IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中表達(dá)的研究

王雷，劉艷波，王振江，趙信理，沈維高△

IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中表達(dá)的研究

王雷1，劉艷波2，王振江3，趙信理1，沈維高1△

目的 研究白細(xì)胞介素（IL）-17A及其受體（IL-17RA）在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中表達(dá)的差異。方法 收集膠質(zhì)瘤患者50例，按照世界衛(wèi)生組織的分類(lèi)系統(tǒng)分為Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)13例，Ⅳ級(jí)7例。取患者外周血以及膠質(zhì)瘤組織，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IL-17A及IL-17RA的mRNA水平，采用免疫組化和Western blot檢測(cè)IL-17A及IL-17RA的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 免疫組化染色結(jié)果顯示，隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加，IL-17A及其受體IL-17RA表達(dá)增加。外周血中，IL-17A及其受體IL-17RA的mRNA水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加而上升（F分別為8.96、10.34，均P＜0.05）。膠質(zhì)瘤組織中IL-17A及其受體IL-17RA的mRNA水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加而上升（F分別為11.21、14.11，均P＜0.05）。在外周血和膠質(zhì)瘤組織中，IL-17A及其受體IL-17RA的蛋白水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加也上升（外周血F分別為9.90、11.80，均P＜0.05；膠質(zhì)瘤組織F分別為8.15、14.46，均P＜0.05）。結(jié)論 IL-17A及其受體IL-17RA的表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)性。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；白細(xì)胞介素-17A；白細(xì)胞介素-17A受體

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱(chēng)膠質(zhì)瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半，是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一。該疾病具有臨床治療效果差、患者生存時(shí)間短、預(yù)后較差等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的分類(lèi)系統(tǒng)，將腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ4個(gè)等級(jí)，其中Ⅲ和Ⅳ級(jí)惡性程度很高，患者的平均存活時(shí)間僅為1年。

腫瘤除了由腫瘤細(xì)胞組成以外，還包括免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血管和細(xì)胞因子等，因此腫瘤微環(huán)境也是膠質(zhì)瘤的重要成分。細(xì)胞因子在膠質(zhì)瘤的復(fù)雜性和異質(zhì)性中占有重要地位，參與腫瘤的各種行為，包括侵襲、增殖、遷移、血管生成和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)等過(guò)程［1-2］。Th17細(xì)胞以分泌白細(xì)胞介素-17（inter?leukin-17，IL-17）而得名，此外，其還分泌IL-17F、IL-21和IL-22等多種細(xì)胞因子［3］。IL-17具有多種免疫生物學(xué)作用，與多種免疫性疾病及腫瘤都有密切的關(guān)系。IL-17作為一把雙刃劍，具有加速腫瘤生長(zhǎng)和抑制腫瘤發(fā)展的雙重作用［4-5］。IL-17可通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到趨化和遷移作用，上調(diào)和協(xié)同其他血管生成因子表達(dá)等促進(jìn)腫瘤血管的快速生長(zhǎng)［6］。有研究證實(shí)在膠質(zhì)瘤組織中IL-17呈高表達(dá)［7］。也有些研究指出，Th17細(xì)胞在早期的腫瘤組織中比例明顯升高，但隨著疾病的進(jìn)展，Th17細(xì)胞和IL-17A水平反而降低［8］。IL-17A及其受體（IL-17RA）的水平與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血和膠質(zhì)瘤組織中的IL-17A和IL-17RA轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，來(lái)研究IL-17A及其受體IL-17RA在不同惡性程度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，以期為膠質(zhì)瘤惡性程度的臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例及分組 收集2013年3月—2015年3月吉林省北華大學(xué)附屬醫(yī)院、吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院、吉林市人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織共50例。患者年齡35～50歲，平均（43±8）歲。按WHO2007中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，Ⅰ級(jí)12例：毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤；Ⅱ級(jí)18例：彌漫型星形細(xì)胞瘤以及少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤；Ⅲ級(jí)13例：間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤以及彌漫浸潤(rùn)型星形細(xì)胞瘤；Ⅳ級(jí)7例：膠質(zhì)肉瘤以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。收集正常組織10例，來(lái)自單純活檢患者，年齡40～50歲。

