三斑海馬水提物抗氧化活性研究

陳莉萍,申鉉日,*,陳國(guó)華,孫菲菲,金美娜

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228;2.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南?？?570228)

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三斑海馬水提物抗氧化活性研究

陳莉萍1,申鉉日1,*,陳國(guó)華2,孫菲菲1,金美娜1

(1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228;2.海南大學(xué)海洋學(xué)院,海南?？?570228)

本文探討三斑海馬小分子水溶性提取物的抗氧化能力。以三斑海馬干燥體粗粉為原料,經(jīng)95%乙醇回流提取,系統(tǒng)溶劑提取獲得不同極性提取物,并對(duì)水提物進(jìn)一步分離及抗氧化活性評(píng)價(jià)。經(jīng)Sephadex G-10凝膠過(guò)濾層析分離得到6個(gè)組分。對(duì)組分清除DPPH自由基,超氧陰離子自由基和羥基自由基能力,總還原力等抗氧化能力以及總氨基酸和總酚含量進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在分離獲得的6個(gè)組分中FrⅣ的DPPH自由基清除活性最高,其IC50=0.25 mg/mL。FrⅣ的總還原力較高,羥基自由基清除活性及鐵離子螯合能力最強(qiáng)。表明三斑海馬小分子水溶性提取物的抗氧化活性與總酚、總氨基酸、小分子肽的含量和類型密切相關(guān)。

三斑海馬,水提物,抗氧化活性

三斑海馬(HippocampustirmaculatusLeach)為脊索門魚綱刺魚目海龍科海馬屬的珍稀海洋硬骨魚[1]。其體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì),主要包括甾體類化合物、磷脂、氨基酸等[2],其功效為抗疲勞[3]、抗關(guān)節(jié)炎[4]、抗菌[5]。現(xiàn)代生命科學(xué)研究表明,活性氧簇/氮簇在人體中產(chǎn)生能引起氧化損傷和一些退行性疾病,如老化、癌癥[6],抗氧化劑被認(rèn)為是自由基清除劑。近年來(lái),從天然產(chǎn)物獲取天然抗氧化劑引起人們極大興趣,在醫(yī)藥、人類營(yíng)養(yǎng)和食品工業(yè)已受到廣泛關(guān)注。目前,不同植物、動(dòng)物來(lái)源水溶性組分中分離得到不同抗氧化活性成分。已有的海馬研究工作主要集中在脂溶性成分的分析研究上[7],而對(duì)水溶性小分子的研究較少。

本研究以三斑海馬為研究對(duì)象,探討了其小分子水提物的分子量分布,評(píng)價(jià)其抗氧化活性,初步探討了其分離物的組成成分與抗氧化活性之間的關(guān)系,以期提升三斑海馬的藥用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

三斑海馬購(gòu)自海南龍盛生物科技發(fā)展有限公司,干燥體。

DPPH自由基即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼購(gòu)自Sigma化學(xué)試劑公司;福林酚試劑國(guó)藥集團(tuán),生化試劑。其他使用的化學(xué)品和試劑均為市售的分析純。

7200可見光分光光度計(jì)尤尼柯上海有限公司;TU-1901雙光束紫外可見光分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TDL-60B離心機(jī)上海圣科儀器設(shè)備有限公司;EL204電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司;M37610-33CN渦旋混合器賽默飛科技中國(guó)制造;DK-600電熱恒溫水溫箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;BT102S恒流泵保定雷弗流體科技有限公司;HD-5電腦紫外檢測(cè)儀南京大學(xué)普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所;層析柱上海煊盛生化儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水提物制備與水提物分離三斑海馬干品購(gòu)自廣州中藥材市場(chǎng),將樣品用自來(lái)水沖洗并除去內(nèi)臟等,60 ℃烘干至恒重,粉碎過(guò)20目篩,分析純級(jí)95%乙醇以1∶10(m/v)比例,回流提取,每次提取2 h,重復(fù)三次,獲得海馬乙醇粗提取物。粗提液經(jīng)真空泵布氏漏斗后抽濾,獲得濾液,60 ℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至浸膏狀。原料與去離子水1∶1(m/v)混懸。用系統(tǒng)溶劑萃取法,依次與相同體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取,各重復(fù)操作三次。獲得四種組分(石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇、水),即極性從小到大的提取物。水提取物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,冷凍干燥,計(jì)算水提取物的得率。水提取物用于進(jìn)一步分離。使用前貯存于-20 ℃冰箱中。

