骨橋蛋白、caspase-3及突變型P53在膠質(zhì)瘤中的表達研究

郭可盈，曾蘇婷，范偉，曹思源，王瑩，陸錦標，王東林

臨床研究

骨橋蛋白、caspase-3及突變型P53在膠質(zhì)瘤中的表達研究

郭可盈，曾蘇婷，范偉，曹思源，王瑩，陸錦標，王東林△

目的 研究膠質(zhì)瘤中骨橋蛋白（OPN）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）和突變型P53（mt-P53）蛋白的表達意義和相關性。方法 選取腦膠質(zhì)瘤（膠質(zhì)瘤組）患者的標本70例，非腦膠質(zhì)瘤腦組織10例作為對照組。應用免疫組織化學SP法檢測2組OPN、caspase-3及mt-P53蛋白的陽性表達率。蛋白免疫印跡法檢測腦膠質(zhì)瘤中OPN、caspase-3和mt-P53蛋白表達與腦膠質(zhì)瘤級別的關系。Spearman等級相關分析OPN、caspase-3和mt-P53表達陽性的關系。結果 腦膠質(zhì)瘤組OPN、mt-P53陽性表達率（64.29%和60%）均高于對照組（無陽性表達），caspase-3陽性率低于對照組（47.14%vs.90%），差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。OPN、caspase-3和mt-P53在腦膠質(zhì)瘤不同性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位組間的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。膠質(zhì)瘤分級越高，OPN和mt-P53的陽性表達率越高，而caspase-3的陽性表達率越低（均P＜0.001）。隨著腦膠質(zhì)瘤級別的增加，OPN和mt-P53蛋白表達水平上調(diào)，而caspase-3的蛋白表達水平下降。OPN與caspase-3陽性表達呈負相關，與mt-P53表達呈正相關（rs分別為-0.720和0.722，P＜0.05），caspase-3和mt-P53表達呈負相關（rs=-0.556，P＜0.05）。結論 膠質(zhì)瘤分級越高，OPN和mt-P53的陽性表達率越高，而caspase-3的陽性表達率越低；三者與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展均密切相關，聯(lián)合檢測有助于對膠質(zhì)瘤生物學行為的判斷。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；骨橋蛋白質(zhì)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；基因，p53

腦膠質(zhì)瘤（glioma）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50%，其發(fā)生是多因素、多基因和多階段共同參與的結果［1］。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是細胞外基質(zhì)中一種重要的多功能分泌性蛋白，與腫瘤細胞的黏附、侵襲及轉移有關［2］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3是細胞凋亡過程的關鍵效應蛋白酶，在腫瘤細胞生長、凋亡和分化等過程中發(fā)揮重要作用［3］。突變型P53 （mutant type P53，mt-P53）可以直接引起細胞周期的紊亂，使相關基因處于不穩(wěn)定狀態(tài)，促進腫瘤的發(fā)生［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，OPN的C-末端裂解片段可使mt-P53轉錄活性和蛋白表達水平增強，導致細胞的異常增殖［5］；OPN的高表達可能會下調(diào)caspase-3的表達，使之失去水解蛋白酶的活性，導致細胞凋亡或抑制［6］。有關OPN、caspase-3和mt-P53與腫瘤的關系已有一些報道，但同時檢測三者在腦膠質(zhì)瘤中的表達及相關性的研究少見。本研究旨在探討OPN、caspase-3和mt-P53在人腦膠質(zhì)瘤中的表達情況及可能作用，以期為腦膠質(zhì)瘤的靶向治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）標本。選取2006年12月—2009年12月于南通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術切除和病理確診的腦膠質(zhì)瘤（腦膠質(zhì)瘤組）患者的標本70例，男38例，女32例，年齡7～74歲，中位年齡47.9歲，均有完整的臨床資料。按WHO 2007年神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤病理學和遺傳學分級標準對所有腫瘤進行組織學分級，Ⅱ級（彌漫性腦膠質(zhì)瘤）30例、Ⅲ級（間變性腦膠質(zhì)瘤）18例、Ⅳ級（多形性膠質(zhì)母細胞瘤）22例。另采用同期10例非腦膠質(zhì)瘤腦組織作為對照組，男5例，女5例，年齡8～74歲，中位年齡48.1歲，均來自南通大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行腦外傷內(nèi)減壓術者。腦組織均于-80℃冰箱凍存。（2）主要試劑。APES濃縮液、抗體稀釋液購自北京中山生物技術有限公司；山羊血清購自上海華美生物工程公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；兔抗人OPN多克隆抗體（sc-3044）、兔抗人caspase-3多克隆抗體（sc-7148）、兔抗人mt-P53單克隆抗體（sc-6143）、鼠抗人β-actin單克隆抗體（sc-47778）均購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學SP法檢測OPN、caspase-3及mt-P53蛋白的表達 所取組織均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，貼于APES處理過的載玻片上；脫蠟、水化組織切片；抗原修復：高壓鍋內(nèi)加適量的水置電爐上煮沸，將切片浸入裝有0.01 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 6.0）的燒杯中，高壓鍋內(nèi)加熱至噴氣，維持3 min。取出切片使其自然冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次。3%H2O2去離子水室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次；甩去切片上的PBS，滴加一抗，各抗體稀釋度分別為OPN（1∶200），caspase-3（1∶50）及mt-P53（1∶100），室溫孵育1 h后4℃過夜。0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次；滴加試劑Polymer Helper：擦去多余水分，滴加試劑Polymer Helper，37℃孵育20 min。0.01 mol/L PBS沖洗3 min×3次；滴加HRP標記的二抗；DAB顯色；蘇木素復染細胞核；乙醇梯度脫水；中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知陽性切片為陽性對照。

