祛風(fēng)止痛顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳雪，畢曉黎，，胥愛麗，羅文匯，李素梅，李養(yǎng)學(xué)（.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50095；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣東第二中醫(yī)院，廣東廣州50405）

祛風(fēng)止痛顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳雪2，畢曉黎1，2，胥愛麗1，羅文匯1，李素梅1，李養(yǎng)學(xué)1
（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣東第二中醫(yī)院，廣東廣州510405）

目的建立祛風(fēng)止痛顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜（TLC）法對方中補(bǔ)骨脂、青風(fēng)藤進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）對方中補(bǔ)骨脂所含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定，以Agilent Elipse-plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-水（體積比43∶57）為流動相，檢測波長為246 nm。結(jié)果在TLC中能檢出補(bǔ)骨脂、青風(fēng)藤的特征斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。補(bǔ)骨脂素在0.048 3 ～0.482 6 μg范圍內(nèi)，異補(bǔ)骨脂素在0.046 7～0.466 5 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，r值均為0.999 9，平均加樣回收率分別為99.28%、98.78%，RSD值分別為1.69%、0.89%（n=9）。結(jié)論所建立的方法簡便準(zhǔn)確、快速、專屬性高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠，可用于祛風(fēng)止痛顆粒的質(zhì)量控制。

祛風(fēng)止痛顆粒；補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

祛風(fēng)止痛顆粒是由廣東省第二中醫(yī)院名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)處方加工制成的醫(yī)院內(nèi)部制劑，主要由補(bǔ)骨脂、青風(fēng)藤、秦艽、薏苡仁、獨(dú)活、續(xù)斷6味中藥組成，具有活血補(bǔ)腎、祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)功效，可用于治療關(guān)節(jié)腫脹、脈絡(luò)閉阻型風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［1］。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎多因外有寒邪入侵，內(nèi)有腎虛而致正氣不足。腎為寒水之臟，最易被寒邪所傷，而寒主收引，腎主骨，寒邪入侵導(dǎo)致筋脈攣急、關(guān)節(jié)不利，故發(fā)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。此病病程長、纏綿難愈，久而久之造成虛、瘀、腎傷，因此瘀血阻絡(luò)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理基礎(chǔ)，其治療的根本多為補(bǔ)腎［2-3］。祛風(fēng)止痛顆粒處方以補(bǔ)腎壯陽、活血化瘀的補(bǔ)骨脂為君藥［4］，再以具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)之功的青風(fēng)藤為臣藥［5］，對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎收效較佳。故本文采用TLC法對處方中的補(bǔ)骨脂、青風(fēng)藤進(jìn)行了定性鑒別，同時(shí)以君藥補(bǔ)骨脂中的特征性成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素為檢測指標(biāo)［6］，采用HPLC法對處方中所含的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素進(jìn)行了質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定，為祛風(fēng)止痛顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為中藥顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了有效參考，更加保證臨床用藥的安全有效。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Waters2489高效液相色譜儀（DAD檢測器，四元梯度泵，美國 Waters公司），Agilent Elipse-plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國Agilent公司）；CAMAG TLC SAMPLER 4型自動點(diǎn)樣儀（瑞士CAMA公司）；CAMAG Reprostar 3數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士CAMA公司）；Mettler XS205Du電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒公司）；BQ-Ⅱ型薄層自動鋪板器（重慶南岸實(shí)驗(yàn)電器廠）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；MilliPore Advantage A10自動純水機(jī)（美國MilliPore公司）；KQ52300DE型數(shù)控超聲波輔助提取儀（功率500 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴槽（金壇市科析儀器有限公司）。

1.2試藥

補(bǔ)骨脂對照藥材（批號:121056-200904）、青風(fēng)藤對照藥材（批號:121251-201002）；補(bǔ)骨脂素（批號:110739-201115，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%）、異補(bǔ)骨脂素對照品（批號:110738-200309，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；祛風(fēng)止痛顆粒（批號分別為160101、160102、160103）均由廣東省第二中醫(yī)院提供；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　TLC法定性鑒別

2.1補(bǔ)骨脂的薄層鑒別［6］187

取本品3 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取補(bǔ)骨脂對照藥材，加水100 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液用適量硅藻土拌樣，同法處理作為對照藥材溶液。取缺補(bǔ)骨脂藥材的陰性樣品，同對照藥材制備方法制成補(bǔ)骨脂陰性對照溶液。按照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品、對照藥材、陰性對照溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（體積比4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%（體積分?jǐn)?shù)）KOH甲醇溶液，置紫外燈光（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的2個(gè)熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。見圖1。