水提取物通過(guò)葡聚糖凝膠G-10色譜柱進(jìn)行分離,分析條件為,層析柱:1.2 cm×80 cm;填料:葡聚糖凝膠G-10(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司);檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm;進(jìn)樣量:50 mg/mL;進(jìn)樣體積:2.0 mL;洗脫溶劑:去離子水;流速:1.0 mL/min。

1.2.2總酚和總氨基酸含量的測(cè)定

1.2.2.1總酚含量的測(cè)定總酚含量測(cè)定采用修改的福林-喬卡梯奧(Folin-Ciocalteu)[8]方法,含量表示為mg EGCG/g組分。

1.2.2.2總氨基酸含量測(cè)定參照寧正祥[9]方法進(jìn)行組分總氨基酸含量的測(cè)定,含量表示為mg甘氨酸/g組分。

1.2.3抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1DPPH·清除率測(cè)定參照Om P. Sharma等[10]的方法,配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH·無(wú)水乙醇溶液。分別設(shè)置空白組、樣品組、控制組。暗處反應(yīng)20 min,分光光度計(jì)測(cè)定517 nm處的吸光值。VC作為陽(yáng)性對(duì)照組。

DPPH·清除率根據(jù)以下公式計(jì)算:

式(1)

式(1)中,清除自由基能力表示為IC50(mg/mL),即抑制率為50%時(shí)的樣品濃度。DPPH·清除能力較好的組分將進(jìn)一步分析其他抗氧化活性。

1.2.3.2總還原力的測(cè)定參照江慎華[11]的方法。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品維生素C陽(yáng)性對(duì)照組的總還原力。

1.2.3.3羥自由基清除率的測(cè)定參照李莉等[12]的方法。10 mL試管中依次加入1.5 mmol/L鄰二氮菲無(wú)水乙醇溶液1.0 mL、磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)2.0 mL和去離子水1.0 mL,充分混勻,加入1.5 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL,邊渦旋混合邊加入,再加入0.015% H2O2溶液1.0 mL,置于37 ℃水浴中反應(yīng)1 h,以體積比為2∶1的緩沖液和去離子水作為參比液,在510 nm處測(cè)定吸光度A1。用1.0 mL去離子水代替1.0 mL 0.015% H2O2,在510 nm測(cè)其吸光度A2;用不同濃度的樣品代替1.0 mL雙蒸水,在510 nm處測(cè)定吸光度A3,每次加樣品充分搖勻。按式(2)計(jì)算抑制率:

式(2)

1.2.3.4鐵離子螯合能力的測(cè)定參照Decker[13]的方法稍作修改。在1 mL不同濃度的小分子水提物組分溶液中依次加入3.7 mL去離子水、0.1 mL 2 mmol/L FeSO4·7H2O和0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪,混勻后置室溫下20 min,562 nm處測(cè)定其OD值。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取其平均值。以去離子水作為空白對(duì)照,EDTA二鈉鹽作為陽(yáng)性對(duì)照品。

根據(jù)式(3)計(jì)算提取物的Fe3+鰲合能力:

式(3)

式(3)中,A0為空白對(duì)照的OD值,A1為加有樣品或者陽(yáng)性對(duì)照后的OD值。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(x±S.D.)表示,OriginPro 7.5計(jì)算IC50,SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素差異分析。通過(guò)ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)間的差異分析,p<0.05,差異顯著,p<0.01,差異極顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1三斑海馬水提取物的分離