1.2.2 蛋白免疫印跡法檢測腦膠質(zhì)瘤中OPN、caspase-3和mt-P53蛋白表達與腦膠質(zhì)瘤級別的關系 從70例腦膠質(zhì)瘤標本中抽取20例用于蛋白免疫印跡實驗。將標本從-80℃冰箱取出后放入冰水混合物中復溫30 min；稱質(zhì)量，放入離心管，按1 mL/100 mg加入蛋白裂解液；在冰浴的基礎上勻漿、打碎、離心，采用紫外分光光度儀測定上清液蛋白質(zhì)的含量，-80℃保存?zhèn)溆?。進行SDS-PAGE凝膠電泳；將蛋白質(zhì)轉移到PVDF膜；室溫條件下將取出的轉印膜置入含5%脫脂奶粉的TBST的封閉液中2 h；室溫1 h，4℃過夜的條件下用5%脫脂奶粉的TBST稀釋的一抗孵育轉印膜（各抗體稀釋度分別為OPN 1∶500，caspase-3 1∶500及mt-P53 1∶1 000）；二抗（HRP偶聯(lián)，1∶2 000）室溫孵育2 h；同體積混合Luminol Ecl Reagent A和B液，加入膜上，并于室溫1 min孵育；在暗室內(nèi)顯影和定影。以β-actin為內(nèi)參照。

1.2.3 結果判斷 OPN和caspase-3表達陽性為細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒；mt-P53表達陽性為細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒。在高倍（×400）視野下隨機讀取10個代表性腫瘤區(qū)域，避開出血壞死區(qū)域，參照Remmele等［7］提出的免疫反應積分法（IRS）判斷OPN、caspase-3和mt-P53免疫組化結果。（1）陽性細胞所占百分比（PP）：無陽性細胞0分；陽性細胞＜10%1分；10%～50%2分；＞50%～＜75%3分；≥75%4分。（2）陽性染色強度（SI）：無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。（3）IRS=PP×SI，IRS計0分為陰性表達“-”；計1～4分為“+”；計5～8分為“++”；計9～12分為“+++”?！?～+++”為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。計量資料如滿足參數(shù)檢驗的要求，2組比較用t檢驗，多組比較用方差分析；如不滿足參數(shù)檢驗的要求，則采用秩和檢驗；OPN、caspase-3和mt-P53三者間陽性表達的關系采用分類變量的關聯(lián)性分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中OPN、caspase-3和mt-P53的表達 腦膠質(zhì)瘤組OPN陽性表達率64.29%（45/70）高于對照組（0/10）；caspase-3陽性表達率47.14% （33/70）低于對照組90%（9/10）；mt-P53陽性表達率60%（42/70）高于對照組（0/10；χ2分別為42.003、37.638及32.127，均P＜0.001），見圖1。

