豆豉對小鼠吸收鎘的影響及其相關(guān)機(jī)制的初步探究

王登遠(yuǎn),裘　梁,魏　華,徐　鋒,武曉麗,*

(1.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047;2.江西中醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,江西南昌 330004)

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豆豉對小鼠吸收鎘的影響及其相關(guān)機(jī)制的初步探究

王登遠(yuǎn)1,裘梁2,魏華1,徐鋒1,武曉麗2,*

(1.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047;2.江西中醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,江西南昌 330004)

為評價豆豉對小鼠吸收鎘的影響,本文進(jìn)行了豆豉在體外吸附重金屬和動物實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,從豆豉中分離得到6株細(xì)菌和2株真菌,這些微生物及其代謝產(chǎn)物可能導(dǎo)致豆豉在體外對鎘的吸附率達(dá)到78.67%。豆豉組小鼠糞便中鎘的含量顯著低于對照組,這表明豆豉促進(jìn)了小鼠對鎘的吸收,從而增加了鎘在肝臟中的積累。本研究為豆豉的合理食用提供科學(xué)的依據(jù)。

豆豉,微生物,代謝產(chǎn)物,鎘,吸附作用

豆豉起源于我國先秦時代,是以黑豆、黃豆為原料,利用多種微生物共同作用制成的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]。豆豉在制曲及后發(fā)酵過程中,主要有細(xì)菌和霉菌等微生物的參與。豆豉在發(fā)酵的過程中形成了許多生理活性物質(zhì)如大豆皂甙、褐色色素、溶栓酶、抗菌素等[2]。因此,豆豉具有抗氧化、降血糖、降血壓、抗老年癡呆等多種生理活性功能[3]。

微生物的細(xì)胞壁及其分泌的胞外聚合物上存在著大量陰離子基團(tuán)(羧基、羥基及氨基等),這些官能團(tuán)可以通過物理吸附、表面絡(luò)合和離子交換等方式對重金屬有吸附作用[4-5]。豆豉由多種微生物參于發(fā)酵,并且產(chǎn)生了許多新的代謝產(chǎn)物,形成了其獨(dú)特的風(fēng)味和口感。故推測豆豉可能對重金屬有吸附作用,因而可能具有危害人體的潛能。然而,目前對于豆豉的研究主要集中在生理活性物質(zhì)及其營養(yǎng)和藥用功能的分析方面,關(guān)于豆豉對于重金屬吸附及對小鼠吸收重金屬的影響的相關(guān)性研究仍未有報導(dǎo)。中國很多省份,如江西、江蘇、福建、廣西等都是重金屬污染嚴(yán)重地區(qū),鎘大米事件時有發(fā)生,并且這些地區(qū)都有食用豆豉的習(xí)慣,因此,本文以鎘為例,進(jìn)行了相關(guān)性的研究。首先對豆豉中的微生物進(jìn)行分離和鑒定。然后讓豆豉與重金屬共孵育來評價豆豉在體外對重金屬的吸附能力。最后給小鼠灌胃豆豉和氯化鎘來研究豆豉在體內(nèi)對小鼠吸收鎘的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

豆豉南昌稻香園調(diào)味食品有限公司;黑豆為市售;氯化鎘國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;濃硝酸、高氯酸中國天津永大公司;瓊脂、MRS培養(yǎng)基北京索萊寶科技有限公司;LB培養(yǎng)基、土豆培養(yǎng)基青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;BALB/c小鼠30只(18～20 g,雌性)江西省南昌大學(xué)動物科學(xué)部門。

高溫蒸汽壓力滅菌鍋中國上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;鎘空心陰極燈上海光譜儀器有限公司;SP-3520AA型原子吸收分光光度儀上海光譜儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱上海智城分析儀器制造有限公司;YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1豆豉中的細(xì)菌和真菌的分離與純化在無菌條件下,將豆豉研磨成粉末,然后取1 g樣品溶于9 mL無菌PBS(0.01 mol/L)中,用漩渦振蕩器振蕩10 min后,將樣品進(jìn)行10倍逐級梯度稀釋。分別取稀釋梯度為10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋液各100 μL分別涂布于LB平板、MRS平板和土豆培養(yǎng)基平板上[6]。LB平板在37 ℃、有氧條件下培養(yǎng)24 h;MRS平板在37 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)48 h;土豆培養(yǎng)基在25 ℃、有氧條件下培養(yǎng)72 h。然后用接種環(huán)將平板上菌體形態(tài)、特征不同的菌落進(jìn)行劃線分離。平板純化6次后用30%的甘油保菌,于-80 ℃冰箱中保藏。

