五種DNA提取方法對酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比較

肖其勝,楊捷琳,丁卓平,何宇平,*

(1.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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五種DNA提取方法對酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比較

肖其勝1,2,楊捷琳1,丁卓平2,*,何宇平1,*

(1.上海出入境檢驗檢疫局,上海 200135;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

針對酸奶及菌粉樣品,比較多種樣品前處理條件,包括取樣量、菌粉溶劑及溶菌酶孵育時間等,最大程度去除樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)及多糖,比較五種DNA提取試劑盒對益生菌DNA的提取效果。提取的DNA經(jīng)NanoVue Plus測定濃度和純度,PCR擴增綜合評價提取效果。結(jié)果顯示,酸奶取樣量為100 mg時DNA濃度為49.00 ng/μL,A260/A280比值為1.8;采用純牛奶溶解菌粉更為徹底,0.5 g/mL牛奶溶解菌粉后,提取DNA濃度可達到81.00 ng/μL;溶菌酶最佳孵育時間為1 h,增加孵育時間對細菌裂解沒有明顯幫助。同時,采用五種試劑盒所提取的DNA濃度均在20 ng/μL以上,A260/A280比值大于1.8或接近1.8,其中,Tiangen試劑盒提取的DNA濃度和純度綜合評價優(yōu)于其他4種試劑盒。結(jié)果表明,實驗建立的前處理方法能夠有效的去除酸奶及菌粉中的脂肪、蛋白質(zhì)及多糖,提高DNA提取的濃度及純度;采用的五種商品化試劑盒均能用于酸奶和菌粉中益生菌DNA快速提取,在步驟、得率及純度上各有差異,應(yīng)按照不同的實驗要求進行選擇。

酸奶,乳酸菌菌粉,樣品前處理,DNA提取,比較,PCR

益生菌是對人體腸道健康有益的一類微生物,大多屬于乳酸菌屬[1],廣泛應(yīng)用于酸奶、奶酪、膳食補充劑等食品及保健品生產(chǎn)。越來越多研究證實乳酸菌具有控制腸道感染,改善乳糖的利用率,降低血清膽固醇水平等功效[2-3]。

乳酸菌具有“種”或“株”決定性的特點[4]。我國規(guī)定可用于食品及保健品生產(chǎn)的乳酸菌共有21種,包括雙歧桿菌6種,乳桿菌14種,鏈球菌1種,而在嬰幼兒食品中可使用的菌株僅有6株。建立一套對益生菌制品中乳酸菌方便、快速、準確的菌株鑒定和溯源方法十分迫切。

目前,分子生物學(xué)技術(shù)在乳酸菌菌株鑒定和溯源中應(yīng)用廣泛[5]。常見的分子分型技術(shù)是將樣品接種到固體培養(yǎng)基上分離單菌落,再對單菌落進行擴大培養(yǎng)抽提DNA,但此類方法不利于樣品中低豐度細菌種類的分離,不能準確反映復(fù)合菌種樣品中菌株的真實狀態(tài)[6-7]。在酸奶等乳制品中,蛋白質(zhì)和脂肪含量較高,會影響DNA提取的質(zhì)量和得率;在菌粉等食品添加劑產(chǎn)品中,會使用大量麥芽糊精作為乳酸菌載體,這類多糖物質(zhì)的理化性質(zhì)與DNA相似,在提取過程中較難去除,含量較多時會嚴重影響分子生物學(xué)研究的下游工作[8-9]。因此,近年來對于如何去除雜質(zhì),提高DNA提取質(zhì)量研究較多。Parayre等[10]使用2%檸檬酸鈉溶液對酸奶進行前處理去除脂肪后再提取DNA,產(chǎn)物得率較低,但純度能夠滿足實驗需求;宋帆[11]比較了異硫氰胍法、濾膜法和磁珠法提取奶粉中DNA,發(fā)現(xiàn)磁珠法提取的奶粉DNA質(zhì)量較好;Pirondini等[12]使用7種DNA提取方法提取酸奶中DNA,僅CTAB法的擴增條帶較為清晰。