2.2 腦膠質(zhì)瘤中OPN、caspase-3、mt-P53與臨床病理學指標的關系 OPN、caspase-3和mt-P53在不同性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤部位組間的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。膠質(zhì)瘤分級越高，OPN和mt-P53的陽性表達率越高，而caspase-3的陽性表達率越低（均P＜0.001），見表1。

Fig.1 The positive expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 in gliomas tissue（SP，×400）圖1 腦膠質(zhì)瘤組織OPN、caspase-3和mt-P53的陽性表達結果（SP，×400）

Tab.1 The expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 in patients with different clinical and pathological features表1 OPN、caspase-3和mt-P53在不同臨床病理特征中的表達情況比較 例（%）

2.3 腦膠質(zhì)瘤中OPN、caspase-3和mt-P53蛋白表達水平與腦膠質(zhì)瘤級別的關系 隨著腦膠質(zhì)瘤級別的增加，OPN和mt-P53蛋白表達水平上調(diào)，而caspase-3的蛋白表達水平下降，見圖2、表2。

Fig.2 The protein expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 in gliomas of gradesⅡ，ⅢandⅣ圖2 Ⅱ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤中OPN、caspase-3和mt-P53蛋白水平的表達

Tab.2 The protein expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 in gliomas of gradesⅡ，ⅢandⅣ表2 OPN、caspase-3和mt-P53在Ⅱ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤中的蛋白表達情況 （±s）

Tab.2 The protein expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 in gliomas of gradesⅡ，ⅢandⅣ表2 OPN、caspase-3和mt-P53在Ⅱ～Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤中的蛋白表達情況 （±s）

＊＊P＜0.01；a與Ⅱ，b與III比較，P＜0.05

腫瘤分級Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級F n 30 18 22 OPN 4.114±0.291 6.094±0.454a7.707±0.285ab206.913＊＊mt-P53 3.681±0.304 5.535±0.159a6.945±0.227ab761.906＊＊caspase-3 7.833±0.369 7.153±0.202a3.031±0.224ab990.804＊＊

2.4 OPN、caspase-3和mt-P53在腦膠質(zhì)瘤中陽性表達的相關性 OPN與caspase-3陽性表達呈負相關，與mt-P53表達呈正相關；caspase-3和mt-P53表達呈負相關（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 The positive expression rates of OPN，caspase-3 and mt-P53 in gliomas表3 腦膠質(zhì)瘤中OPN、caspase-3和mt-P53的陽性表達的關系

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，多呈侵襲性生長，對腦組織有彌漫性的浸潤破壞作用；周圍組織受腫瘤的壓迫水腫，可產(chǎn)生明顯局部癥狀，造成神經(jīng)功能缺失；與周圍正常組織無明顯分界，導致手術時無法將腫瘤組織全切。

3.1 OPN與腦膠質(zhì)瘤的關系 人OPN基因是一個獨立編碼基因，位于染色體4q13，長8 kb，由7個外顯子和6個內(nèi)含子構成。研究認為，OPN在多種實體腫瘤如食管癌、肝癌、胃癌、結腸癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等組織中表達普遍增高，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關［8］。Jan等［9］研究顯示，OPN主要定位于神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表達陽性的細胞，可通過調(diào)節(jié)維護腦組織細胞穩(wěn)定性的波形蛋白和GFAP的表達，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲；同時，OPN表達水平與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9的表達呈正相關，OPN通過激活MMP-2、MMP-9等蛋白酶來降解細胞外基質(zhì)、促進腫瘤血管生成，參與腫瘤生長、黏附和侵襲。Wang等［10］研究發(fā)現(xiàn)，OPN在肺癌中較正常肺組織表達升高，通過RNA干擾技術下調(diào)OPN的表達后可以降低體內(nèi)、外腫瘤細胞的侵襲和轉移。Lu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤細胞中OPN可以通過上調(diào)heme oxygenase-1基因的表達，促進細胞的遷移和侵襲。本研究結果顯示，非腦膠質(zhì)瘤組織不表達OPN，而腦膠質(zhì)瘤中OPN陽性表達率為64.29%，提示OPN可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生，與上述研究結果一致。同時，本研究結果還顯示，隨著病理組織學分級增高腦膠質(zhì)瘤組織中OPN表達升高，Jin等［12］研究認為OPN可能通過其氨基端（N-端）、整合素受體ανβ3結合激活黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）和細胞核因子-κB等信號途徑，加速細胞增殖，促進細胞外基質(zhì)降解和侵襲性生長。