1.2 標(biāo)本采集 術(shù)中收集膠質(zhì)瘤組織后儲(chǔ)存于-80℃?；颊咝g(shù)前1 d禁食12 h以上，采集空腹橈靜脈血5 mL，離心收集血清用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3 免疫組化檢測(cè)IL-17A和IL-17RA的表達(dá) 用4%甲醛固定膠質(zhì)瘤組織，進(jìn)行石蠟包埋切片。切片脫蠟后，PBS+5% BSA室溫封閉30 min，洗3次。一抗使用IL-17A山羊抗人IgG和IL-17RA山羊抗人IgG。PBS洗3次，二抗使用生物素化的二抗液，室溫孵育30 min。PBS洗3次，在200倍鏡下進(jìn)行觀察。褐色及棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。視野下僅有清晰藍(lán)色，為正常；鮮有褐色為Ⅰ級(jí)；少量褐色為Ⅱ級(jí)；褐色及棕黃色顆粒較多為Ⅲ級(jí)；褐色及棕黃色顆粒尤為明顯為Ⅳ級(jí)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）檢測(cè)外周血和膠質(zhì)瘤組織中IL-17A和IL-17AR的mRNA水平 分別提取外周血和膠質(zhì)瘤組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體方法參照文獻(xiàn)［9］。按照SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ（TAKARA）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以GAPDH作為內(nèi)參。引物序列如下，GAPDH-F：5′-ACCA?CAGTCCATGCCATCAC-3′；GAPDH-R：5′-TCCACCACCCT?GTTGCTGTA-3′；IL-17A-F：5′-TGCCCCAACTCCTTCCG?GCT-3′；IL-17A-R：5′-GGGTTCCTGAGGGGCTGGGT-3′；IL-17RA-F：5′-GCTGCCTAAATGAC-3′；IL-17RA-R：5′-TGTGAGTAGCGGT-3′?；虻南鄬?duì)水平按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 Western blot檢測(cè)IL17-A和IL17-RA的蛋白水平 分別抽提外周血和膠質(zhì)瘤組織中總蛋白。使用BCA方法確定每個(gè)樣品的蛋白濃度，從而保證蛋白電泳上樣時(shí)蛋白量一致。使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，300 mA轉(zhuǎn)膜60 min。封閉液室溫封閉60 min，一抗4℃過(guò)夜，TBST溶液洗膜10 min，洗3次，二抗室溫60 min，最后TBST溶液洗膜10 min，洗3次，使用ECL發(fā)光采集信號(hào)。β-tublin作為內(nèi)參。使用Image J灰度掃描對(duì)Western blot條帶進(jìn)行量化分析。人IL17 A抗體以及人IL17 RA抗體均購(gòu)自R&D公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料均用±s表示，多組比較用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中IL-17A和IL-17RA的表達(dá) 在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)中可見(jiàn)IL-17A和IL-17RA陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色顆粒，且隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加，棕黃色染色區(qū)域增多，見(jiàn)圖1。相比于IL-17A，IL-17RA棕黃色更重。

2.2 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者外周血以及膠質(zhì)瘤組織中IL-17A、IL-17RA mRNA水平比較 在正常健康人群中，外周血IL-17A、IL-17RA mRNA水平較低，隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增加，IL-17A、IL-17RA mRNA水平逐漸升高，見(jiàn)圖2。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤腦組織中的IL-17A、IL-17RA mRNA水平，也隨著病理分級(jí)的增加而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，見(jiàn)圖3。

Fig.2 The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA in peripheral blood of patients with different grades of gliomas圖2 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者外周血中IL-17A、IL-17RA mRNA水平

Fig.3 The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA in different grades of glioma tissues圖3 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中IL-17A、IL-17RA mRNA水平

2.3 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者外周血以及膠質(zhì)瘤組織中IL-17A、IL-17RA蛋白水平比較 IL-17A、IL-17RA蛋白水平在外周血以及膠質(zhì)瘤組織中均隨著膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的增加而增長(zhǎng)，說(shuō)明膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展能夠刺激機(jī)體分泌大量的IL-17A，并且其受體蛋白IL-17RA也相應(yīng)增加，見(jiàn)圖4、5。