本研究以酸奶和乳酸菌粉這兩種食品類乳酸菌制劑作為研究對象,比較多種樣品前處理條件,包括取樣量、菌粉溶劑及溶菌酶孵育時間等,最大程度去除樣品中的脂肪、蛋白質(zhì)及多糖,并比較和評價五種商用試劑盒的DNA提取效果,以期為后續(xù)分子生物學(xué)實驗打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

某品牌酸奶(添加菌株:保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌雙乙酰亞種);雙蒸水;純牛奶(用于菌粉的溶解稀釋)購自超市;雙歧桿菌菌粉(添加菌株:乳雙歧桿菌-Bb12;8×108CFU/g)由上海丹尼斯克公司提供;檸檬酸三鈉二水、氫氧化鈉、異丙醇、無水乙醇購自生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白酶K(20 mg/mL)、溶菌酶溶液(50 mg/mL)、TaKaRa Ex TaqTM PCR試劑、瓊脂糖、溴化乙錠EB、1×TE(Cat.#DP324-03)、50×TAE Electrophoresis buffer(Fermentas)、DL 2000TMDNA Marker購自天根生化科技有限公司;試劑盒1:Tiangen深加工食品基因組DNA提取試劑盒(Cat.#DP326)，試劑盒3:Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒(Cat.#DP302-02)天根生化科技有限公司;試劑盒2:Roche High Pure PCR Template Preparation Kit(Cat.#11796828001)羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;試劑盒4:Invitrogen Pure Link? Genomic DNA Kits(Cat.#K1820-01)賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司;試劑盒5:Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit(Cat.#69504)上海嘉合生物科技有限公司。

BP310S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;5415R冷凍離心機、恒溫振蕩孵育器、Mastercycler pro梯度PCR儀艾本德中國有限公司;渦旋振蕩器德國海道夫儀器公司;NanoVue Plus微量分光光度計上海匯檢菁英科技有限公司;BIO-RAD-200/2.2電泳儀、CLP-75.2314電泳槽伯樂生化儀器公司;ALPHA 2S-2200凝膠分析成像系統(tǒng)安萊科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品前處理酸奶:分別稱取10、20、50、100、500 mg酸奶于2 mL離心管,加入750 μL去離子水、100 μL 18%檸檬酸鈉和50 μL 1 mol/L氫氧化鈉。4 ℃,12000 r/min離心5 min,棄上清,保留沉淀[13]。向沉淀加入180 μL溶菌酶,分別孵育1、3、5 h。

菌粉:分別稱取0.15、0.5、1、1.5 g菌粉于15 mL離心管,采用1 mL去離子水或1 mL純牛奶作為溶劑,比較兩者作為溶劑對DNA提取效果的影響。后續(xù)依次加入7.5 mL去離子水、1 mL 18%檸檬酸鈉和500 μL 1 mol/L氫氧化鈉,緩沖液有助于去除雜質(zhì)。4 ℃,12000 r/min離心10 min。棄上清,吸取750 μL去離子水,反復(fù)吹打沉淀,使菌體均勻分散于水相,并轉(zhuǎn)移至新2 mL離心管中,依次加入100 μL 18%檸檬酸鈉、50 μL 1 mol/L氫氧化鈉,4 ℃,12000 r/min離心10 min,棄上清,保留沉淀。向沉淀加入180 μL溶菌酶,孵育1 h。

1.2.2DNA提取使用提取試劑盒抽提上述兩組樣品中DNA,操作步驟見各試劑盒說明書。每種試劑盒每組樣品設(shè)置3個平行樣。每次提取均設(shè)置提取空白對照。

1.2.3樣品DNA濃度和質(zhì)量測定采用微量分光光度計(GE公司NanoVue Plus)分別測定DNA在230、260、280 nm的吸光值,計算A260/A230和A260/A280比值,作為DNA濃度和純度的判定指標,評估提取的DNA溶液中脂肪、蛋白質(zhì)及多糖等雜質(zhì)的去除情況。

