產(chǎn)果膠酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

盧曉華，楊 苗，王常高，林建國，杜 馨，蔡 ?。ê惫I(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點實驗室和工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

產(chǎn)果膠酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

盧曉華，楊 苗，王常高，林建國，杜 馨，蔡 俊*
（湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點實驗室和工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

為了得到產(chǎn)果膠酶菌株，采用含有以果膠為唯一碳源的溴酚藍平板，結(jié)合DP/DC值、平板顏色變化和搖瓶發(fā)酵后果膠酶活力的測定等方法進行篩選；對篩選到的菌株XHV25進行菌落形態(tài)特征、顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和18S rRNA、ITS、26S rRNA基因序列的測定與分析；通過單因素實驗優(yōu)化菌株XHV25產(chǎn)果膠酶的發(fā)酵條件。菌株XHV25的果膠酶活力可達到2937.34 U/mL；經(jīng)鑒定該菌株XHV25為囊酵母（Zygoascus sp.）；其最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基初始pH為5.5，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為4%（v/v），裝液量為25 mL/250 mL，發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵時間為48 h；在此發(fā)酵條件下果膠酶活力為4849.90 U/mL，較優(yōu)化前顯著提高了65.11%。

果膠酶，篩選，鑒定，囊酵母（Zygoascus sp.），產(chǎn)酶條件優(yōu)化

果膠是植物中由一系列包含部分甲基酯化的半乳糖醛酸亞單位通過α-1，4-糖苷鍵連接的復(fù)雜結(jié)構(gòu)多糖［1］。果膠酶是能分解果膠物質(zhì)的復(fù)合酶類的總稱。按果膠酶對果膠底物作用的方式可分為四類：聚半乳糖醛酸酶、原果膠酶、裂解酶和果膠酯酶［2］。多年來，果膠酶已應(yīng)用于幾種傳統(tǒng)的工業(yè)生產(chǎn)過程，例如果汁果酒的生產(chǎn)提取，紡織加工和棉纖維的生物煮練，植物韌皮纖維麻類脫膠，廢水處理，咖啡和茶發(fā)酵，動物飼料，植物病毒的純化，石油開采，飲料和葡萄酒［3-6］。

果膠酶可從植物或諸如真菌和細菌等的微生物中分離得到［7-8］，但天然來源于植物的果膠酶產(chǎn)量低且不易提取，難以大規(guī)模制備。目前微生物已成為生產(chǎn)果膠酶的優(yōu)良生物資源，主要包括黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、米根霉（Rhizopus oryzae）等［9-11］，其中黑曲霉也已成為工業(yè)生產(chǎn)果膠酶最為安全常見的真菌菌種［12］，但果膠酶的產(chǎn)量和質(zhì)量依然不能滿足食品工業(yè)的需求。選育新的高產(chǎn)果膠酶優(yōu)良菌種，成為果膠酶工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。

近年來，研究產(chǎn)果膠酶的微生物主要集中在黑曲霉和枯草芽孢桿菌等，但極少有報道利用酵母產(chǎn)果膠酶相關(guān)的研究。本文采用以果膠為唯一碳源的平板篩選到一株產(chǎn)果膠酶的酵母菌株XHV25，并通過單因素實驗優(yōu)化該菌株產(chǎn)果膠酶的發(fā)酵條件，以期選育出高產(chǎn)果膠酶菌株，為果膠酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橙子皮粉 自制過100目篩；果膠和半乳糖醛酸 Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；溴酚藍 Amresco；富集培養(yǎng)基 牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖3 g，NaCl 1 g，MgSO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO40.5 g，水1000 mL；初篩培養(yǎng)基 果膠5 g，NaNO33 g，NaCl 1 g，MgSO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO40.5 g，溴酚藍0.1 g，瓊脂20 g，水1000 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基：桔皮粉20 g，蛋白胨5 g，NaCl 1 g，MgSO41 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KH2PO40.5 g，水1000 mL；種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，水1000 mL；YPD培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，瓊脂20 g，水1000 mL；其他試劑 均為分析純。

PHS-25 pH計 上海雷磁；3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；SynergyTM2多功能酶標儀 BioTek。