Fig.4 Protein levels of IL-17A and IL-17RA in peripheral blood of patients with different grades of gliomas圖4 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤患者外周血中IL-17A、IL-17RA蛋白水平

3 討論

目前，已有6個(gè)IL-17家族成員被發(fā)現(xiàn)，包括IL-17A（IL-17）、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E（即IL-25）和IL-17F［10］。IL-17A是IL-17家族的原型，IL-17F與IL-17A有約50%的同源性。通常，IL-17家族成員以同源二聚體或異源二聚體的形式行使功能［11-12］。其中，IL-17A、IL-17E及IL-17F是重要的促炎癥因子。

Fig.5 Protein levels of IL-17A and IL-17RA in different grades of glioma tissues圖5 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中IL-17A、IL-17RA蛋白水平

IL-17與多種疾病都是相關(guān)的，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［13］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［14］、炎癥性腸?。?5］、肝硬化［16］等。雖然，炎癥與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注，而IL-17這一促炎癥因子在腫瘤發(fā)生中的作用卻有爭(zhēng)議。一些研究認(rèn)為，IL-17可誘導(dǎo)IL-6活化STAT3途徑，抗凋亡、促生長(zhǎng)和促血管生成基因的表達(dá)，從而起到促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用［17］。另一些研究則認(rèn)為，IL-17可以誘導(dǎo)趨化因子，從而招募樹(shù)突細(xì)胞及殺傷性效應(yīng)T細(xì)胞至腫瘤位置，間接起到抗腫瘤的作用。還有一些觀點(diǎn)認(rèn)為，IL-17在腫瘤中的作用依賴(lài)于發(fā)病背景［18］。為了明確IL-17A與腫瘤之間的關(guān)系，本研究收集了50例臨床樣本，并將其按照惡性程度進(jìn)行分類(lèi)，以期明確IL-17的水平是否與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)，結(jié)果顯示，不論在患者的外周血還是膠質(zhì)瘤組織中，IL-17A和IL-17RA的水平均隨著膠質(zhì)瘤惡性程度增加而上升。

通常，人腦膠質(zhì)細(xì)胞中IL-17的表達(dá)量很低，并且在腫瘤中IL-17是起促進(jìn)或抑制作用主要依賴(lài)腫瘤的免疫原性［19］。IL-17在腦組織中含量少也可能因?yàn)槠鋗RNA中富含AU重復(fù)序列，該序列容易被降解，導(dǎo)致最終的蛋白水平很低；此外，由于IL-17主要由血液中Th17細(xì)胞分泌，通過(guò)血-腦脊液屏障進(jìn)入腦組織，因此IL-17在腦內(nèi)的含量較低［20］。本研究結(jié)果顯示IL-17的表達(dá)量隨腫瘤的惡性程度的升高而增多，這一原因主要是惡性膠質(zhì)瘤中有更多的Th17細(xì)胞浸潤(rùn)。由Th17引起的慢性炎癥反應(yīng)能夠增強(qiáng)腫瘤的代謝，導(dǎo)致腫瘤及其周?chē)M織缺氧，導(dǎo)致血管形成反應(yīng)；同時(shí)，IL-17還會(huì)招募大量效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤，因而腫瘤的惡性程度越高，缺氧越嚴(yán)重，Th17細(xì)胞浸潤(rùn)越多，分泌的IL-17就越多［21-22］。

綜上，IL-17A及IL-17RA在不同惡性程度膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織和外周血中的表達(dá)有明顯差異，與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈正相關(guān)性，表明IL-17A及IL-17RA可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵的作用。IL-17A和IL-17RA的表達(dá)可能會(huì)成為判斷膠質(zhì)瘤惡性程度的參考指標(biāo)，具有重要的臨床價(jià)值。

（圖1見(jiàn)插頁(yè)）

［1］Iwami K，Natsume A，Wakabayashi T.Cytokine networks in glioma ［J］.Neurosurg Rev，2011，34（3）：253-263；discussion 263-264. doi：10.1007/s10143-011-0320-y.