1.2.2細(xì)菌的鑒定將分離純化得到的細(xì)菌進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng),然后提取各個單菌落的基因組DNA。以細(xì)菌的基因組DNA為模板,采用細(xì)菌16S通用引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;R:5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果通過NCBI的檢索程序進(jìn)行同源性分析。

1.2.3真菌的鑒定將分離純化得到的真菌進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng),然后提取各個單菌落的基因組DNA。以真菌的基因組DNA為模板,采用真菌通用引物F:5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′;R:5′-ATCCA TTCAATCGGTATT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果通過NCBI的檢索程序進(jìn)行同源性分析。

1.2.4豆豉在體外對鎘的吸附作用在無菌條件下,將豆豉、黑豆(已滅菌)研磨成粉末。用無菌的PBS(0.01 mol/L)配成濃度為0.01 mmol/L的氯化鎘溶液。按10%(w/v)比例將豆豉和黑豆分別加入氯化鎘溶液中,置于37 ℃,孵育2 h。孵育2 h后,將樣品在常溫、10000 r/min的條件下,離心5 min,取上清。最后分別測定上清中鎘的含量[8]。計算吸附率Q。

Q(%)=(C0-C)/C0×100

式中:C0:氯化鎘溶液中鎘的濃度;C:經(jīng)過孵育后,上清中鎘的濃度。

1.2.5豆豉在體外對銅的吸附作用在無菌條件下,將豆豉、黑豆(已滅菌)研磨成粉末。用無菌的PBS(0.01 mol/L)配成濃度為0.01 mmol/L的氯化銅溶液。按10%(w/v)比例將豆豉和黑豆分別加入氯化銅溶液中,置于37 ℃,孵育2 h。孵育2 h后,將樣品在常溫、10000 r/min的條件下,離心5 min,取上清。最后分別測定上清中銅的含量[8]。計算吸附率Q。

Q(%)=(C0-C)/C0×100

式中:C0:氯化銅溶液中銅的濃度;C:經(jīng)過孵育后,上清中銅的濃度。

1.2.6小鼠的飼養(yǎng)和處理從南昌大學(xué)動物科學(xué)部購買30只健康活潑的BALB/c小鼠(18～20 g)。然后將小鼠在恒溫25 ℃,濕度55%～65%,空氣清新的飼養(yǎng)房平衡一周后隨機(jī)分為3組,分籠飼養(yǎng)(6只/籠)[9]。小鼠在飼養(yǎng)過程中自由采食、飲水。在無菌條件下,將豆豉、黑豆(已滅菌)研磨成粉末。用無菌的PBS(0.01 mol/L)配成濃度為2 mmol/L的氯化鎘溶液。按10%(w/v)比例將豆豉和黑豆分別加入氯化鎘溶液中,最后分別按照100 μL/只灌胃小鼠[10],對照組只灌胃氯化鎘。每天灌胃一次,連續(xù)灌胃7 d。每天收集各實(shí)驗(yàn)組小鼠的糞便一次,共8次。

1.2.7小鼠各種器官的收集及樣品的消解于第7 d灌胃結(jié)束后,所有小鼠禁食過夜,次日摘眼球取血。將小鼠采用頸椎脫臼法處死后,分別取出肝、腎和脾臟放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將小鼠的糞便、血液、肝、腎和脾等器官從-20 ℃取出,充分解凍。分別稱取小鼠的器官0.5 g置于預(yù)先貼好標(biāo)簽的50 mL燒杯中。先向燒杯中加入10 mL HNO3,搖床上搖勻幾分鐘后,再加入2 mL HClO4。搖床上搖勻后將燒杯放置在電熱板上,先小火加熱均勻,待試樣完全溶解后將電熱板的溫度調(diào)高至260 ℃。加熱消解至消化液成無色透明或略帶黃色的一層薄薄的晶體狀后取下消解好的試樣[11]。待冷卻后,向燒杯中加入適量的超純水,搖勻后移至10 mL容量瓶中。最后,用超純水清洗燒杯3次以上,將清洗液合并至容量瓶中,然后用超純水定容至刻度,混勻,待測。同時做試劑空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.8測定條件選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線原子吸收光譜儀的工作條件:波長228.8 nm;燈電流3 mA;燃燒頭高度10 mm;空氣流量5.5 L/min;乙炔流量1.0 L/min;狹縫寬度0.2 nm。

首先配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,最后以吸光度對質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸。鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.00、0.03、0.10、0.60、1.50、2.40、3.00 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.1795C+0.0073,r=0.99743。銅標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.00、0.05、0.10、1.50、2.50、3.00、4.00 mg/L,標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.1986C+0.0087,r=0.99867。

1.2.9數(shù)據(jù)處理采用spss13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析,計量數(shù)據(jù)以mean±SD表示,采用單因素方差分析比較組間差別,p<0.05表示具有顯著性差異,p<0.01表示具有極顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1豆豉中細(xì)菌的分離和鑒定