1.2 實驗方法

1.2.1 初篩 取樣品約10 g置于適量無菌生理鹽水中，充分攪拌靜置后吸取4 mL接種于100 mL富集培養(yǎng)基，30℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h。取富集培養(yǎng)后的菌懸液0.5 mL做適當(dāng)梯度稀釋，再取不同稀釋度的菌懸液0.1 mL涂布于初篩培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后，挑選出能使溴酚藍平板生成黃色圈的單菌落，進行菌株的劃線分離純化［13］；將純化好的菌株劃線接種于初篩平板上培養(yǎng)60 h后，測量其變色圈直徑（Dp）和菌落直徑（Dc），挑選出Dp/Dc值較大的菌株作復(fù)篩的出發(fā)菌株［14］。

1.2.2 復(fù)篩 取上述初篩所得到的Dp/Dc值較大的菌株接種于液態(tài)初篩培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h后，再取3 mL培養(yǎng)液接種于50 mL/250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液9000 r/min離心15 min后，吸取上清液適當(dāng)稀釋作稀釋粗酶液，采用DNS法使用酶標儀測定稀釋粗酶液的果膠酶活力，篩選出酶活力較高的菌株。

1.2.3 菌株鑒定和保藏 菌株鑒定和保藏由中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）執(zhí)行。鑒定內(nèi)容包括：微生物菌株的形態(tài)特征，18S rRNA基因序列、ITS序列和26S rRNA基因序列的測定與分析，微生物菌株碳源氧化和利用檢測。菌株XHV25已于2015年3月31日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2015183。

1.2.4 粗酶液的制備 取上述篩選出的菌株接種于種子培養(yǎng)基，置于30℃、160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)14 h，此時種子培養(yǎng)液的菌體細胞達108個/mL。取3 mL（接種量6%）種子培養(yǎng)液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。4℃、8000 r/min離心15 min后取上清液即得粗酶液。

1.2.5 酶活測定

1.2.5.1 半乳糖醛酸標準曲線的繪制 取標準D-半乳糖醛酸溶液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，分別置于11支25 mL具塞比色管中，分別用蒸餾水補足至2 mL，各加入DNS試劑［14］3 mL，置沸水浴中煮沸10 min，然后以流動水迅速冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻，各取0.2 mL于96孔板中，用酶標儀在540 nm處測定吸光度，以吸光值（A）為橫坐標，半乳糖醛酸濃度（B，mg/mL）為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程為B=0.23×A-0.03（R2=0.9940）。

1.2.5.2 酶液酶活的測定 吸取1.8 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的果膠底物溶液（用pH為5.0的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液配制）于具塞比色管中，加入0.2 mL稀釋粗酶液，50℃水浴精確反應(yīng)30 min后取出，加入3 mL DNS試劑混勻后立即用沸水浴10 min滅活，定容至25 mL；以煮沸滅活的粗酶稀釋液作為空白對照［15-16］。用酶標儀在波長540 nm處測OD值。果膠酶活力的定義：在上述反應(yīng)條件（50℃，pH5.0）下，1 mL酶液每分鐘水解果膠底物生成1 μg半乳糖醛酸的能力定義為1個酶活力單位D（U）。

D=（B×C×1000）/（0.2×30）

式中，C為粗酶液的稀釋倍數(shù)，D為酶活（U）。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)酶條件實驗 初始發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間48 h，初始pH為6.0，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，接種量6%（v/v），裝液量50 mL/250 mL。

采用單因素實驗研究了初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量、發(fā)酵周期、發(fā)酵溫度對菌株XHV25產(chǎn)果膠酶活力的影響。

1.2.6.1 初始pH的單因素實 調(diào)整初始pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件。研究初始pH對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.2 搖床轉(zhuǎn)速的單因素實驗 初始pH取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果，調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速分別為140、160、180、200、220 r/min，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件。研究搖床轉(zhuǎn)速對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.3 接種量的單因素實驗 初始pH和搖床轉(zhuǎn)速取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果，調(diào)整接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%（v/v），其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件。研究接種量對對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.4 裝液量的單因素實驗 初始pH、搖床轉(zhuǎn)速和接種量取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果，采用250 mL搖瓶裝液，調(diào)整搖瓶裝液量分別為12.5、25、37.5、50、62.5、75 mL，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件。研究裝液量對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力的影響，每組三個平行，并通過SPSS作不同裝液量對酶活的差異顯著性分析。