1.2.4PCR擴增

1.2.4.1引物采用乳酸菌特異性引物HDA2(5′-GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)和Lac19(5′-A GCAGTAGGGAATCTTCC-3′)[14]擴增酸奶樣品中乳酸菌16S rRNA基因可變區(qū),擴增片段大小為200 bp。采用雙歧桿菌屬16S rDNA tuf基因的引物Bif_tuf_F(5′-GTCCGTGACCTCCTCGAC-3′)和Bif_tuf_R(5′-GTGGAAGGTCTCGATGGAG-3′)[15]對菌粉中提取雙歧桿菌DNA進行擴增,片段大小為339 bp。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成和純化。

1.2.4.2PCR擴增采用25 μL體系進行PCR擴增,其中包括12.5 μL TaKaRa Ex Taq預(yù)混液,2 μL上下游引物,2.5 μL DNA模板(空白對照用ddH2O補足)。反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min;30個循環(huán)×(94 ℃ 30 S;62 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min);72 ℃ 7 min。

1.2.4.3凝膠電泳檢測配制1%瓊脂糖凝膠,在PCR擴增產(chǎn)物中加入10X上樣緩沖液后混勻上樣,以DL 2000分子量標準(天根生化科技(北京)有限公司)作為Marker。調(diào)節(jié)電壓在120 V,電泳30 min后在凝膠成像分析系統(tǒng)拍照留存。

2　結(jié)果與分析

2.1取樣量對提取效果的影響

酸奶組分別設(shè)置6個取樣量,10、20、50、100、300、500 mg,最終提取乳酸菌DNA結(jié)果見表1,分別為5.42、9.52、23.31、49.00、167.15、282.26 ng/μL,這一結(jié)果說明DNA提取量基本與樣品取樣量成正比。前4個取樣量的DNA A260/A280比值在1.8～2.0之間,表明提取的DNA純度較高;而取樣為300 mg和500 mg時,DNA A260/A280比值分別為1.64、1.59,純度較低。說明加大樣品量能提取到較多的目標DNA,同時也會引入更多脂肪、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),綜合各項指標,100 mg酸奶樣品提取乳酸菌DNA的濃度和純度最佳,故后續(xù)實驗中酸奶取樣量為100 mg。

表1　取樣量對酸奶DNA提取效果影響Table 1　Effect of yogurt’s sampling quantity on the extraction of DNA

2.2菌粉溶劑對DNA提取的影響

分別采用去離子水和純牛奶作為菌粉溶劑。按照同樣的濃度溶解菌粉,使用去離子水作為溶劑,離心后難以觀察到沉淀,而使用純牛奶作為溶劑,離心后沉淀較多。用水作為溶劑的菌粉DNA提取濃度極低,因此采用純牛奶作為溶劑,可使菌粉完全溶解。實驗共設(shè)置4個取樣量,0.15、0.5、1、1.5 g/mL,DNA濃度及A260/A280比值見表2。結(jié)果表明,取樣量增大時DNA得率增加,但當取樣量超過0.5 g/mL時,DNA得率降低;從A260/A280比值看,取樣量為1.5 g/mL時,DNA純度最低,說明樣品量在一定范圍內(nèi)與DNA濃度和純度呈正相關(guān),超過一定范圍后單個指標受到影響。

表2　取樣量對菌粉DNA提取效果影響Table 2　Effect of LAB powder’s sampling quantity on the extraction of DNA

2.3溶菌酶孵育時間對提取效果的影響

乳酸菌為革蘭氏陽性菌,細菌細胞壁較厚,提取DNA多采用溶菌酶裂解。取100 mg酸奶樣品,采用溶菌酶37 ℃分別孵育1、3、5 h,使用Tiangen細菌試劑盒同批次提取DNA,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,孵育1、3、5 h后,DNA濃度差異較小,表明溶菌酶孵育時間1 h已經(jīng)足夠裂解細菌,故后續(xù)實驗中采用1 h孵育。

表3　溶菌酶孵育時間對DNA提取效果的影響Table 3　Effect of incubation time of lysozyme on the extraction of DNA