通過對菌落形態(tài)及菌體特征分類后可知,從豆豉中一共分離出6株細(xì)菌。

表1　豆豉中主要細(xì)菌鑒定的結(jié)果Table 1　The identification results of the main bacteria in Douchi

不同菌體形態(tài)、特征的單菌落鑒定的結(jié)果顯示從豆豉中分離純化得到的細(xì)菌主要為枯草芽孢桿菌、乳酸片球菌、發(fā)酵乳桿菌等6種菌株。

枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素和短桿菌肽等活性物質(zhì),這些活性物質(zhì)對某些有害致病菌有明顯的抑制作用。并且枯草芽孢桿菌的一些菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌?？莶菅挎邨U菌為豆豉發(fā)酵期間的主要菌群,對豆豉的各種品質(zhì)以及功能性成分起到重要的作用[12]。

魏斯氏菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌和發(fā)酵乳桿菌均屬于乳酸菌。乳酸菌是發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱,乳酸菌在發(fā)酵食品加工過程中可產(chǎn)生胞外多糖、乳酸菌素、乳酸和H2O2等多種代謝物。乳酸菌在豆豉生產(chǎn)過程中對良好風(fēng)味的形成也起著非常重要的作用[13]。

葡萄球菌屬是一群革蘭氏陽性球菌,多數(shù)為安全菌株,少數(shù)可導(dǎo)致疾病。董素琴等人也從豆豉中分離出葡萄球菌屬[14],于立權(quán)等人的研究表明葡萄球菌屬中某些菌株的胞外分泌物中含有多種酶類[15]。

2.2豆豉中真菌的分離和鑒定

根據(jù)不同菌絲體的形態(tài)顏色等特征進(jìn)行分離并鑒定之后可知,傘枝犁頭霉和米曲霉為豆豉中優(yōu)勢的真菌。

表2　豆豉中主要真菌鑒定的結(jié)果Table 2　The identification results of the main fungus in Douchi

作為發(fā)酵工業(yè)中重要的生產(chǎn)用菌,霉菌可以生產(chǎn)抗生素、酶制劑等許多重要的發(fā)酵產(chǎn)品。

霉菌所產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶等復(fù)合酶一直作用于豆豉發(fā)酵過程中,這些復(fù)合酶對豆豉發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的風(fēng)味和營養(yǎng)具有重要作用[16]。

2.3豆豉在體外對重金屬的吸附作用

由表3可知,豆豉和黑豆(已滅菌)分別與重金屬共孵育2 h后,豆豉對鎘的吸附率達(dá)到78.67%,而黑豆(已滅菌)對鎘的吸附率小于0.1%;豆豉對銅的吸附率達(dá)到71.63%,而黑豆(已滅菌)對銅的吸附率小于0.1%。

表3　豆豉在體外對重金屬的吸附作用Table 3　The adsorption of Douchi for heavy metal in vitro

注:表中**表示豆豉組與黑豆組比較具有極顯著性差異,p<0.01。

目前,許多文獻(xiàn)已報道微生物可通過細(xì)胞壁多糖以及胞外聚合物中的羧基、羥基和氨基等官能團(tuán)對鎘有明顯的吸附作用,比如代淑娟等的研究表明枯草芽孢桿菌對電鍍廢水中鎘有明顯的吸附作用[17];王遠(yuǎn)紅等結(jié)果表明利用微生物的胞外聚合物去除環(huán)境水樣中的鎘是可行的[8];姜燭等研究說明霉菌可以很好的去除水體鎘離子[18]。許多文獻(xiàn)已報道豆豉在制曲及發(fā)酵過程中,有許多霉菌、細(xì)菌等微生物的參與[19]。故推測豆豉和黑豆對重金屬吸附作用的差異可能是由豆豉中的微生物引起的,即豆豉中的微生物以及微生物分泌的代謝產(chǎn)物在豆豉吸附重金屬中起到關(guān)鍵的作用。

2.4小鼠糞便中鎘含量的變化

由圖1可知,從第0 d到第3 d,各實(shí)驗(yàn)組的小鼠糞便中鎘的含量隨著時間的變化逐漸增大,到第4 d后趨于穩(wěn)定。黑豆組小鼠糞便中鎘的含量與對照組相比無顯著差異(p>0.05)。因此,黑豆在小鼠體內(nèi)對鎘的吸收無影響。

圖1　小鼠糞便中鎘的含量Fig.1　The content of cadmium in the feces of mice注:*表示豆豉組與對照組相比有顯著差異,p<0.05; **表示豆豉組與對照組相比有極顯著差異,p<0.01。

