的50%左右，鋅缺乏較為嚴重［2］。

近年來，以活性肽為原料，開發(fā)易于吸收利用、生理活性強的新型補鋅劑，已成為熱點研究問題。高紅梅等［3］以小麥肽作為原料制備小麥肽鋅螯合物，螯合率達84.25%；張全才［4］采用水解米蛋白肽作為原料制備補鋅劑，螯合率達70.1%；Wang等［5］從芝麻蛋白水解物中鑒定出Ser-Met和Asn-Cys-Ser這兩個活性肽段與鋅離子以1∶1的比例結合為螯合物，并且證實水分子參與了螯合物的形成；Chen等［6］從牡蠣蛋白水解物中分離、鑒定出具有鋅離子螯合能力的肽段結構HLRQEEKEEVTVGSLK。此外，研究表明腸道內存在特殊的肽的轉運系統，其位于小腸上皮細胞的刷狀緣膜［7］。與氨基酸相比，活性肽的吸收效率高且不易飽和［8］。

牡蠣肽是以牡蠣肉為原料，經過蛋白提純、酶解、提純等步驟加工制得，具有均衡的氨基酸組成的肽類混合物，其蛋白含量高、穩(wěn)定性高、易于消化吸收。大量研究表明，牡蠣肽具有抗氧化［9］、抗菌［10］、降

血壓［11］、免疫調節(jié)［12］等多種功能活性。

本研究首先對牡蠣肽原料組成進行分析，然后以硫酸鋅作為鋅源對牡蠣肽鋅螯合物的制備工藝進行了研究，為新型活性肽補鋅劑的開發(fā)以及牡蠣資源的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 市售；硫酸鋅、硫脲、氟化氨、二甲酚橙、乙酸鈉、冰醋酸、濃硫酸、抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉、無水乙醇、檸檬酸 北京化工廠，分析純；木瓜蛋白酶、風味蛋白酶 諾維信生物技術有限公司；乙腈 美國Fisher公司，色譜純；三氟乙酸 英國Alfa Aesar公司，分析純；肽標準品 中國藥品生物制品檢定所。

AB104-N電子天平 梅特勒托利多公司；HW.SY21-KP4恒溫水浴箱 北京市長風儀器儀表公司；S20P-K精密pH計 梅特勒托利多；3K-15離心機 德國Sigma公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱 北京陸希科技有限公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津；氨基酸分析儀 德國Membrapure A300。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣肽制備 將牡蠣去殼清洗，加水碾磨成牡蠣漿，去殼牡蠣與水的重量比為1∶1～1∶5；加入檸檬酸調整pH至5，在30℃條件下攪拌該牡蠣漿3 h，3000 r/min離心去除上清液，得到牡蠣渣料；將該牡蠣渣料以3∶1的水渣比加水進行混合、攪拌，調整pH 至8，加熱至45℃，按每克牡蠣渣料加入50 U的風味蛋白酶和50 U的木瓜蛋白酶，酶解4 h，90℃加熱滅酶15 min；將酶解液離心，轉速為3000 r/min；然后對上清液進行蒸發(fā)濃縮，條件為蒸汽壓（0.1±0.02）MPa，溫度40～80℃、按照濃縮液總固含量10%～30%的比例加入活性炭粉進行脫色，并過濾、滅菌；用離心噴霧干燥器將上述脫色后的濃縮液進行干燥處理，條件為進口溫度140～160℃，出口溫度80～90℃，制成牡蠣活性肽粉。

1.2.2 氨基酸組成分析 依據GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》，使用氨基酸自動分析儀對牡蠣肽中的氨基酸組成進行分析。

1.2.3 相對分子質量分布分析 采用高效液相凝膠色譜法。樣品用流動相溶解，經孔徑為0.2 μm聚四氟乙烯膜過濾后進行液相檢測。色譜條件：色譜柱：TSK gel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1（體積比）；檢測波長：UV 220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL；上樣濃度：1 mg/mL。使用GPC軟件進行數據處理。以五種肽標準品制作相對分子質量校正曲線，標準品為：乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸（MW 189）、乙氨酸—乙氨酸—酪氨酸—精氨酸（MW 451）、桿菌酶（MW 1450）、抑菌肽（MW 6500）、細胞色素C （MW 12500）。

