基于GFP/SCL-tTA/Bcr-abl轉(zhuǎn)基因小鼠建立CML嵌合小鼠模型

廖芬芳，陳永恒，吳清清，程琳，周曉明，王偉章（廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006）

基于GFP/SCL-tTA/Bcr-abl轉(zhuǎn)基因小鼠建立CML嵌合小鼠模型

廖芬芳，陳永恒，吳清清，程琳，周曉明，王偉章
（廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院/廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006）

目的建立慢性粒細胞白血病（CML）的轉(zhuǎn)基因嵌合小鼠模型，為靶向白血病干細胞（LSCs）治療CML的研究提供良好的動物模型。方法 將Bcr-abl轉(zhuǎn)基因小鼠與SCL-tTA轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交，子代小鼠再與GFP轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，PCR鑒定Bcr-abl、tTA和GFP基因三陽性的小鼠（GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠）。通過誘導(dǎo)GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠Bcr-abl基因表達4周后，取其骨髓白細胞移植至經(jīng)致死劑量（900 cGy）輻照的FVB/N野生型小鼠。移植3周后，采用Western blotting檢測Bcr-abl蛋白表達，流式細胞術(shù)檢測小鼠外周血GFP+中性粒細胞的比例以及脾臟和骨髓GFP+LSCs的比例。結(jié)果 PCR結(jié)果顯示，GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠骨髓細胞成功植入FVB/N受體小鼠；Western blotting檢測結(jié)果顯示，移植小鼠的骨髓細胞中表達Bcr-abl蛋白；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，移植小鼠的外周血GFP+中性粒細胞比例以及脾臟和骨髓GFP+LSCs的比例明顯升高。結(jié)論 成功建立了GFP/SCL-tTA/Bcr-abl轉(zhuǎn)基因CML嵌合小鼠模型。

慢性粒細胞白血??；轉(zhuǎn)基因小鼠；Bcr-abl

慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種起源于白血病干細胞（leukemia stem cells，LSCs）并嚴重威脅人類健康的惡性增殖性血液腫瘤。由于超過95%的CML患者均存在因染色體易位而產(chǎn)生的Bcr-abl融合基因，因此，Bcr-abl融合基因被公認為是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)［1］。當(dāng)前，盡管CML一線臨床用藥特異性針對Bcr-abl蛋白的酪氨酸激酶抑制劑如格列衛(wèi)等能有效緩解CML［2］，但由于LSCs不依賴Bcr-abl的蛋白激酶活性存活［3］，導(dǎo)致酪氨酸激酶抑制劑不能徹底清除LSCs而無法治愈CML。因此，探索與LSCs生存和自我更新等重要生物學(xué)功能密切相關(guān)的特異性分子，闡明其分子作用機制，以及研發(fā)相應(yīng)藥物對于清除LSCs進而根治CML具有極其重要的臨床意義。然而，由于當(dāng)前我國缺乏適用于LSCs研究的CML動物模型，使得我國在CML的致病機理研究以及針對LSCs治療CML的藥物研發(fā)方面遠遠落后于國際水平。因此，本研究從南京生物模式研究院分別購入Bcr-abl、SCL-tTA和GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，通過雜交的方法獲得GFP/SCL-tTA/Bcr-abl三轉(zhuǎn)基因小鼠；然后，通過將其骨髓細胞移植至經(jīng)致死劑量輻照的FVB/N野生型小鼠，建立可追蹤的、發(fā)病時間和程度相似的CML嵌合小鼠模型，為我國在以LSCs為靶點治療CML的藥物研發(fā)與機制研究方面奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級FVB.Cg-Tg（Tal1-tTA）轉(zhuǎn)基因小鼠（以下簡稱SCL-tTA小鼠），雄性1只，雌性2只；FVB/N-Tg（tetO-BCR-ABL1）轉(zhuǎn)基因小鼠（以下簡稱 Bcr-abl小鼠），雄性 1只，雌性 2只；C57BL/6-Tg（CAG-GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠（以下簡稱GFP小鼠），雄性1只，雌性2只；FVB/N野生型小鼠，雄性2只，雌性3只，體質(zhì)量18～22 g，4～8周齡，均購于南京生物模式研究院，動物合格證號:201400371 （SCL-tTA 小鼠）、2014000146（Bcr-abl小鼠）、201501174（GFP小鼠）。所有動物均飼養(yǎng)于廣東藥學(xué)院實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)室［SYXK（粵）2012-0125］。