2.1.1三斑海馬水提物Sephadex G-10凝膠層析葡聚糖凝膠排阻層析是依據(jù)分離物分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù),洗脫物的分子量越大最先被洗脫出來(lái),分子小的后被洗脫出來(lái)。由圖1可知,三斑海馬水提物通過(guò)Sephadex G-10凝膠分離得到6個(gè)峰,分別為FrⅠ、FrⅡ、FrⅢ、FrⅣ、FrⅤ、FrⅥ。

圖1　Sephadex G-10凝膠過(guò)濾層析分離洗脫曲線Fig.1　Elution profile of Gel filtration chromatography of Sephadex G-10

2.1.2三斑海馬水提物Sephadex G-10凝膠層析酚類及氨基酸的分布收集Sephadex G-10凝膠過(guò)濾層析餾分3 mL/管,每管取1 mL進(jìn)行總酚含量和總氨基酸含量測(cè)定。以管數(shù)為橫坐標(biāo)X,總酚含量為縱坐標(biāo)Y1,總氨基酸含量為縱坐標(biāo)Y2,繪制雙縱坐標(biāo)曲線。福林酚法已被廣泛用于測(cè)定混合體系中總酚含量,然而該方法有一些不足之處,福臨酚試劑在堿性條件下也與一些非酚類還原化合物比如氨基酸等反應(yīng)。

圖2　Sephadex G-10凝膠層析總酚及總氨基酸分布Fig.2　Distribution of total phenolics and total amino acid of Sephadex G-10 gel chromatography

2.2各組分成分測(cè)定

表1　各組分的總酚含量及總氨基酸含量Table 1　Total phenolics content and the total amino acid content of each fraction

FrⅠ～FrⅣ均含有酚類化合物,其含量有差異,其中FrⅥ總酚含量最高為(298.38±5.78) mg EGCG/g組分,而其分子量也是最小。組分中FrⅠ、FrⅡ、FrⅣ檢測(cè)到氨基酸或小分子肽,其中FrⅡ的含量最高為(128.938±0.252) mg Gly/g組分。

2.3抗氧化活性

2.3.1DPPH·清除力DPPH自由基由于苯環(huán)的共軛和位阻及硝基的電子作用,是一種穩(wěn)定的自由基,其在乙醇溶液呈紫色,當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí),DPPH自由基的單電子被配對(duì)而使其紫色變淺,A517nm值變小,而吸光值變小的程度與自由基被清除的程度呈劑量依賴的線性關(guān)系[14],因此用來(lái)檢測(cè)自由基清除情況,本實(shí)驗(yàn)將DPPH自由基清除能力作為評(píng)價(jià)抗氧化能力較強(qiáng)的三斑海馬水提物凝膠層析分離組分的初步篩選指標(biāo)。FrⅣ、FrⅤ和FrⅥ用于進(jìn)一步的抗氧化活性評(píng)價(jià)。

表2　各組分DPPH·清除力IC50Table 2　IC50 of DPPH radicals scavenging ability of each fraction

圖3　組分的DPPH·清除Fig.3　Free radical scavenging rate of FrⅣ～FrⅥ

DPPH自由基被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物清除自由基活性的實(shí)驗(yàn)中。對(duì)于分離組分的DPPH·清除能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FrⅣ(IC50=0.25 mg/mL)>FrⅥ(IC50=0.58 mg/mL)>FrⅤ(IC50=2.01 mg/mL)。各組分的DPPH·清除能力明顯弱于對(duì)照組VC,FrⅣ雖與VC的DPPH自由基清除能力相差一個(gè)數(shù)量級(jí),但與FrⅥ相比具有較高的DPPH·清除能力,其可能與FrⅣ含有小分子肽、游離氨基酸和酚類化合物有關(guān),這些物質(zhì)可作為供氫體。

2.3.2總還原力還原能力是評(píng)價(jià)抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo),也是抗氧化機(jī)理之一?？寡趸瘎┩ㄟ^(guò)自身的抗氧作用給出電子而清除自由基,還原力越強(qiáng),抗氧化性越強(qiáng)。在檢測(cè)濃度范圍內(nèi),相同濃度下組分的總還原力大小依次為FrⅣ>FrⅥ>FrⅤ。其中FrⅣ濃度為1.0 mg/mL時(shí),接近于濃度為0.2 mg/mL的VC總還原力。對(duì)于FrⅥ、FrⅤ,總還原力是與總酚含量相關(guān)。對(duì)于FrⅣ,其較高的還原力可能與組分中含有的氨基酸、小分子肽相關(guān)。