1.2.4 牡蠣肽鋅螯合物的制備 稱取一定質量的牡蠣肽粉和硫酸鋅，分別用少量蒸餾水溶解后定容，得到一定濃度的牡蠣肽溶液和硫酸鋅溶液。分別量取一定體積的兩種溶液，混合均勻，并置于一定溫度下反應至所需時間。冷卻后，加入一定體積的無水乙醇，在7500 r/min的轉速下離心15 min，除去上清液，并用無水乙醇洗滌離心1～2次。將沉淀物置于45℃電熱鼓風干燥箱中烘干，得牡蠣肽鋅螯合物。每組設置3個平行組，測定鋅的螯合率及螯合物得率。

1.2.5 鋅的螯合率及螯合物得率的測定計算 首先測定牡蠣肽鋅螯合物中鋅的質量，根據《GB 25579-2010食品安全國家標準食品添加劑硫酸鋅》［13］中鋅含量測定方法并進行改進。稱取0.03～0.1 g牡蠣肽鋅螯合物，置于50 mL錐形瓶中，加少量水潤濕，滴加2滴50%（V/V）硫酸溶液溶解，加10 mL水、2 mL氟化氨飽和溶液、0.5 mL硫脲溶液（200 g/L）和0.04 g抗壞血酸，搖勻溶解后加入3 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH5～6）和2滴二甲酚橙指示液（2 g/L），用乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液滴定由紫紅色變?yōu)榱咙S色為終點，同時做空白實驗。

試樣中鋅質量X（g）按下式計算：

式中：V1—滴定試樣溶液所消耗的乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液體積，mL；V2—滴定空白溶液所消耗的乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液體積，mL；C—乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；65.39—鋅的相對分子質量。

鋅的螯合率及螯合物得率按照以下公式計算。

鋅的螯合率（%）=W1/W0×100

式中：W0—反應體系中鋅的總質量，g；W1—螯合物中鋅的總質量，g。

螯合物得率（%）=W3/W2×100

式中：W2—初始反應物的總質量，g；W3—反應后牡蠣肽鋅螯合物的總質量，g。

1.2.6 單因素實驗及正交實驗 實驗中對牡蠣肽與硫酸鋅質量比、牡蠣肽濃度、反應溫度、反應pH、反應時間、沉淀劑乙醇用量進行單因素實驗。牡蠣肽與硫酸鋅質量比對螯合反應的影響實驗：質量比分別為1∶1、4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、24∶1、28∶1、32∶1，肽質量濃度0.04 g/mL，溫度60℃，pH5.33，反應時間60 min，沉淀劑為反應液體積的1倍。牡蠣肽濃度對螯合反應的影響實驗：肽質量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 g/mL，肽與硫酸鋅質量比為20∶1，溫度60℃，pH5.33，反應時間60 min，沉淀劑為反應液體積的1倍。溫度對螯合反應的影響實驗：反應溫度分別為30、40、50、60、70℃，肽與硫酸鋅質量比為20∶1，肽質量濃度0.04 g/mL，pH5.33，反應時間60 min，沉淀劑為反應液體積的1倍。pH對螯合反應的影響實驗：反應pH分別為5.33、5、4、3，肽與硫酸鋅質量比為20∶1，肽質量濃度0.04 g/mL，溫度50℃，反應時間60 min，沉淀劑為反應液體積的1倍。時間對螯合反應的影響實驗：反應時間分別為20、40、60、80 min，肽與硫酸鋅質量比為20∶1，肽質量濃度0.04 g/mL，溫度50℃，pH5.33，沉淀劑為反應液體積的1倍。沉淀劑乙醇用量對螯合反應的影響實驗：乙醇用量分別為反應液體積的0、1、2、3、4、5、6倍，肽與硫酸鋅質量比為20∶1，