1.1.2主要儀器 PCR儀（美國ABI公司）；凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；BD FACSalibur流式細胞儀（美國BD公司）。

1.1.3主要試劑 DNA提取試劑盒（北京天根公司）；Taq預(yù)混PCR酶（美國Promega公司）；DL2000 DNA marker（日本TaKaRa公司）；多西環(huán)素（美國TOKU-E公司）；抗鼠流式抗體LY6G-PE、C-Kit-PE 和Sca-1-APC（美國eBioscience公司）；CD11b-APC抗體（美國Biolegend公司）；Lin-PerCP-CY5.5抗體（美國BD公司）；c-abl抗體（美國CST公司）；βactin抗體（武漢博士德公司）。

1.2方法

1.2.1子代小鼠的正常繁殖培養(yǎng) 3種單轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠自交繁殖，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，喂食標(biāo)準飼料和飲用無菌水，每天光照12 h。

1.2.2子代小鼠的雜交繁殖培養(yǎng) SCL-tTA和Bcrabl轉(zhuǎn)基因小鼠雜交所得子代鼠進行DNA鑒別，篩選出SCL-tTA/Bcr-abl雙轉(zhuǎn)小鼠。雙轉(zhuǎn)小鼠和GFP轉(zhuǎn)基因小鼠雜交并進行DNA鑒別，篩選出GFP/ SCL-tTA/Bcr-abl三轉(zhuǎn)小鼠。雙/三轉(zhuǎn)小鼠自親代合籠交配即日起持續(xù)給予含多西環(huán)素（20 mg/L）的飲用水。三轉(zhuǎn)小鼠達5周齡后撤去多西環(huán)素4周誘導(dǎo)表達Bcr-abl融合蛋白。

1.2.3PCR檢測小鼠GFP、SCL-tTA和Bcr-abl基因 PCR篩選出SCL-tTA/Bcr-abl小鼠，再將其與GFP小鼠雜交，PCR檢測獲得 GFP/SCL-tTA/Bcrabl三轉(zhuǎn)基因小鼠。雜交子代小鼠達到3周齡以及FVB/N小鼠接受移植3周后，剪鼠尾約0.5 cm，使用DNA提取試劑盒按說明書步驟提取小鼠DNA。

鑒定所需引物序列均由南京生物模式研究院提供，由上海英濰捷基生物有限公司合成。引物序列見表1。

PCR反應(yīng)體系為:PCR預(yù)混液 12.5 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，模板DNA10 ng，加ddH2O至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 變性30 s，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃終延伸5 min；10℃保存2 h。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，采用凝膠成像儀進行分析。

表1　PCR檢測的3種基因的基因序列及長度Table 1 Primer sequences and product length of three genes detected by PCR

1.2.4小鼠骨髓移植 撤去多西環(huán)素誘導(dǎo)GFP/ SCL-tTA/Bcr-abl小鼠誘導(dǎo)Bcr-abl融合蛋白表達4周后，處死小鼠并取其股骨，分離骨髓，裂解紅細胞后得到白細胞，RPMI1640洗一遍后重懸，調(diào)整密度為1×107/mL。另取6～8周齡的FVB/N小鼠經(jīng)致死劑量（900 cGy）X射線輻照破壞其造血系統(tǒng)作為受體小鼠備用，24 h內(nèi)將上述白細胞按2×106/只移植到受體小鼠中。

1.2.5Western blotting檢測Bcr-abl融合蛋白 收集嵌合小鼠骨髓白細胞（1×106個），加入100 μL蛋白裂解液，裂解15 min，12 000 r/min離心10 min。取上清，加入5×蛋白loading buffer，置于沸水中煮10 min后上樣。樣品經(jīng)8%（ρ）聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫條件下5%脫脂奶粉封閉2 h，加入含5%BSA稀釋液稀釋的Bcr-abl（1∶1 000）、β-actin抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。洗膜后用ECL solution顯色，顯影、定影后掃描結(jié)果。

1.2.6嵌合小鼠腿骨及脾臟組織形態(tài)學(xué)檢查

FVB/N小鼠接受移植3周后，處死并解剖取腿骨及脾臟，觀察脾臟情況并稱質(zhì)量；制作石蠟切片并進行HE染色，觀察腿骨及脾臟結(jié)構(gòu)和白細胞浸潤情況。1.2.7 流式細胞儀檢測嵌合小鼠GFP+中性粒細胞和GFP+LSCs比例 收集小鼠外周血、脾臟和骨髓，加紅細胞裂解液處理后，分離獲得總白細胞，制成單細胞懸液，每份5×105細胞。根據(jù)需要加入相應(yīng)的流式抗體孵育，調(diào)整細胞數(shù)為1×106個細胞/mL，然后上流式細胞儀進行檢測。中性粒細胞標(biāo)記抗體是:CD11b-APC和Ly6G-PE，LSCs標(biāo)記抗體是:Lin-Percp-5.5、c-Kit-PE及Sca-1-APC。