1.2.6.5 發(fā)酵溫度的單因素實驗 初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果，調(diào)整發(fā)酵溫度分別為25、28、31、34、37、40℃，其他發(fā)酵條件為初始發(fā)酵條件。研究發(fā)酵溫度對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.2.6.6 發(fā)酵時間的單因素實驗 初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量和發(fā)酵溫度取上述實驗確定的最優(yōu)結(jié)果，調(diào)整發(fā)酵時間分別為12、24、36、48、60、72、84 h。研究發(fā)酵溫度對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力的影響，每組三個平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用軟件Origin 8繪制出發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化的各個單因素圖。用SPSS進行差異顯著性分析，p＜0.05差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

2.1.1 初篩 初篩是根據(jù)菌株生長時利用果膠使平板產(chǎn)生變色圈（水解圈）的能力，挑選出Dp/Dc值較大的菌株作為復(fù)篩的出發(fā)菌株。最終篩選得到的菌株中有24株降解果膠能力較好的菌株，其水解圈和菌落直徑結(jié)果見表1。通過平板菌落觀察，發(fā)現(xiàn)菌株38、40的菌落由中間致密的一點向外蔓延著不規(guī)則的絲絨狀菌絲，可初步確定為放線菌；菌株b1、q3的菌落形態(tài)較大，菌絲質(zhì)地疏松，不透明，呈白色絨毛棉絮狀，可初步確定為霉菌；菌株hq1、hq2的菌落形態(tài)較大，菌絲呈疏松的黑色蛛網(wǎng)狀交織，與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑起，可初步確定為霉菌；其他菌株在以果膠為唯一碳源的初篩平板上呈白色，邊緣齒狀不規(guī)則，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后菌體從中心向外由白色變黑色。部分菌株如b1、v25的變色圈（水解圈）見圖1、圖2。菌株v25的菌落呈白色凸起狀，較濕潤，質(zhì)地均勻，邊緣略呈齒狀不規(guī)則，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后菌體從中心向外由白色變黑色；圍繞菌落周圍由紫色變成直徑大小不一的黃色圈，其變黃的程度也有所差異。

2.1.2 復(fù)篩 將初篩得到的24株菌株在斜面活化后制備種子液，接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵后測定粗酶液的果膠酶活力，其果膠酶活力見表2。其中菌株v25的果膠酶活力最大，為2937.34 U/mL，將菌株v25重新命名為XHV25。

圖1 菌株b1的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of strain b1

圖2 菌株v25的變色圈Fig.2 Discoloration circle of strain v25

2.1.3 菌株的鑒定 菌株XHV25在YPD平板上的菌落呈圓形，乳白色，表面光滑濕潤，豐厚粘稠，邊緣較整齊，其顯微鏡和平板菌落觀察分別見圖3、圖4。對菌株XHV25的18S rRNA、ITS、26S rRNA基因序列進行測定后再在NCBI中使用Blast進行比對，發(fā)現(xiàn)XHV25的ITS序列與Zygoascus meyerae（HM450996.1，GenBank）、Z.hellenicus（AY447034.1，GenBank）具有99%的相似度；XHV25和Z.meyerae、Z.hellenicus的18S rRNA、26S rRNA基因序列同源性最高，根據(jù)以上結(jié)果分析確定菌株XHV25為囊酵母（Zygoascus sp.）。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

表1 水解圈直徑（Dp）與菌落直徑（Dc）比值Table1 Hydrolysis circle diameter（Dp）and colony diameter（Dc）ratio

2.2.1 培養(yǎng)基初始pH對果膠酶活力的影響 由圖5可知，隨著pH的增大菌株XHV25所產(chǎn)果膠酶的酶活逐漸增加，在pH為5.5時酶活達到最大值為3096.38 U/mL。隨pH數(shù)值的進一步增大，果膠酶的酶活反而逐漸減少，說明此菌在弱酸性的條件下，比較適合產(chǎn)酶，pH過高或過低對產(chǎn)酶都會產(chǎn)生很大的抑制作用。據(jù)方差分析，培養(yǎng)基初始pH對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

表2 24株菌株所產(chǎn)的果膠酶活力Table2 Pectinase activity of 24 strains produced

圖3 菌株XHV25顯微鏡（400×）Fig.3 Strain XHV25 microscope observed（400×）

圖4 菌株XHV25平板菌落觀察Fig.4 Strains XHV25 colony observed

2.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對果膠酶活力的影響 由圖6可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時，菌株XHV25所產(chǎn)果膠酶的酶活達到最大值為3427.27 U/mL。隨轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增大，酶活趨于稍微降低。據(jù)方差分析，搖床轉(zhuǎn)速對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖5 培養(yǎng)基初始pH對果膠酶活力的影響Fig.5 Effect of initial pH on pectinase activity