圖4　組分的總還原力Fig.4　Total reducing power of FrⅣ～FrⅥ

2.3.3羥基自由基清除力羥基自由基是已知活性最強(qiáng)的活性氧自由基,對(duì)照組VC的羥基自由基清除力IC50值為0.41 mg/mL,樣品組:FrⅣ(IC50=1.32 mg/mL)>FrⅥ(IC50=1.91 mg/mL)>FrⅤ(IC50=1.95 mg/mL)。分離組分中FrⅣ的具有相對(duì)較強(qiáng)的羥基自由基清除能力,當(dāng)濃度為2.0 mg/mL,清除率達(dá)到80%,可能與組分中含有清除活性氧自由基能力較強(qiáng)的游離氨基酸、小分子肽有關(guān)。在測(cè)定的樣品濃度范圍內(nèi),FrⅥ、FrⅤ的羥基自由基清除能力相平。

圖5　組分的羥基自由基清除Fig.5　The hydroxyl free radical scavenging of FrⅣ-FrⅥ

2.3.4鐵離子螯合能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著樣品濃度的增大,各樣品的鐵離子螯合能力也隨之增加。對(duì)照組EDTA-2Na的鐵離子螯合能力的IC50值為0.074 mg/mL。樣品組的鐵離子螯合能力:FrⅣ>FrⅥ>FrⅤ,EDTA-2Na鐵離子螯合能力IC50<0.10,均顯著(p<0.01)高于各個(gè)樣品組的鐵離子螯合能力。

圖6　組分的鐵離子螯合能力Fig.6　Ferrous ion chelating ability of FrⅣ～FrⅥ

魚類中存在抗氧化化合物保護(hù)它們的脂質(zhì)和其他含有雙鍵的化合物,用于減少活性氧簇對(duì)其引起的損傷,這些化合物含有很多化學(xué)基團(tuán),通過(guò)不同機(jī)制發(fā)揮抗氧化作用。這些包括氨基酸、肽、抗壞血酸、類胡蘿卜素、酚類化合物等[15-17]。三斑海馬作為一種不可直接食用的海洋硬骨魚,水溶性組分富含多酚、氨基酸、小分子肽。本文三斑海馬水提取物經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱分離得到的不同組分,評(píng)價(jià)其基于DPPH·清除、·OH清除、總還原力、Fe3+螯合能力的抗氧化活性。結(jié)果表明分離組分中的FrⅣ-Ⅵ具有良好的自由基清除能力,在一定濃度范圍內(nèi),抗氧化活性和濃度呈劑量依賴關(guān)系。

酚類化合物是三斑海馬中抗氧化活性較強(qiáng)的成分,其抗氧化活性據(jù)研究表明是由于氧化還原性質(zhì)[18],能夠吸收和中和自由基,淬滅單線態(tài)氧和三重態(tài)氧,或分解過(guò)氧化物。楊梅葉水提物的DPPH自由基清除IC50為73.7 μg/mL,其抗氧化活性和高濃度的酚類化合物有關(guān)[19]。Rossita Shapawi1等[20]評(píng)價(jià)了鮑氏海馬的不同極性提取物的抗氧化性,表明與總酚含量相關(guān),其酚類化合物的分布和極性相關(guān),其中極性較大的水溶性組分的抗氧化活性也較強(qiáng)。