1.2.8統(tǒng)計分析 采用Graph Prism5.0軟件包，實驗數(shù)據(jù)用表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PCR鑒定GFP/SCL-tTA/Bcr-abl嵌合小鼠

圖1結(jié)果顯示:子代小鼠中同一小鼠能同時檢測到GFP、SCL-tTA和Bcr-abl基因，表明GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠雜交成功。

圖1　PCR鑒定GFP/SCL-tTA/Bcr-abl三轉(zhuǎn)基因小鼠Figure 1 Identification of GFP/SCL-tTA/Bcr-abl mice by PCR

圖2結(jié)果顯示:將GFP/SCL-tTA/Bcr-abl小鼠骨髓白細胞經(jīng)尾靜脈注射移植給FVB/N受體小鼠。3周后PCR檢測移植后受體鼠同時表達GFP、SCL-tTA、Bcr-abl，則表明供體細胞已經(jīng)植入FVB/N受體小鼠，即為GFP/SCL-tTA/Bcr-abl嵌合小鼠。

圖2　PCR檢測移植小鼠的GFP、tTA和Bcr-abl基因Figure 2 Expression of GFP，tTA and Bcr-abl genes detected by PCR

2.2Western blotting檢測嵌合小鼠Bcr-abl蛋白的表達

取GFP/SCL-tTA/Bcr-abl嵌合小鼠的骨髓白細胞提取蛋白質(zhì)，通過Western blotting檢測Bcr-abl蛋白的表達。結(jié)果如圖3所示，嵌合小鼠骨髓白細胞中表達Bcr-abl蛋白。

圖3　Western blotting檢測Bcr-abl蛋白的表達Figure 3 Expression of Bcr-abl protein detected by western blotting

2.3流式細胞術(shù)檢測嵌合小鼠GFP+中性粒細胞和GFP+LSCSs比例

取嵌合小鼠骨髓、脾臟和外周血白細胞，流式細胞儀檢測外周血GFP+中性粒細胞（GFP+CD11b+Ly6G+）以及脾臟和骨髓GFP+LSCs（GFP+Lin-Sca1 +c-Kit+，GFP+LSK）的比例。結(jié)果顯示，移植小鼠GFP+中性粒細胞在外周血中的比例與GFP小鼠相比顯著升高（從12.6%升高至63.4%，圖4）；移植小鼠GFP+LSCs在脾臟和骨髓中的比例與GFP小鼠相比同樣顯著增高（脾臟:從0.01%升高至0.15%；骨髓:從0.12%升高至0.18%，圖5）。

2.4嵌合小鼠腿骨及脾臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

與GFP小鼠脾臟相比，嵌合小鼠出現(xiàn)了明顯的脾腫大，脾臟質(zhì)量顯著增加（P＜0.01，圖6）；HE染色結(jié)果顯示，嵌合小鼠脾臟被不同分化階段的白血病性粒細胞彌漫浸潤，脾小體萎縮或消失，部分可見痕跡殘留（圖7A）；骨髓增生活躍，粒系高度增生，主要為不同成熟程度的中性粒細胞及嗜酸性粒細胞，同時伴有骨髓纖維化病理改變（圖7B）。

3　討論

目前，國內(nèi)制備CML動物模型的方法主要有2 種:第1種是用CML患者的白血病細胞種植經(jīng)亞致死劑量照射的SCID或NOD/SCID鼠［4-5］；第2種是用表達Bcr-abl基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠骨髓細胞并移植入經(jīng)亞致死劑量照射的小鼠體內(nèi)［6-8］。顯然，這些方法對于研究起源于LSCs的CML并不適用。