肽質量濃度0.04 g/mL，溫度50℃，pH5.33，反應時間60 min。

在單因素實驗基礎上確定正交實驗的因素及水平，選用L9（34）正交表進行正交實驗，實驗設計見表1，確定最佳的螯合制備工藝。

表1 正交實驗設計表Table1 Design of the orthogonal experiment

1.3 數據處理

實驗數據使用SPSS 19.0軟件進行統計處理，組間比較采用t檢驗，若p＜0.05，兩者有顯著性差異；若p＜0.01，兩者有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 牡蠣肽成分分析

對按方法1.2.1制得的牡蠣肽進行氨基酸含量及相對分子質量分布分析，結果見表2和表3。

表2 牡蠣肽氨基酸含量Table2 Amino acid composition of oyster peptide

肽類與鋅離子螯合能力與其氨基酸組成密切相關，Jiang等［14］指出酸性氨基酸含量較高的肽段與鋅離子的結合能力更強。牡蠣肽氨基酸含量測定結果顯示，谷氨酸、天冬氨酸這兩種酸性氨基酸及其酰胺含量較高，其中谷氨酸及其酰胺（Gln+Glu）含量最高，占10.981%；天冬氨酸及其酰胺（Asp+Asn）占8.369%。

表3 牡蠣肽相對分子質量分布情況Table3 Relative molecular weight distribution of oyster peptide

表3結果表明，牡蠣肽主要由小分子肽段構成。相對分子質量小于1000 u的組分占92.34%，其中500～1000 u的組分占22.61%，140～500 u的組分占54.63%。按照氨基酸平均相對分子質量為137 u計算，牡蠣肽主要由八肽以下的小分子肽段構成，并且二肽和三肽所占比例最高。研究表明，小肽的吸收效率比氨基酸高，更容易被人體吸收利用，進而發(fā)揮其多種功能活性［15］。

2.2 牡蠣肽鋅制備單因素實驗

2.2.1 牡蠣肽與硫酸鋅質量比對螯合反應的影響 由圖1可知，牡蠣肽與硫酸鋅的質量比對螯合反應的影響很大。在牡蠣肽與硫酸鋅質量比為1∶1至32∶1范圍內，鋅的螯合率隨質量比的增大而增大，當比值為20∶1時，螯合率達75.58%，比值繼續(xù)增大時，螯合率達89%。螯合物得率測定結果顯示，隨牡蠣肽與硫酸鋅質量比的增大出現下降的趨勢，比值為8∶1至20∶1范圍內，得率為17%～15%，當比值繼續(xù)增大時，得率降低至13%以下。由上述結果可知，當肽與鋅鹽質量比過低時，鋅離子的螯合率較低，造成鋅源的浪費；比值過大時，螯合物的得率較低，造成牡蠣肽原料的浪費。因此，比值在20∶1左右比較合適，選擇此質量比作為后續(xù)實驗條件。

圖1 牡蠣肽與硫酸鋅的質量比對螯合反應的影響Fig.1 Effect of mass ratio of oyster peptide to ZnSO4on chelating reaction

圖2 牡蠣肽濃度對螯合反應的影響Fig.2 Effect of the concentration of oyster peptide on chelating reaction

2.2.2 牡蠣肽濃度對螯合反應的影響 由圖2可知，牡蠣肽濃度對螯合反應的影響較大。牡蠣肽濃度過

低或過高時，螯合率均較低，當濃度為0.04、0.06、0.08 g/mL時，螯合率分別為78.18%、75.23%、73.28%，此時得率分別為13.87%、13.92%、14.63%，為較合適的濃度范圍。選擇0.04 g/mL作為后續(xù)實驗條件。

2.2.3 溫度對螯合反應的影響 由圖3可知，反應溫度主要影響鋅離子的螯合率，而對螯合物得率影響較小。在40、50、60℃下，螯合率較高，并且在50℃時，螯合率達到最高，為77.18%。螯合物得率檢測結果顯示，40、50、60℃下得率均在13%～14%范圍內。選擇螯合率最高的50℃進行后續(xù)實驗。

圖3 反應溫度對螯合反應的影響Fig.3 Effect of temperature on chelating reaction

2.2.4 pH對螯合反應的影響 在肽濃度為0.04 g/mL、肽與硫酸鋅質量比為20∶1條件下，不經pH調節(jié)，反應液的pH為5.33。加堿會導致氫氧化鋅沉淀生成，不利于螯合物的制備；pH太低，過多的氫離子會取代金屬離子，影響螯合物的形成，此時螯合率及得率均較低。因此，將肽溶液與硫酸鋅溶液混合后的pH即為反應適宜條件，不宜進行pH調節(jié)。