氨基酸常被認(rèn)為是具有協(xié)同作用的抗氧化劑。它們協(xié)同機(jī)制可能有以下兩個(gè)方面解釋:通過(guò)與促進(jìn)氧化的微量金屬螯合或使已被氧化的抗氧化劑得以再生。已經(jīng)表明了氨基酸作為天然食品中具有協(xié)同抗氧化的作用[21]。已經(jīng)研究表明,氨基酸能和其他抗氧化劑產(chǎn)生共價(jià)鍵,形成比抗氧化劑本身的抗氧化活性更高的合成衍生物。同時(shí),氨基酸本身可以作為抗氧劑,張英等[21]研究19種氨基酸對(duì)活性氧自由基的清除能力,表明氨基酸普遍具有生物抗氧化活性。大豆水解物中蛋白肽種類和含量與抗氧化活性存在關(guān)系,分子量減小將有助于提高抗氧化活性,游離氨基酸和小分子肽的抗氧化活性比分子量較大的蛋白活性明顯提高[23]。分離組分中FrⅣ具有較強(qiáng)的抗氧化活性可能與其組分中含有氨基酸、小分子肽、酚類化合物有關(guān),該組分中的氨基酸可能協(xié)同酚類物質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)有力的抗氧化活性。

三斑海馬小分子水提物不同組分的抗氧化活性和氨基酸、小分子肽、酚類化合物有關(guān),且和含量、類型有關(guān)。FrⅣ相對(duì)FrⅠ、FrⅡ的總氨基酸差異不顯著(p>0.05),但是含有較高含量的總酚,其DPPH·清除能力較強(qiáng),表明和總酚含量相關(guān)。FrⅤ、FrⅥ中不含有氨基酸,FrⅤ、FrⅥ的差異在總酚含量和酚類化合物分子量,FrⅥ具有較高含量的總酚,其抗氧化活性強(qiáng)于FrⅤ的。FrⅣ具有較好的DPPH·清除力、·OH清除力、總還原力、鐵離子螯合率,表明其組分中的總酚、氨基酸、小分子肽具有良好的抗氧化活性,或者其表現(xiàn)出的抗氧化活性是氨基酸與其他抗氧化劑協(xié)同作用的結(jié)果。

3　結(jié)論

本文對(duì)三斑海馬水提物的抗氧化活性進(jìn)行探討,初步證實(shí)了三斑海馬小分子水提物具有抗氧化活性,抗氧化活性與組分的酚類、氨基酸含量與種類關(guān)系密切。具體氨基酸以及酚類物質(zhì)的組成有待進(jìn)一步分析,氨基酸是否協(xié)同其他抗氧化劑促進(jìn)抗氧化活性有待進(jìn)一步論證。

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Antioxidant activity of aqueous extract from Three-spot hippocampus

CHEN Li-ping1,SHEN Xuan-ri1,*,CHEN Guo-hua2,SUN Fei-fei1,JIN Mei-na1

(1.College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China;2.College of Ocean,Hainan University,Haikou 570228,China)

The antioxidant capacity of aqueous soluble extract with small molecules of Three-spot hippocampus was investigated. Three-spot seahorse was taken as raw material,extracts were obtained via reflux extraction using 95% ethanol and systematic solvent extraction. Aqueous extract was selected for further analysis amongst the resulted various polar extracts. Six fractions were obtained by eluting through Sephadex G-10 gel filtration chromatography. Anti-oxidative activities of DPPH free radical scavenging,and hydroxyl radical scavenging,total reducing power and ferrous ion chelating ability were determined and evaluated at multiple concentrations and total polyphenols and total amino acids of varying fractions. The results indicated:by contrast,DPPH free radical clearance of FrⅣ was the highest with the of IC50of 0.25 mg/mL. Total reducing power FrⅣ was potent,FrⅣ exhibited the highest capacity for scavenging hydroxyl radical and ferrous ion chelating ability. Collectively,the antioxidant activity of aqueous soluble extract with small molecules of Three-spot hippocampus seemed to have correlation with the distinct contents and types of phenolic compounds,amino acids,small molecular peptides.

Three-spot hippocampus;aqueous extract;antioxidant activity

2015-06-23

陳莉萍(1987-),女,碩士研究生,研究方向:水產(chǎn)品精深加工,E-mail:705285070@qq.com。

申鉉日(1968-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物資源利用、食品科學(xué),E-mail:shenxuanri2009@163.com。

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2013BAB01B04)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)03-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.015