蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對糖尿病SD大鼠腎臟的保護作用

董 媛，郭 健，李 艷，王 皓，劉 磊，朱 潔，王會巖（吉林醫(yī)藥學院，吉林吉林132013）

蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對糖尿病SD大鼠腎臟的保護作用

董 媛，郭 健，李 艷，王 皓，劉 磊，朱 潔，王會巖*
（吉林醫(yī)藥學院，吉林吉林132013）

本文通過鏈脲佐菌素建立早期糖尿病腎病大鼠模型，考察蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物高劑量組（2 g/kg·d、中劑量組（0.5 g/kg·d）和低劑量組（0.05 g/kg·d）灌胃給藥3周后，對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。實驗結果表明，與模型組相比，Cs-4高劑量組能夠緩解糖尿病大鼠體重的下降（p＜0.05），降低血糖、尿糖和尿微量白蛋白排泄率（p＜0.01）；對腎功能檢測指標結果表明，Cs-4能顯著降低血清尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、肌酐含量（p＜0.01），同時提高血清超氧化物轉(zhuǎn)化酶（SOD）活力（p＜0.01），丙二醛（MDA）含量明顯減少（p＜0.01）。腎臟組織切片HE染色結果也表明，Cs-4給藥后，腎臟炎癥細胞浸潤現(xiàn)象明顯減少，說明Cs-4提取物能夠很好的抗糖尿病和保護腎臟損傷。

蝙蝠蛾擬青霉，Cs-4，鏈脲佐菌素，糖尿病腎病

蝙蝠蛾擬青霉（Paccilomyces hepiali），是冬蟲夏草的無性型，從野生的冬蟲夏草子座分離得來［1］，收錄于2010版《中國藥典》［2］。其主要成分包括多糖、蟲草酸、蟲草素、維生素等［3］，發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)、軟化血管、鎮(zhèn)咳等多種功效［4］?，F(xiàn)代藥理研究還發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾擬青霉Cs-4發(fā)酵菌粉可調(diào)節(jié)血脂［5］，對鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）所致大鼠糖尿病有明顯降低血糖的作用［6］。臨床上已經(jīng)用于糖尿病的輔助治療［7］。但是其對糖尿病患者腎臟的保護作用還不是很明確。糖尿病腎?。―iabetesNephropathy，DN）是糖尿病常見的慢性微血管并發(fā)癥，其病因是腎組織中過多的葡萄糖積累，已成為糖尿病死亡的主要原因之一［7］。早期DN是治療的關鍵時期，此時患者表現(xiàn)為腎功能不全，但尚未達到透析治療的程度，目前仍然缺乏有效的治療手段和藥物［8］。本研究采用STZ誘導SD大鼠糖尿病早期腎病模型，考察蝙蝠蛾擬青霉菌粉Cs-4對糖尿病大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝙蝠蛾擬青霉Cs-4菌粉 購買于江蘇神華藥業(yè)有限公司；實驗動物 SD（Sprague Dawley）大鼠，清潔級，體重180～220 g，雄性，合格證號為SCXK-（吉）2013-0003，由長春生物制品研究所提供；鏈脲佐菌素（STZ）等 Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）、葡萄糖、肌酐、尿微量白蛋白測定試劑盒 購自南京建成生物科技有限公司。

DHP-908型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司；ELX800型酶標儀 美國BIOTEK公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物制備 依據(jù)文獻［9］制備Cs-4提取物。準確稱取100 g蝙蝠蛾擬青霉Cs-4菌粉熱水浸提，在溫度80℃，料液比1∶50條件下，提取2次，每次提取時間3 h，1500 r/min離心，合并上清，減壓濃縮后，所得浸膏即為水提粗提物（WE），置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，給藥前用適當生理鹽水稀釋至所需濃度，灌胃給藥。

1.2.2 蝙蝠蛾擬青霉成分分析 依照文獻［10］方法定性分析WE中化學成分的種類，對可能的活性物質(zhì)進行初步鑒定。鑒定項目包括：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、還原糖、糖類、鞣酸、酚類、生物堿類、甾醇類、環(huán)烯醚萜類、有機酸、油、揮發(fā)油、蒽醌類、黃酮類、香豆素和內(nèi)酯類化合物。