圖1　補(bǔ)骨脂鑒別的TLC色譜圖Figure 1 TLC chromatogram of Psoraleae fructus

2.2青風(fēng)藤的薄層鑒別［6］195

取本品7 g，加乙醇25 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解。另取青風(fēng)藤對照藥材2 g，加水100 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液用適量硅藻土拌樣，同法處理作為對照藥材溶液。取缺青風(fēng)藤藥材的陰性樣品，同對照藥材制備方法制成青風(fēng)藤陰性對照溶液。按照薄層色譜法（2015年版《中國藥典》四部通則0502）試驗(yàn)，分別吸取上述供試品、對照藥材、陰性對照溶液10、5、10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（體積比2∶4∶2∶1）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，置濃氨試液預(yù)飽和20 min的展開缸內(nèi)展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液，日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對照無干擾。見圖2。

3　補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定［6］187

3.1混合對照品溶液的制備

分別取經(jīng)P2O5減壓干燥器中干燥36 h的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素9.72、9.33 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，即得每1 mL含補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素分別為96.52、93.30 μg的混合對照品溶液，放置，備用。

圖2　青風(fēng)藤鑒別的TLC色譜圖Figure 2 　TLC chromatogram of Sinomenii caulis

3.2供試品溶液的制備

取祛風(fēng)止痛顆粒細(xì)粉（過3號篩）約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞的錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量。加熱回流提取20 min，放冷，稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液2 mL，0.45 μm微孔濾膜濾過，再取續(xù)濾液，即得供試品溶液，放置，備用。

3.3陰性對照溶液的制備

按照處方比例，取除補(bǔ)骨脂外的處方藥材，按照處方工藝的制備方法制備，得到1.023 5 g陰性對照樣品。取陰性對照樣品，同“3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，得補(bǔ)骨脂陰性對照溶液。

3.4色譜條件與專屬性考察［6］187

色譜柱:Agilent Elipse-plus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相:甲醇-水（體積比43∶57）；流速: 1 mL/min；柱溫:25℃；檢測波長:246 nm；進(jìn)樣量: 10 μL。

分別精密吸取上述混合對照品、供試品（批號: 160101）、陰性對照溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果理論板數(shù)以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000；陰性對照溶液在補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素色譜峰位置上無干擾，表明方法專屬性好，見圖3。

3.5線性關(guān)系的考察

精密吸取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，振勻，制成補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度分別為4.83、9.65、19.30、28.96、38.61、48.26 μg/mL，異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度分別為4.67、9.33、18.66、27.99、37.32、46.65 μg/mL的系列對照品溶液。依次進(jìn)樣10 μL，按“3.4”項(xiàng)下色譜條件測定并記錄峰面積。分別以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素回歸方程分別為Y1=7.900× 103X1+1.170 0×104（r1=0.999 9）、Y2=7.410×103X2+1.030 0×104（r2=0.999 9）。結(jié)果表明補(bǔ)骨脂素在0.048 3～0.482 6 μg，異補(bǔ)骨脂素在0.046 7～0.466 5 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

圖3　混合對照品（A）、供試品（B）、陰性對照（C）溶液的HPLC色譜圖Figure 3 HPLC chromatograms of reference substances（A），test sample（B）and negative control（C）

3.6精密度試驗(yàn)

取同一批（批號:160101）祛風(fēng)止痛顆粒約1 g，精密稱定，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD值分別為1.10%、1.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批（批號:160101）祛風(fēng)止痛顆粒約1 g，精密稱定，按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、2、6、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣，按“3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰面積積分值的RSD值分別為1.31%、1.34%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批（批號:160101）祛風(fēng)止痛顆粒約1 g，精密稱定，共6份，分別按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測得補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為266.34、322.20 μg/g，其RSD值分別為0.41%、0.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

3.9加樣回收率試驗(yàn)

取9份已知補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別為 266.34、322.20 μg/g）的同一批（批號: 160101）祛風(fēng)止痛顆粒，每份約0.5 g，精密稱定，每3份為1組。每組分別精密加入新配制的混合對照品溶液（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素質(zhì)量濃度分別為66.59、80.55 μg/mL）1、2、3 mL，揮干，分別按照“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.4”項(xiàng)下色譜條件測定并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～表2。

表1　祛風(fēng)止痛顆粒中補(bǔ)骨脂素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery results of psoralen in Qufeng Zhitong granules

表2　祛風(fēng)止痛顆粒中異補(bǔ)骨脂素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery results of isopsoralen in Qufeng Zhitong granules