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對果膠酶活力的影響Fig.6 Effect of rotating speed on pectinase activity

2.2.3 接種量對果膠酶活力的影響 由圖7可知，當(dāng)接種量為4%（v/v）時，菌株XHV25所產(chǎn)果膠酶的酶活達到最大值為3570.94 U/mL。此后，隨著接種量的增大酶活逐漸下降，可能是因為接種量的增大導(dǎo)致發(fā)酵液中菌體濃度過高，導(dǎo)致菌體生長旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，溶氧不足，代謝受抑制，致使產(chǎn)酶能力降低。據(jù)方差分析，接種量對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖7 接種量對果膠酶活力的影響Fig.7 Effect of inoculum concentration on pectinase activity

2.2.4 裝液量對果膠酶活力的影響 由圖8可知，當(dāng)裝液量為25 mL/250 mL時，菌株XHV25所產(chǎn)果膠酶的酶活達到最大值為4562.30 U/mL，此時發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧最適合菌體生長和代謝產(chǎn)酶。在最適裝液量25 mL/250 mL以后，隨著裝液量的增大，酶活明顯逐漸降低，可能是因為發(fā)酵體系溶氧不足，或菌體生長與代謝產(chǎn)酶失去平衡，從而代謝產(chǎn)酶過程受抑制。據(jù)方差分析，裝液量對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖8 裝液量對果膠酶活力的影響Fig.8 Effect of loading volume on pectinase activity

2.2.5 發(fā)酵溫度對果膠酶活力的影響 由圖9可知，當(dāng)溫度為31℃時，菌株XHV25所產(chǎn)果膠酶的酶活達到最大值為4654.32 U/mL，但當(dāng)溫度進一步增大時，酶活極速下降，可能是因為溫度過高，不利于代謝產(chǎn)酶。據(jù)方差分析，發(fā)酵溫度對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖9 發(fā)酵溫度對果膠酶活力的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on pectinase activity

2.2.6 發(fā)酵時間對果膠酶活力的影響 由圖10可知，在發(fā)酵時間為48 h時，菌株XHV25所產(chǎn)果膠酶的酶活達到最大值為4849.90 U/mL。發(fā)酵初期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體的生長，代謝產(chǎn)物積累較少。此后，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長，酶活略微降低，可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡及代謝產(chǎn)物的大量積累，導(dǎo)致菌體自溶。據(jù)方差分析，發(fā)酵時間對囊酵母（Zygoascus sp.）產(chǎn)果膠酶活力具有顯著性影響（p＜0.05）。

圖10 發(fā)酵時間對果膠酶活力的影響Fig.1 0 Effect of fermentation time on pectinase activity

3 結(jié)論

本研究采用含有以果膠為唯一碳源的溴酚藍平板分離得到產(chǎn)果膠酶的菌株，通過測定各菌株所產(chǎn)果膠酶活力復(fù)篩選出產(chǎn)果膠酶菌株XHV25，其酶活可達到2937.34 U/mL。通過對菌株XHV25進行菌落形態(tài)特征、顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和18S rRNA、ITS、26S rRNA基因序列的測定與分析，確定該菌株XHV25為囊酵母屬（Zygoascus sp.）。該菌株已于2015年3月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2015183。通過單因素實驗確定該菌株的最適發(fā)酵產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基初始pH為5.5，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為4%，裝液量為25 mL/250 mL，發(fā)酵溫度為31℃，發(fā)酵時間為48 h，在此發(fā)酵條件下果膠酶活力可達4849.90 U/mL，較優(yōu)化前顯著提高了65.11%。

［1］Silva E G，Borges M D F，Medina C，et al.Pectinolytic Enzymes Secreted By Yeasts From Tropical Fruits［J］.Fems Yeast Research，2006，5（9）：859-865.

［2］Jayani R S，Saxena S，Gupta R.Microbial pectinolytic enzymes：A review［J］.Process Biochemistry，2005，40（9）：2931-2944.

［3］Wu R，He B H，Zhao G L，et al.Immobilization of pectinase on oxidized pulp fiber and its application in whitewater treatment.［J］.Carbohydrate Polymers，2013，97（2）：523-529.