［2］Zhu VF，Yang J，Lebrun DG，et al.Understanding the role of cytokines in Glioblastoma Multiforme pathogenesis［J］.Cancer Lett，2012，316（2）：139-150.doi：10.1016/j.canlet.2011.11.001.

［3］Bettelli E，Korn T，Oukka M，et al.Induction and effector functions of T（H）17 cells［J］.Nature，2008，453（7198）：1051-1057.doi：10.1038/ nature07036.

［4］Murugaiyan G，Saha B.Protumor vs antitumor functions of IL-17［J］. J Immunol，2009，183（7）：4169-4175.doi：10.4049/ jimmunol.0901017.

［5］Ma W，Wang K，Du J，et al.Multi-dose parecoxib provides an immunoprotective effect by balancing T helper 1（Th1），Th2，Th17 and regulatory T cytokines following laparoscopy in patients with cervical cancer［J］.Mol Med Rep，2015，11（4）：2999-3008.doi：10.3892/mmr.2014.3003.

［6］Hu J，Ye H，Zhang D，et al.U87MG glioma cells overexpressing IL-17 acclerate early-stage growth and cause a higher level of CD31 mRNA expression in tumor tissues［J］.Oncol Lett，2013，6（4）：993-999.doi：10.3892/ol.2013.1518.

［7］Hu J，Mao Y，Li M，et al.The profile of Th17 subset in glioma［J］. Int Immunopharmacol，2011，11（9）：1173-1179.doi：10.1016/j. intimp.2011.03.015.

［8］Maruyama T，Kono K，Mizukami Y，et al.Distribution of Th17 cells and FoxP3（+）regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes，tumor-draining lymph nodes and peripheral blood lymphocytes in patients with gastric cancer［J］.Cancer Sci，2010，101（9）：1947-1954.doi：10.1111/j.1349-7006.2010.01624.x.

［9］Cardoso CR，Garlet GP，Crippa GE，et al.Evidence of the presence of T helper type 17 cells in chronic lesions of human periodontal disease［J］.Oral Microbiol Immunol，2009，24（1）：1-6.doi：10.1111/j.1399-302X.2008.00463.x.

［10］Gaffen SL.Structure and signalling in the IL-17 receptor family ［J］.Nat Rev Immunol，2009，9（8）：556-567.doi：10.1038/ nri2586.

［11］Chang SH，Dong C.IL-17F：regulation，signaling and function in inflammation［J］.Cytokine，2009，46（1）：7-11.doi：10.1016/j. cyto.2008.12.024.

［12］Zheng Y，Sun L，Jiang T，et al.TNFalpha promotes Th17 cell differentiation through IL-6 and IL-1beta produced by monocytes in rheumatoid arthritis［J］.J Immunol Res，2014，2014：385352. doi：10.1155/2014/385352.

［13］Kellner H.Targeting interleukin-17 in patients with active rheumatoid arthritis：rationale and clinical potential［J］.Ther Adv Musculoskelet Dis，2013，5（3）：141-152.doi：10.1177/1759720X13485328.

［14］Nalbandian A，Crispin JC，Tsokos GC.Interleukin-17 and systemic lupus erythematosus：current concepts［J］.Clin Exp Immunol，2009，157（2）：209-215.doi：10.1111/j.1365-2249.2009.03944.x.

［15］Gonzalez-Amaro R，Marazuela M.T regulatory（Treg）and T helper 17（Th17）lymphocytes in thyroid autoimmunity［J］.Endocrine，2016，52（1）：30-38.doi：10.1007/s12020-015-0759-7.

［16］Jin L，Zhang JY，Sun HQ，et al.Immunopathogenesis of Th17 cells in patients with HBV-associated liver cirrhosis［J］.Med J Chin PLA，2013，38（1）：62-65.［金磊，張紀(jì)元，孫紅啟，等.Th17細(xì)胞在乙肝肝硬化患者中的免疫致病機(jī)制研究［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38（1）：62-65］.