圖4 反應pH對螯合反應的影響Fig.4 Effect of pH on chelating reaction

2.2.5 時間對螯合反應的影響 由圖5可知，反應時間對鋅離子的螯合率有顯著影響，而對螯合物得率影響較小。在20～60 min內，隨時間的增加鋅的螯合率增加，在60 min時為77.14%，此時得率為13.65%。選擇60 min作為后續(xù)反應時間。

2.2.6 沉淀劑乙醇用量對螯合反應的影響 在牡蠣肽與硫酸鋅質量比為20∶1，牡蠣肽濃度為0.04 g/mL條件下，沉淀劑乙醇用量對鋅離子螯合率及螯合物得率影響很大。由圖6可知，隨乙醇用量的增加螯合率及產物得率都隨之增加，在乙醇用量為反應液體積的4倍、5倍及6倍時，鋅離子螯合率分別為85.81%、86.53%、86.43%，產物得率分別為41.59%、45.48%、44.64%。選擇螯合率及得率較高的沉淀劑乙醇用量（4、5、6倍）作為正交實驗條件。

圖5 反應時間對螯合反應的影響Fig.5 Effect of time on chelating reaction

圖6 沉淀劑乙醇用量對螯合反應的影響Fig.6 Effect of the dosage of precipitating agent（ethanol）on chelating reaction

2.3 牡蠣肽鋅制備正交實驗

根據單因素實驗結果，對牡蠣肽與硫酸鋅質量比、牡蠣肽濃度、反應溫度、沉淀劑乙醇用量這四個因素進行L9（34）正交實驗，結果見表5。

由表5可知，影響鋅的螯合率的因素主次順序是A＞D＞B＞C，即肽與硫酸鋅質量比＞沉淀劑乙醇用量＞牡蠣肽濃度＞反應溫度；影響螯合物得率的因素主次順序為D＞B＞A＞C，即沉淀劑乙醇用量＞牡蠣肽濃度＞肽與硫酸鋅質量比＞反應溫度。最佳實驗方案是D2B2A2C2，即肽與硫酸鋅質量比為20∶1，肽濃度為0.06 g/mL，反應溫度為50℃，沉淀劑乙醇為5倍反應液體積，在此條件下鋅離子的螯合率為89.55%±0.23%，得率為56.64%±0.55%。

3 結論

本研究結果表明，牡蠣肽屬于小分子肽段混合物，其中相對分子質量小于1000 u的組分占92.34%，蛋白質含量高，富含酸性氨基酸。通過單因素實驗及正交實驗，確定保證螯合率和得率的適宜方案，即肽與硫酸鋅質量比為20∶1，肽濃度為0.06 g/mL，反應溫度為50℃，反應時間為60 min，沉淀劑乙醇為5倍反應液體積，在此條件下鋅離子的螯合率為89.55%± 0.23%，得率為56.64%±0.55%。該制備工藝過程中無有害物質參加和產生、操作簡單、成本低廉。

表5 正交實驗結果Table5 Result of the orthogonal experiment

牡蠣肽螯合鋅作為有機鋅，相比無機鋅具有高效、安全、穩(wěn)定的特點，并且在補充微量元素的時候同時可補充具有多項功能的活性肽，全面強化牡蠣肽鋅螯合物的生理功效，將具有良好的應用前景。今后，牡蠣肽鋅螯合物的結構及生理功能還有待進一步研究。

［1］李青仁，周曉光，孫麗敏.鋅的生理功能與人體健康的關系［C］.中國微量元素科學研究會.中國微量元素科學研究會第三屆會員代表大會暨第十一屆學術研討會會議論文集.海口：2004：12-16.

［2］曹繼瓊，何長華.鋅缺乏對人體健康的影響［J］.現代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30（7）：1016-1019.

［3］高紅梅，桑宏慶，李淑賢.小麥肽-鋅螯合物的制備［J］.飲料工業(yè)，2013，16（7）：23-27.