和對照組相比,豆豉組小鼠糞便中鎘的含量從灌胃第2 d后就開始顯著降低。推測該變化可能是因?yàn)槎刽械奈⑸镆约胺置诘拇x產(chǎn)物對鎘有吸附的作用,然后被吸附的鎘富集在小腸細(xì)胞的表面進(jìn)而被吸收到小鼠體內(nèi),最終導(dǎo)致排出體外的鎘含量降低。然而具體是哪幾株發(fā)酵菌株,單獨(dú)或者協(xié)同發(fā)揮這種作用,還需要我們進(jìn)一步研究。

2.5小鼠各種器官中鎘含量的變化

由圖2可知,在該灌胃劑量下,肝臟和腎臟中的鎘的含量比較高,其中肝臟中鎘的含量最高。然而,脾臟和血液中鎘的含量卻接近于0。這個原因可能是鎘主要蓄積在肝臟和腎臟中[20]。黑豆組鎘的含量與對照組相比無顯著變化,這表明作為豆豉的發(fā)酵原料,黑豆自身組分并未參于鎘的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)。豆豉組小鼠肝臟中鎘的含量和對照組相比顯著升高。在本劑量下,未發(fā)現(xiàn)鎘對小鼠的各種器官有明顯的毒害作用。

圖2　小鼠各種器官中的鎘的含量Fig.2　The content of cadmium in various organs of mice注:圖中*表示豆豉組與對照組比較 具有顯著性差異,p<0.05。

關(guān)穎等人發(fā)現(xiàn)肝臟中鎘的吸收與受體依賴性鈣通道有關(guān)[21],徐莉春等人發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白(MT)對金屬的高度親合力是引起鎘在體內(nèi)蓄積的主要原因[22]。與黑豆組相比可知,豆豉特異性的增加了鎘在肝臟中的累積,而并未促進(jìn)在腎臟的累積,推測這與豆豉發(fā)酵過程中的微生物及其新合成出的代謝產(chǎn)物有關(guān),然而豆豉是否選擇性的激活了肝細(xì)胞的受體依賴性鈣通道,導(dǎo)致鎘通過鈣通道被吸收和蓄積,還是選擇性地誘導(dǎo)肝臟中金屬硫蛋白(MT)的生物合成,進(jìn)而引起了鎘在肝臟的蓄積,或者還存在其他的作用機(jī)制,以及具體是哪些豆豉組分參于了其中的過程,都有待深入研究。

歐陽彩群等人發(fā)現(xiàn)小鼠飲用含氯化鎘蒸餾水(30 mg/L)2周后,各種器官也未有明顯的損害[23]。因此,我們會調(diào)整豆豉以及鎘的灌胃劑量和周期,來進(jìn)一步研究豆豉與鎘引起的疼痛、消化不良、骨折等病害之間的關(guān)聯(lián)。

3　結(jié)論

從豆豉中分離得到的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌、魏斯氏菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、發(fā)酵乳桿菌和葡萄球菌,真菌為傘枝犁頭霉和米曲霉。豆豉在體外對鎘的吸附率達(dá)到78.67%,原因可能是豆豉中的微生物或分泌的代謝產(chǎn)物參與了對鎘的吸附作用。豆豉促進(jìn)了鎘被吸收進(jìn)小鼠的體內(nèi),最終增加了鎘在肝臟中的積累。因此,被鎘污染的地區(qū)的人們應(yīng)該避免食用豆豉。本研究結(jié)果將為豆豉的合理食用提供科學(xué)依據(jù),也為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的安全性評估提供借鑒。

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Effect of Douchi on the absorption of cadmium in mice and tentative study of related mechanisms

WANG Deng-yuan1,QIU Liang2,WEI Hua1,XU Feng1,WU Xiao-li2,*

(1.Jiangxi-OAI Joint Research Institute,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China)

To evaluate the effect of Douchi on the absorption of cadmium in mice,the adsorption of Douchi for heavy metalinvitroand animal experiments were carried out. The results showed that six strains of bacteria and two strains fungus were isolated from Douchi. Microbes and metabolites may cause Douchi to have good adsorption efficiency of 78.67% for cadmiuminvitro. The content of cadmium in the feces of mice treated with Douchi was significantly lower than that in the control group. It indicated that Douchi promoted the absorption of cadmium in mice and aggravated the accumulation of cadmium in liver. It provided scientific basis for the reasonable edible of Douchi.

Douchi;microbe;metabolites;cadmium;adsorption

2015-07-13

王登遠(yuǎn)(1989-)，男，在讀研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail:872245358@qq.com。

武曉麗(1981-)，女，博士，講師，研究方向：生物與分子生物學(xué)，E-mail:710788651@qq.com。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81160494，31260363，31170091)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)03-0339-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.062