Huettner等［9］初次建立了四環(huán)素反應(yīng)元件（tetracyclineresponsitiveelement，TRE）調(diào) 控P210bcr/abl表達的轉(zhuǎn)基因動物模型——TRE-Bcrabl轉(zhuǎn)基因鼠。當(dāng)四環(huán)素或多西環(huán)素不存在時，四環(huán)素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活因子（tetracycline controled tanscriptional activator，tTA）與 TRE結(jié)合激活啟動子，啟動Bcr-abl基因的表達；當(dāng)四環(huán)素或多西環(huán)素存在時，tTA的構(gòu)象發(fā)生變化并不與TRE結(jié)合，Bcrabl基因則不能表達。隨后，Koschmieder等［10］利用鼠T細胞急性淋巴瘤白血病1基因（Tal1）（又稱為人干細胞白血病基因，stem cell leukemia，SCL）的3'端的增強子成功構(gòu)建了在小鼠的造血干細胞和祖細胞中特異性表達tTA的SCL-tTA小鼠。因此，SCL-tTA小鼠與 Bcr-abl小鼠雜交后的子代小鼠——SCL-tTA/Bcr-abl雙轉(zhuǎn)基因小鼠在沒有攝入四環(huán)素或多西環(huán)素的情況下可在骨髓造血干/祖細胞持續(xù)表達Bcr-abl蛋白，從而誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)類似于人類CML的綜合癥［10］。但是，由于每個個體間存在一定的遺傳差異，不同的SCL-tTA/Bcr-abl小鼠的LSCs比例、發(fā)病的時間及程度會出現(xiàn)有較大的不同。因此，SCL-tTA/Bcr-abl小鼠仍然不是LSCs靶向藥物研究的理想模型。建立一種LSCs比例相近、發(fā)病時間及程度相似的CML模型對于LSCs的靶向藥物研發(fā)尤為重要。

本研究從南京大學(xué)模式動物研究所分別引進了SCL-tTA和Bcr-abl以及GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，經(jīng)雜交獲得了GFP/SCL-tTA/Bcr-abl三轉(zhuǎn)基因小鼠。然后，將多個GFP/SCL-tTA/Bcr-abl三轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細胞合并后均分，分別移植至經(jīng)致死劑量（900 cGy）X射線輻照FVB/N小鼠中。通過該方法能一次制作大量的移植小鼠，這些小鼠無論是LSCs比例，還是發(fā)病的時間及程度均較為一致。同時，由于供體小鼠細胞帶有GFP熒光蛋白，能很好與受體小鼠細胞區(qū)分開來，有利于追蹤供體細胞的狀況。Western blotting檢測結(jié)果顯示移植小鼠的骨髓細胞中的確表達Bcr-abl蛋白。流式細胞儀檢測結(jié)果也顯示，GFP+中性粒細胞在移植小鼠外周血中的比例以及GFP+LSCs（GFP+Lin-Sca1+c-kit+細胞）在骨髓細胞中的比例均明顯高于GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。這些結(jié)果均表明成功構(gòu)建了適用于針對LSCs研究的CML動物模型——GFP/SCL-tTA/Bcr-abl嵌合小鼠。事實上，該模型已經(jīng)成功運用于CML LSCs靶向藥物的多項體內(nèi)研究［11-15］。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了GFP/SCL-tTA/ Bcr-abl嵌合小鼠，該模型的建立將為CML的防治研究提供重要的平臺，對于我國在CML發(fā)病機理研究和LSCs靶向藥物研發(fā)方面具有重要的促進作用。

圖4　GFP小鼠和嵌合小鼠外周血GFP+中性粒細胞的比例Figure 4 Percentage of GFP+myeloid analyzed by flow cytometry

圖5　流式細胞術(shù)檢測GFP小鼠和嵌合小鼠脾臟和骨髓GFP+LSCs的比例Figure 5 Percentage of GFP+LSCs in spleen and BM analyzed by flow cytometry

圖6　GFP小鼠和嵌合小鼠脾臟Figure 6 Weight of spleen in GFP mice and CML chimeric mice

圖7　GFP小鼠和嵌合小鼠脾臟（A）及骨髓（B）HE染色（100×）Figure 7 HE staining of spleen（A）and BM（B）in GFP mice and CML chimeric mice（100×）

［1］REN R.Mechanisms of Bcr-abl in the pathogenesis of chronic myelogenous leukaemia［J］.Nat Rev Cancer，2005，5（3）:172-183.

［2］DRUKER B J，GUILHOT F，O′BRIEN S G，et al.Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia［J］.N Engl J Med，2006，355（23）:2408-2417.

［3］CORBIN A S，AGARWAL A，LORIAUX M，et al.Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of Bcr-abl activity［J］.J Clin Invest，2011，121（1）:396-409.

［4］黎陽，張緒超，黃紹良，等.小劑量K562細胞NOD/SCID小鼠動物模型的建立［J］.中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2005，26（5）:523-527.