1.2.3 STZ誘導的糖尿病腎病大鼠模型的建立及分組 健康SD大鼠，禁食不禁水12 h，連續(xù)3次腹腔注射2%STZ，注射劑量為30 mg/kg·d。注射后3 h灌胃含25%葡萄糖0.8 mL/200 g；末次注射后尾靜脈采血，測空腹血糖，以血糖值≥11.1 mmol/L者作為糖尿病模型大鼠，喂養(yǎng)4周后，尿糖定性為（+++），尿微量白蛋白排泄率＞30 mg/24 h者為早期糖尿病腎病模型造模成功［11］。正常對照組注射等體積檸檬酸緩沖液（pH4.3）。將造模成功的大鼠按體重及血糖分為模型對照組、鹽酸二甲雙胍陽性對照組（Met，120 mg/kg·d）、提取物高劑量組（2 g/kg·d）、中劑量組（0.5 g/kg·d）和低劑量組（0.05 g/kg·d），每組10只。

1.2.4 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對大鼠糖尿病腎病的治療作用研究 連續(xù)灌胃給藥21 d，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水，分別于給藥第0、10、21 d，稱重，收集24 h尿液，依照文獻［11］測定尿糖和微量白蛋白排泄率，并尾靜脈取血，測定血清中空腹血糖濃度。末次給藥后，尾靜脈取血，測定血清SOD活力、MDA含量、BUN、UA、肌酐含量，測定方法見說明書。脫臼處死大鼠后，收集腎臟，4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片，HE染色觀察進行病理分析［12］。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 所有實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標準偏差SD表示。運用軟件Origin 8.5統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)。應用t檢驗法分析各組實驗數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差異，p≤0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 WE成分鑒定

熱水浸提法提取的是Cs-4菌絲體中的水溶性物質(zhì)，通過化學顯色反應，可以初步判定Cs-4水提物中成分的種類。結果如表1所示，Cs-4水提物中含有蛋白質(zhì)、多糖和有機酸類。這與2010版《中國藥典》中冬蟲夏草的主要成分一致。

表1 粗提物化學成分初步分析結果Table1 Summary of preliminary chemical analysis of crude extracts

2.2 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對大鼠糖尿病腎臟的保護作用

表2 給藥期間各組糖尿病大鼠的體重和空腹血糖結果（平均值±SD，n=10）Table2 Bodyweight and fasting blood glucose of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.1 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對糖尿病大鼠體重等指標的影響 糖尿病病癥有“三多一少”現(xiàn)象，為了考察Cs-4提取物的抗糖尿病腎病作用，采用STZ誘導大鼠糖尿病腎病模型，監(jiān)測糖尿病大鼠給藥3周期間的體重、尿糖、尿微量白蛋白排泄率和空腹血糖，結果如表2～表3所示。模型組建模后4項指標均與正常組存在顯著差異（p＜0.01），說明造模成功。經(jīng)過3周給藥后，Cs-4高劑量組能夠緩解糖尿病導致的大鼠體重減輕（p＜0.05），血糖下降54.8%，尿糖和微量白蛋白排泄率也明顯降低（p＜0.01），和陽性對照組效果相當；中劑量組與模型組相比，血糖、尿糖和微量白蛋白排泄率減少（p＜0.05），低劑量組和模型組相比沒有統(tǒng)計學上的差異（p＞0.05）。

表3 給藥期間各組糖尿病大鼠的尿糖和24 h微量白蛋白排泄率結果（平均值±SD，n=10）Table3 Urine sugar and urinary albumin excretion rate in 24 h of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.2 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對糖尿病大鼠腎功能的影響 經(jīng)Cs-4提取物治療3周后，各組糖尿病大鼠血清中的BUN、UA和肌酐含量結果如表4所示。模型組腎功能損傷明顯，與正常組相比，BUN、UA、肌酐含量存在顯著差異（p＜0.01）。通過Cs-4提取物給藥后，各項腎功能指標均有所降低，其中高劑量組治療效果最佳，與陽性對照藥接近，與模型組存在顯著差異（p＜0.01）。中劑量組與模型組相比，BUN降低（p＜0.01），UA和肌酐含量也有所降低（p＜0.05）。低劑量組和模型組相比沒有統(tǒng)計學上的差異（p＞0.05）。