［4］Ahlawat S，Dhiman S S，Battan B，et al.Pectinase production by Bacillus subtilis and its potential application in biopreparation of cotton and micropoly fabric［J］.Process Biochemistry，2009，44 （5）：521-526.

［5］Amid M，Abdul Manap M Y，Mustafa S.Purification of pectinase from mango（Mangifera indica L.cv.Chokanan）waste using an aqueous organic phase system：a potential low cost source of the enzyme.［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，931（14）：17-22.

［6］Alimardani-Theuil P，Gainvors-Claisse A，Duchiron F.Yeasts：An attractive source of pectinases—From gene expression to potential applications：A review［J］.Process Biochemistry，2011，46（8）：1525-1537.

［7］Gonc-alves D B，Teixeira J A，Bazzolli D M S，et al.Use of response surface methodology to optimize production of pectinasesby recombinant Penicillium griseoroseum T20［J］.Biocatalysis&Agricultural Biotechnology，2012，1：140-146.

［8］張紅霞，江曉路，牟海津，等.微生物果膠酶的研究進展［J］.生物技術(shù)，2005，15（5）：92-94.

［9］Meneghel L，Reis G P，Reginatto C，et al.Assessment of pectinase production by Aspergillus oryzae in growth-limiting liquid medium under limited and non-limited oxygen supply［J］.Process Biochemistry，2014，49：1800-1807.

［10］湯鳴強，戴智欽.桔子園土壤中果膠分解菌的分離及其特性［J］.中國釀造，2009，202（1）：55-58.

［11］Ibrahim D，Weloosamy H，Sheh L.Potential use of nylon scouring pad cubes attachment method for pectinase production by Aspergillus niger HFD5A-1［J］.Process Biochemistry，2014，49（4）：660-667.

［12］Esawy M A，Gamal A A，Kamel Z，et al.Evaluation of free and immobilized Aspergillus niger NRC1ami pectinase applicable in industrial processes［J］.Carbohydr Polym，2013，92（2）：1463-1469.

［13］張飛，岳田利，費堅，等.果膠酶活力的測定方法研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2004，13（4）：134-137.

［14］張浩森，繆靜，余曉斌，等.果膠酶高產(chǎn)菌株的篩選及產(chǎn)酶條件的研究［J］.生物學(xué)雜志，2008，25（1）：28-30.

［15］Miller G L.Use of DinitrosaIicyIic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar［J］.Analytical Chemistry，1959，31（3）：426-428.

［16］Zeni J，Cence K，Grando C E，et al.Screening of Pectinase-Producing Microorganisms with Polygalacturonase Activity［J］.Applied Biochemistry&Biotechnology，2011，163（3）：383-392.

Screening and identification of pectinase-producting strains and optimization of pectinase-producting condition

LU Xiao-hua，YANG Miao，WANG Chang-gao，LIN Jian-guo，DU Xin，CAI Jun*
（Key Laboratory of Fermentation Engineering（Ministry of Education），Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

To obtain the pectinase-producing strains，the bromophenol blue plate separation method which contains the pectin as the sole carbon source was used，combined with DP/DCvalue and flat color changes.The strains screened were inoculated for the liquid fermentation culture，and the activities were determinated，then screened again out a strain XHV25 with the pectinase activity of 2937.34 U/mL.Morphology，physiology and biochemistry research coupled with 18S rRNA，ITS，26S rRNA sequence and analysis indicates that the strain of XHV25 was Zygoascus sp.Single-factor method was used for optimizing the fermentation condition.The optimum pectinase-producting conditions were as follows:initial medium pH5.5，shaking speed 160 r/min，inoculum amount 4%（v/v），loading volume 25 mL/250 mL，optimum fermentation temperature 31℃，fermentation time 48 h.Under this fermentation conditions，pectinase activity reached 4849.90 U/mL，which was 65.11%higher than that of before optimization.

pectinase；screening；identification；Zygoascus sp.；optimization of fermentation conditions

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0189-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.030

2015－05－11

盧曉華（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：發(fā)酵過程優(yōu)化與放大，E-mail：924268082@qq.com。

*通訊作者：蔡?。?968-），男，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程，E-mail：caijun@mail.hbut.edu.cn。

湖北省自然科學(xué)基金重點項目（2009CDA059）。