［5］文良雪，劉鑫，李會，等.KCL22/NOD-SCID小鼠慢性粒細胞白血病移植瘤模型的建立及其鑒定［J］.中國實驗動物學(xué)報，2015，23（2）:188-193.

［6］張文萍.Bcr/abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠慢性粒細胞白血病樣模型的建立［D］.重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2008.

［7］李婧.采用逆轉(zhuǎn)錄病毒技術(shù)建立人慢性粒細胞性白血病小鼠模型［D］.杭州:浙江大學(xué)，2011.

［8］潘勤，金紅，李婧，等.類人慢性粒細胞性白血病小鼠模型的建立［J］.中國病理生理雜志，2013，29（8）:1530-1536.

［9］HUETTNER C S，ZHANG P，VAN ETTEN R A，et al. Reversibility of acute B-cell leukaemia induced by BCRABL［J］.Nat Genet，2000（24）:57-60.

［10］KOSCHMIEDER S，GOTTGENS B，ZHANG P，et al. Induciblechronicphaseofmyeloidleukemiawith expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of Bcr-abl leukemogenesis［J］.Blood，2005，105 （1）:324-334.

［11］ZHANG B，STRAUSS AC，CHU S，et al.Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate［J］.Cancer Cell，2010，17（5）:427-442.

［12］REYNAUD D，PIETRAS E，BARRY-HOSLON K，et al. IL-6 controls leukemic multipotent progenitor cell fate and contributes to chronic myelogenous leukemia development ［J］.Cancer Cell，2011，20（5）:661-673.

［13］LI L，WANG L，WANG Z，et al.Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib［J］.Cancer Cell，2012，21（2）:266-281.

［14］ZHANG B，HO Y W，HUANG Q，et al.Altered microenvironmental regulation of leukemic and normal stem cells in chronic myelogenous leukemia［J］.Cancer Cell，2012，21 （4）:577-592.

［15］NEVIANI P，HARB JG，OAKS JJ，et al.PP2A-activating drugs selectively eradicate TKI-resistant chronic myeloid leukemic stem cells［J］.J Clin Invest，2013，123（10）: 4144-4157.

（責(zé)任編輯：幸建華）

Establishment of CML chimeric model by GFP/SCL-tTA/Bcr-abl transgenic mice

LIAO Fenfang，CHEN Yongheng，WU Qingqing，CHENG Lin，ZHOU Xiaoming，WANG Weizhang
（School of Basic Courses and Guangdong Province Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To establish a chronic myeloid leukemia（CML）chimeric mouse model，and provide a good animal model for the study of CML treatment by eliminating leukemia stem cells（LSCs）.Methods SCL-tTA mice were crossed with Bcr-abl mice，and then the resulting filial generation mice were crossed with transgenic GFPexpressing mice.GFP/SCL-tTA/Bcr-abl transgenic mice were identified by polymerase chain reaction（PCR）with GFP，tTA and Bcr-abl gene-specific primers.Bone marrow cells from GFP/SCL-tTA/Bcr-abl transgenic mice were transplanted into lethally irradiated（900 cGy）FVB/N wild type recipient mice via tail vein injection.The expression of Bcr-abl protein in bone marrow（BM）from GFP/SCL-tTA/Bcr-abl transgenic mice and recipient mice after doxycycline withdrawal for 4 weeks was analyzed by western blotting.The percentage of GFP+myeloid in peripheral blood，and GFP+primitive stem/progenitor cells（LSK cells）in spleen and BM in recipient mice was measured by flow cytometry. Results Bone marrow cells from GFP/SCL-tTA/Bcr-abl transgenic mice were successfully transplanted into FVB/N wild type recipient mice.Bcr-abl protein was expressed in BM of the recipient mice.Thepercentage of GFP+myeloid in peripheral blood，and GFP+primitive stem/progenitor cells（LSK cells）in spleen and BM in recipient mice was increased compared to that in GFP mice.Conclusion CML chimeric model by GFP/SCL-tTA/Bcr-abl transgenic mice has been successfully established.

chronic myeloid leukemia；transgenic mice；Bcr-abl

R-332

A

1006-8783（2016）04-0512-06

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016050902

2016-05-09

國家自然青年科學(xué)基金項目（81100369）；廣東省自然科學(xué)基金項目（2014A030313580）；廣東省科技計劃項目（2013B021800084）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（1057313028）

廖芬芳（1988—），女，2014級碩士研究生；通信作者:王偉章（1979—），男，副教授，主要從事腫瘤藥理研究，Email: wwzss@163.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-04 14:54 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160704.1454.001.html