2.4DNA純度

采用NanoPlus測定提取DNA的OD260、OD230、OD280 nm,計算DNA純度,見表4。

純度的DNA A260/A280比值應(yīng)接近1.8～2.0,若比值大于1.8,說明存在RNA;若比值小于1.8,則說明有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。五種試劑盒提取的DNA的A260/A280比值都在1.7～2.3之間。其中,Invitrogen試劑盒和Qiagen試劑盒提取DNA A260/A280比值均大于2.1,說明含RNA較多;Roche試劑盒提取酸奶DNA A260/A280比值為1.73,說明有少量蛋白質(zhì)殘留,而提取菌粉DNA A260/A280比值為2.04,說明有少量RNA;Tiangen兩種試劑盒提取的各樣品中益生菌DNA的A260/A280比值基本在1.8～2.0附近,表明蛋白質(zhì)和RNA去除效果較好。

A260/A230比值應(yīng)在2～2.5之間,偏小則說明有鹽剩余。5組試劑盒對兩種樣品提取的目標DNA A260/A230比值均小于2,說明在提取過程中均有不同程度的鹽分殘留。殘留較少的是Tiangen細菌試劑盒,A260/A230比值最接近2,其余試劑盒A260/A230比值均接近1.0～1.5。同時,根據(jù)抽提的重復(fù)樣計算標準偏差,偏差越小,表明試劑盒重復(fù)性越好,由結(jié)果可看出Tiangen深加工試劑盒和Invitrogen試劑盒重復(fù)性更好。

綜合判斷,Tiangen深加工試劑盒和Tiangen細菌試劑盒提取的DNA純度最好。

表4　五種方法提取的DNA純度Table 4　Purity of the extracted DNA samples by five methods

表5　五種方法提取的DNA濃度(ng/μL)Table 5　Concentration of the extracted DNA samples by five methods(ng/μL)

2.5DNA濃度

同等取樣量采用等體積洗脫。結(jié)果見表5,酸奶樣品DNA提取是Tiangen細菌試劑盒濃度最高,為49.00 ng/μL,Roche試劑盒濃度最低,只有20.67 ng/μL。菌粉樣品DNA提取是Tiangen細菌試劑盒濃度最高,為81 ng/μL,Roche試劑盒濃度最低,27.67 ng/μL。

2.6PCR擴增分析

將所有提取的DNA作為模板,擴增乳酸菌16S rRNA基因,電泳結(jié)果見圖1A所示。整體來看,不同試劑盒提取的DNA濃度與擴增條帶亮度趨于一致。

同時,將含有雙歧桿菌的菌粉組樣品DNA作為模板,擴增雙歧桿菌屬16S rDNA tuf基因,見圖1B。結(jié)果表明,所有擴增產(chǎn)物在瓊脂糖上均能得到一條致密條帶,與預(yù)期的片段大小339 bp一致,5種試劑盒提取的DNA濃度均能達到PCR擴增要求。

圖1　PCR擴增結(jié)果Fig.1　Results of PCR注:A、B分別為酸奶組樣品和菌粉組樣品的PCR結(jié)果。泳道1～3,采用Tiangen深加工試劑盒;4～6,采用Roche試劑盒;7～9,采用Tiangen細菌試劑盒;10～12,采用Invitrogen試劑盒;13～15,采用Qiagen試劑盒;16～18,空白對照。M為DL2000分子量標準。

2.7DNA提取試劑盒比較

根據(jù)上述分光光度計對提取目標DNA的A260/A280和A260/A230兩個比值和濃度的測定結(jié)果,以及PCR擴增結(jié)果對各DNA提取方法進行綜合分析,同時對提取過程的簡易程度等其它因素也進行了綜合分析和總結(jié),各方法的優(yōu)缺點歸納于表6。

3　結(jié)論與討論

分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類食品溯源和菌株鑒定的檢驗中。樣品處理和DNA提取是檢測流程中至關(guān)重要的第一步,DNA模板的結(jié)構(gòu)完整性和純度直接關(guān)系后續(xù)實驗的成功與否。乳酸菌制劑基質(zhì)成分復(fù)雜,蛋白質(zhì),脂肪和多糖類含量高,提取方法不得當,會導(dǎo)致雜質(zhì)無法去除,直接影響DNA提取質(zhì)量。因此選擇合適的前處理方法和提取方法尤為重要。