［4］張全才.米蛋白肽鋅的制備工藝及產品特性研究［D］.南昌：南昌大學，2007.

［5］WANG Chan，LI Bo，LI Haixia.Zn（II）chelating with peptides found in sesame protein hydrolysates：Identification of the binding sites of complexes［J］.Food Chemistry，2014，165：594-602.

［6］CHEN Da，LIU Zunying，HUANG Wenqian，et al.Purification and characterisation of a zinc-binding peptide from oyster protein hydrolysate［J］.Journal of Functional Foods，2013，5（2）：689-697.

［7］曹文紅，章超樺.生物活性肽的吸收機制［J］.藥物生物技術，2006，13（5）：384-388.

［8］HELLWIG M，GEISSLER S，PETO A，et al.Transport of free and peptide-bound pyrraline at intestinal and renal epithelial cells［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57 （14）：6474-6480.

［9］WANG Qiukuan，LI Wei，HE Yunhai，et al.Novel antioxidative peptides from the protein hydrolysate of oysters（Crassostrea talienwhanensis）［J］.Food Chemistry，2014，145：991-996.

［10］LIU Zunying，DONG Shiyuan，LIU Jie，et al.Production of cysteine-rich antimicrobial peptide by digestion of oyster （Crassostrea gigas）with alcalase and bromelin［J］.Food Control，2008，19（3）：231-235.

［11］WANG Jiapei，HU Jianen，CUI Jinzhe，et al.Purification and identification of a ACE inhibitory peptide from oyster proteins hydrolysate and the antihypertensive effect of hydrolysate in spontaneously hypertensive rats［J］.Food Chemistry，2008，111 （2）：302-308.

［12］蔡冰娜，吳園濤，孫恢禮.牡蠣肽腸內營養(yǎng)制劑對小鼠免疫功能的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（11）：2816-2818.

［13］GB 25579-2010，食品安全國家標準食品添加劑硫酸鋅［S］.

［14］JIANG Liangping，WANG Bo，LI Bo，et al.Preparation and identification of peptides and theirzinc complexes with antimicrobial activities from silver carp（Hypophthalmichthys molitrix）protein hydrolysates［J］.Food Research International，2014，64：91-98.

［15］蔡木易.食源性肽研究進展［J］.北京工商大學學報：自然科學版，2012，30（5）：1-10.

Preparation of oyster peptide-zinc chelates

LIU Yan，LU Jun，CHEN Liang，WANG Hai-xuan，GU Rui-zeng，CAI Mu-yi*
（Beijing Engineering Research Center of Protein&Functional Peptides，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

The oyster peptides were characterized according to their amino acid composition and molecular weight distribution，and the preparation conditions of the peptides-zinc chelates were analyzed.Oyster peptides and zinc sulfate were the raw materials，and chelating effect was determined by chelating ratio of zinc and the yield of the peptide-zinc chelates.The results revealed that oyster peptides were composed of 92.34% peptides with a molecular size under 1000 u，and rich in glutamic acid and glutamine，aspartic acid and asparagines.Moreover，the optimal condition of the chelating reaction was as follow：the mass ratio of peptides to ZnSO4was 20∶1，the concentration of peptides was 0.06 g/mL，the reaction temperature was 50℃，the dosage of precipitating agent（ethanol）was 5 times as much as reaction liquid，the pH value was 5.33，and the reaction time was 60 min.Under the optimal chelating conditions，the chelated zinc ratio reached 89.55%± 0.23%，and the productive index of the peptide-zinc chelates was 56.64%±0.55%.

oyster；peptide；zinc；chelate；preparation technology

TS202.1

B

1002-0306（2016）08-0257-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.045

2015－07－02

劉艷（1986-），女，碩士，工程師，研究方向：功能性食品，E-mail：liuyan39259@163.com。

*通訊作者：蔡木易（1962-），男，教授級高級工程師，研究方向：功能性食品，E-mail：caimuyi@vip.sina.com。

北京市科技計劃項目（Z131100003113010）；國家十二五科技支撐項目（2012BAD33B04-02）；國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102205-02）；科技北京百名領軍人才培養(yǎng)工程項目（Z131110000513026）。