表4 給藥期間各組糖尿病大鼠腎功能檢測指標結果（平均值±SD，n=10）Table4 Renal function tests of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.3 蝙蝠蛾擬青霉Cs-4提取物對糖尿病大鼠抗氧化能力的影響 SOD能清除體內(nèi)自由基，而MDA則是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，二者能夠反映出機體清除自由基的能力。糖尿病患者長期處于高血糖狀態(tài)，會增加體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，本實驗考察了糖尿病大鼠SOD和MDA兩項指標，結果如表5所示。經(jīng)Cs-4提取物給藥后，高劑量組大鼠血清SOD水平明顯提高，MDA含量也明顯降低，與模型組相比存在顯著差異（p＜0.01）；中劑量組與模型組相比，MDA含量也有所降低（p＜0.05），SOD水平有所提高（p＜0.05）。低劑量組和模型組相比沒有統(tǒng)計學上的差異（p＞ 0.05）。說明中劑量和高劑量的Cs-4提取物能夠增強大鼠抗氧化能力。

表5 給藥期間各組糖尿病大鼠抗氧化水平檢測結果（平均值±SD，n=10）Table5 Antioxidant levels of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.4 腎臟組織切片分析 各組大鼠腎臟組織切片如圖1所示。正常對照組（圖1A）大鼠的腎臟腎小球在切片上呈圓形，無明顯增大或縮小，系膜無增生，腎小管無萎縮。模型組糖尿病大鼠有典型的早期糖尿病腎病癥狀，腎小球、腎小管萎縮，大量炎癥細胞浸潤，腎系膜增生（圖1B）。經(jīng)過Cs-4治療3周后，從切片結果看，炎癥細胞浸潤明顯好轉(zhuǎn)，說明Cs-4對糖尿病腎病有一定的緩解作用。

圖1 糖尿病大鼠腎組織切片HE染色分析（×200）Fig.1 Histopathological analysis in l kidney collected from all experimental rats through HE staining（×200）

3 結論

冬蟲夏草作為傳統(tǒng)的中藥，在我國使用已有悠久的歷史。本文研究了冬蟲夏草無性型蝙蝠蛾擬青霉對糖尿病大鼠腎臟的保護作用，結果顯示，與模型組相比，Cs-4提取物，尤其是高劑量組可明顯降低糖尿病大鼠的空腹血糖、尿糖的含量，增加大鼠體重，具有統(tǒng)計學差異。此外，還能夠明顯降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白排泄率，降低大鼠血清中BUN、UA和肌酐含量，具有統(tǒng)計學差異，表明其能改善糖尿病大鼠腎功能?？寡趸浇Y果顯示，Cs-4可提高血清SOD水平，降低MDA水平，表明其能提高大鼠抵抗自由基的能力。切片結果顯示，與糖尿病模型組相比，Cs-4高劑量組能緩解炎癥細胞的浸潤，顯示蝙蝠蛾擬青霉對糖尿病大鼠腎臟有良好的保護作用。但本研究也存在許多局限，如沒有對蝙蝠蛾擬青霉保護腎臟的機制做進一步研究，但仍為其臨床研究提供了基礎，具有巨大的開發(fā)空間。

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Study on the anti-diabetic nephropathy activities of Paccilomyces hepiali extract on diabetic sprague-dawley rats

DONG Yuan，GUO Jian，LI Yan，WANG Hao，LIU Lei，ZHU Jie，WANG Hui-yan*
（Jilin Medical University，Jilin 132013，China）

This work investigated the anti-diabetic nephropathy activities of Paccilomyces hepialid extract，Cs-4，on STZ-induced diabetic sprague-dawley rats.Sprague-dawley rats were orally administered with water extract at 0.05 g/kg，0.5 g/kg and 2 g/kg for 3 weeks，respectively.Then，related biochemical indexes were determined.Data showed that similar as metformin，the high dose group of Paccilomyces hepiali extract could improve the body weight loss caused by diabetes（p＜0.05），and displayed a significant reduction in fasting blood glucose，urine glucose and urinary albumin excretion rate（p＜0.01）.Meanwhile，renal function tests showed that Paccilomyces hepiali extract displayed a significant reduction in BUN，UA and creatinine（p＜0.01）.The serum SOD activity was enhanced（p＜0.01）and the MDA level was decreased（p＜0.01）.Pathological morphology reversion in histopathological sections showed that inflammatory cell infiltration was significantly reduced after treatment which confirmed that Cs-4 presents excellent anti-diabetic and anti-nephropathic activities.

Paccilomyces hepiali；Cs-4；STZ；diabetic nephropathy

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.064

2015－05－29

董媛（1986-），女，博士，講師，研究方向：食藥用真菌研究，E-mail：dongyuan19860910@126.com。

*通訊作者：王會巖（1968-），女，博士，副教授，研究方向：生物技術制藥，E-mail：zswhy518@163.com。

吉林市科技發(fā)展計劃資助項目（20156430）。