3.10樣品的測定

分別取3批（批號:160101、160102、160103）祛風(fēng)止痛顆粒，各約1 g，精密稱定，每批平行操作2份。分別按“3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算得3批祛風(fēng)止痛顆粒中補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為266.34、265.35、265.78 μg/g；異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為322.20、321.85、322.80 μg/g。

4　討論

本試驗(yàn)對處方中的補(bǔ)骨脂和青風(fēng)藤進(jìn)行了薄層鑒別，首先按照2015年版《中國藥典》［6］187，195的方法進(jìn)行了試驗(yàn)，斑點(diǎn)清晰可見、分離度良好，且陰性對照無干擾，故可列入標(biāo)準(zhǔn)。

本試驗(yàn)對補(bǔ)骨脂提取方法進(jìn)行了考察，首先按2015年版《中國藥典》的方法（加甲醇索式提取2 h）［6］187進(jìn)行提取。索氏提取所用時(shí)間相對較長，為了縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、提高實(shí)驗(yàn)效率，考慮采用其他方法進(jìn)行提取，本文分別對索氏、超聲和加熱回流這3種提取方法進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示:超聲提取法提取率不高，索氏提取與回流提取效果相當(dāng)，但回流提取所用時(shí)間更短；故最終確定采用加熱回流法進(jìn)行提取。又經(jīng)過優(yōu)化提取時(shí)間和提取溶劑體積，最終確定最佳提取方法為加甲醇20 mL，加熱回流20 min。

參考2015年版《中國藥典》［6］187，對補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素測定時(shí)流動相的比例、色譜柱、流速、柱溫等色譜條件進(jìn)行了考察，通過線性范圍、專屬性、加樣回收率等方法學(xué)驗(yàn)證，確定本方法穩(wěn)定、精準(zhǔn)、專屬性強(qiáng)，可作為祛風(fēng)止痛顆粒中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法。

［1］衣蕾，雷媛琳，吉海旺，等.補(bǔ)腎活血祛風(fēng)法聯(lián)合甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 66例［J］.陜西中醫(yī)，2010，31 （6）:698-670.

［2］衣蕾，姜小帆，李娟娥.吉海旺教授分期辨證治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗(yàn)［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2012，1（6）:60-62.

［3］姜婷，汪榮盛，茅建春.淺談從腎論治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［J］.風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2013，2（2）:40-43.

［4］林清，李勁平，栗會敏，等.補(bǔ)骨脂的研究進(jìn)展［J］.咸寧學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，26（2）:175-177.

［5］董文燊，瞿發(fā)林.青風(fēng)藤藥理作用及制劑臨床應(yīng)用研究概況［J］.天津藥學(xué)，2012，24（2）:76-78.

［6］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2015年版一部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

（責(zé)任編輯：劉曉涵）

Study on quality standard of Qufeng Zhitong granules

CHEN Xue2，BI Xiaoli1，2，XU Aili1，LUO Wenhui1，LI Sumei1，LI Yangxue1
（1.Guangdong Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine/Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development of Guangdong Province，Guangzhou 510095，China；2.Second Chinese Medicine Hospital of Guangdong Province，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Objective To establish the quality standard of Qufeng Zhitong granules.Methods TLC was used for the qualitative identification of Psoraleae fructus and Sinomenii caulis.Agilent Elipse-plus C18column was used with the mobile phase of methanol-water（43∶57），and the detection wavelength was set at 246 nm.Results The TLC spots were clear and well-separated without interference of negative samples.The linear relationship of psoralen was good within the range of 0.048 3-0.482 6 μg（r=0.999 9），and the linear relationship of isopsoralen was good at the range of 0.046 7-0.466 5 μg（r=0.999 9）.The average recoveries were 99.28%（RSD=1.69%）and 98.78%（RSD=0.89%）（n=9），respectively.Conclusion The method is simple and accuracy，quick，highly specific and reliable with good repeatability，which could be used for the quality control of Qufeng Zhitong granules.

Qufeng Zhitong granules；psoralen；isopsoralen；TLC；HPLC；quality standard

藥理學(xué)

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0462-04

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016033001

2016-03-30

廣東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑研發(fā)技術(shù)平臺建設(shè)（2013B040200040）

陳雪（1989—），女，2014級碩士研究生，Email:18898606478@163.com，從事中藥質(zhì)量評價(jià)研究；通信作者:畢曉黎（1979—），女，博士，主任中藥師，碩士研究生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量評價(jià)研究。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-06 10:37 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160706.1037.001.html