表6　五種DNA提取試劑盒比較Table 6　Comparison of five DNA extraction kits

本研究建立了前處理方法,能有效去除酸奶及菌粉樣品基質(zhì)中部分雜質(zhì),然后比較了5種常用的DNA提取試劑盒對樣品DNA的提取效果。根據(jù)不同取樣量的兩組樣品,提取到目標DNA濃度及純度確定了最佳取樣量,酸奶為100 mg,乳酸菌粉為0.5 g/mL,樣品取樣量太低,提取DNA濃度不能滿足后續(xù)實驗,取樣太多則會引入更多雜質(zhì),影響DNA純度;采用水作為菌粉溶劑無法得到沉淀,推測原因可能是因為菌粉中含有大量麥芽糊精,單純用水溶解很難將乳酸菌與麥芽糊精分離,而牛奶中的脂肪對多糖類物質(zhì)具有一定吸附作用,有利于樣品溶解和菌體分離;比較溶菌酶孵育時間的長短,最終確定乳酸菌最適孵育時間為1 h。

通過對DNA中蛋白質(zhì)和鹽分、多糖等雜質(zhì)去除情況、DNA濃度和得率,以及PCR擴增情況的綜合分析結(jié)果表明,5種方法均能滿足后續(xù)PCR鑒定的進行,但不同方法間各有優(yōu)缺點。5種方法得到目標DNA都有鹽分殘留,可能的原因之一是因為樣品前處理用到檸檬酸鈉及氫氧化鈉試劑,而酸奶中脂肪含量也較高,當脂肪與試劑發(fā)生吸附時可能使鹽分殘留,導(dǎo)致A260/A230偏低?？紤]到實驗所用鹽試劑和樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,所以有少量鹽殘留的前提是能夠滿足后續(xù)的實驗要求,如果后續(xù)實驗鹽分殘留影響較大,應(yīng)增加相應(yīng)的步驟去除鹽分。Tiangen細菌試劑盒均能從兩種樣品中提取濃度和純度更好的目標DNA,價格也相對便宜;Qiagen試劑盒對菌粉的提取效果要好于酸奶,說明該試劑盒適合多糖含量較高的樣品使用。實驗室可根據(jù)自身條件,選取合適的提取方法。

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Evaluation of five DNA extraction methods for Probiotic yogurt and powder

XIAO Qi-sheng1,2,YANG Jie-lin1,DING Zhuo-ping2,*,HE Yu-ping1,*

(1.Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200135,China;2.College of Food Science & Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Yogurt and Lactic acid bacteria(LAB)powder were chosen as samples. The sampling quantities,solvents of LAB powder and incubation time of lysozyme have been optimized to remove fats,proteins and polysaccharides. Then five commercialized DNA extraction kits were compared on their DNA extraction efficiency after sample pretreatment. The quality and quantity of the extracted DNA were evaluated by NanoVue Plus and conventional PCR. It is showed that when the sampling quantity of yogurt was 100 mg,the DNA concentration was 49.00 ng/μL,and A260/A280ratio was 1.8. The milk was more suitable as the solvent for LAB powder compared to distilled water,and when the sampling quantity of LAB powder was 0.5 g/mL,the DNA concentration was 81.00 ng/μL. The best incubation time of lysozyme was 1 h,and the expanded incubation time had no significant improvement for cell lysis. The extracted DNA concentrations from five kits were all over 20 ng/μL,and the A260/A280ratio was greater than or close to 1.8. Among the five kits,the one from Tiangen had the best DNA concentration and purity. It was proved that the established pretreatment method can effectively remove fats,proteins and polysaccharides. Each of the five kits can be used to extract DNA from yogurt and LAB powder,however,the choice should be made based on different experiment requests.

yogurt;lactic acid bacteria powder;sample pretreatment;DNA extraction;comparison;PCR

2015-07-15

肖其勝(1989-)，男，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：xiaoqsheng@163.com。

何宇平(1964-)，男，本科，研究員，研究方向：食品衛(wèi)生與檢驗，E-mail：heyuping@shciq.gov.cn。

丁卓平(1957-)，女，本科，教授，從事食品保健與安全的教學(xué)和研究工作，E-mail：zpding@shou.edu.cn。

上海市科委長三角聯(lián)合科技攻關(guān)項目(14495810200)；國家質(zhì)檢總局項目(2015IK227)。

TS252.54

A

1002-0306(2016)03-0307-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.056