［17］Wang L，Yi T，Kortylewski M，et al.IL-17 can promote tumor growth through an IL-6-Stat3 signaling pathway［J］.J Exp Med，2009，206（7）：1457-1464.doi：10.1084/jem.20090207.

［18］Zou W，Restifo NP.T（H）17 cells in tumour immunity and immunotherapy［J］.Nat Rev Immunol，2010，10（4）：248-256.doi：10.1038/nri2742.

［19］Cantini G，Pisati F，Mastropietro A，et al.A critical role for regulatory T cells in driving cytokine profiles of Th17 cells and their modulation of glioma microenvironment［J］.Cancer Immunol Immunother，2011，60（12）：1739-1750.doi：10.1007/s00262-011-1069-4.

［20］Kebir H，Kreymborg K，Ifergan I，et al.Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation［J］.Nat Med，2007，13（10）：1173-1175.doi：10.1038/nm1651.

［21］Cui X，Xu Z，Zhao Z，et al.Analysis of CD137L and IL-17 expression in tumor tissue as prognostic indicators for gliblastoma ［J］.Int J Biol Sci，2013，9（2）：134-141.doi：10.7150/ijbs.4891.

［22］Zhang LT，Pang M，Yang XJ.Changes and clinical significances of Th17 cells in the peripheral blood of patients with acute cerebral hemorrhage［J］.Chin J Contemp Neurol Neurosurg，2013，13（7）：628-631.［張立堂，龐敏，楊筱君.急性腦出血患者外周血Th17細(xì)胞變化及其臨床意義［J］.中國(guó)現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2013，13 （7）：628-631］.doi：10.3969/j.issn.1672?6731.2013.07.013.

（2015-11-01收稿 2016-01-30修回）

（本文編輯 閆娟）

A study on the expressions of IL-17A and IL-17RA in different degrees of malignant glioma

WANG Lei1，LIU Yanbo2，WANG Zhenjiang3，ZHAO Xinli1，SHEN Weigao1△
1 Department of Neurosurgery，Beihua University Affiliated Hospital，Jilin 132000，China；2 Department of Pathophysiology，3 Department of Anatomy，School of Basic Medical Sciences，Beihua University△

Objective To explore the expressions of interleukin（IL）-17A and its receptor IL-17RA in different degrees of malignant gliomas.Methods Fifty patients with glioma were collected in this study.Accordance to the World Health Organization Classification System，patients were classified by malignancy grade，including gradeⅠ（n=12），gradeⅡ（n=18），gradeⅢ（n=13）and gradeⅣ（n=7）.The glioma tissue and peripheral blood samples of patients were obtained for detecting the expression levels of IL-17A and IL-17RA mRNA by using immunohistochemistry，quantitative real-time PCR.Western blot assay was used to detect expressions of IL-17A and IL-17RA in both the macroscopic （immunohistochemistry）and molecular levels（mRNA and protein）. Results Immunohistochemical staining showed that the expression levels of IL-17A and its receptor IL-17RA increased with the increase of the malignant degree of gliomas. The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA receptors in peripheral blood were up-regulated with the increasing malignancy grade of glioma（F=8.96，P＜0.05；F=10.34，P＜0.05）.The mRNA levels of IL-17A and IL-17RA in glioma tissues were up-regulated with the increasing malignancy grade of glioma（F=11.21，P＜0.05；F=14.11，P＜0.05）.The protein levels of IL-17A and IL-17RA in peripheral blood and glioma tissues were also up-regulated with the increasing malignancy grade of glioma（in peripheral blood:F=9.90，P＜0.05；F=11.80，P＜0.05；and in gliomas tissues:F=8.15，P＜0.05；F=14.46，P＜0.05）.Conclusion The expressions of IL-17A and IL-17RA receptor are positively correlated with malignancy grade of glioma.These results provide some reference for clinical diagnosis of malignant gliomas.

glioma；interleukin-17A；interleukin-17RA

R739.41

A

10.11958/20150260

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委課題（2014Q038）；吉林省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（2013Z043）

1吉林長(zhǎng)春，北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（郵編132000）；2北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，3解剖教研室

王雷（1978），男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事神經(jīng)外科腫瘤研究

△通訊作者 E-mail：shenweigao@163.com