3.2 caspase-3與腦膠質(zhì)瘤的關系 細胞凋亡異常在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，caspase-3在凋亡過程中起樞紐作用，是介導細胞凋亡的關鍵執(zhí)行因子［13］。Ma等［14］研究發(fā)現(xiàn)，caspase-3在乳頭狀瘤、導管內(nèi)癌和浸潤性導管癌等不同類型乳腺腫瘤中的表達逐漸減弱，其陽性表達與乳腺浸潤性導管癌病理分期、淋巴結轉移、組織病理學分級有關，與患者年齡、腫瘤大小無關。Bellini等［15］研究也發(fā)現(xiàn)，正常食管黏膜、慢性食管炎、不典型增生和食管癌中caspase-3的表達水平逐漸下調(diào)。另有研究顯示，與正常組織相比，卵巢上皮性腫瘤、口腔鱗狀細胞癌、胃癌、結腸癌、胰腺癌、肝癌等腫瘤組織中caspase-3表達降低［16］。本研究結果顯示，腦膠質(zhì)瘤腦組織中caspase-3陽性表達率低于非腦膠質(zhì)瘤組織，且隨著腦膠質(zhì)瘤分級增高caspase-3表達降低，此結果與上述報道一致，表明caspase-3低表達與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生及侵襲有關。

3.3 P53與腦膠質(zhì)瘤的關系 P53基因分野生型P53基因（wt-P53）和mt-P53，wt-P53是抑癌基因，mt-P53則失去了抑制腫瘤的作用，可使基因組處于不穩(wěn)定狀態(tài)，被激活后許多下游靶基因會出現(xiàn)表達水平改變［17］。蘇曉路等［18］研究發(fā)現(xiàn)，mt-P53在大腸癌組織中的陽性表達率（57%）高于癌旁組織（20%）和正常大腸組織（0），mt-P53在腫瘤細胞的陽性表達率與淋巴結轉移和Duke’s分期有關。Walerych等［19］研究認為，mt-P53在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起致癌因子的作用。Vaughan等［20］研究發(fā)現(xiàn)，70%的肺癌有P53突變，mt-P53過表達可以上調(diào)Axl，進而促進肺癌細胞的侵襲。Muller等［21］發(fā)現(xiàn)，mt-P53可增強MET信號通路，進而促進腫瘤細胞的分散和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，mt-P53在腦膠質(zhì)瘤中的陽性表達率為60%，隨著腦膠質(zhì)瘤級別的增加，mt-P53表達增加，與上述文獻報道一致，提示P53基因突變后，受損細胞可能進入S期并將突變的DNA序列傳給子代，使正常細胞發(fā)生惡性轉化和增殖。

3.4 OPN、caspase-3、P53對腦膠質(zhì)瘤的共同影響 本研究結果顯示，70例腦膠質(zhì)瘤中OPN、mt-P53陽性表達均與caspase-3陽性表達呈負相關，OPN與mt-P53表達呈正相關，提示三者在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能具有協(xié)同作用，使腫瘤細胞凋亡減少，不斷增殖，從而導致腫瘤的侵襲性生長。

綜上所述，OPN、mt-P53與caspase-3三者在腦膠質(zhì)瘤的表達情況具有較大的關聯(lián)，對它們進行聯(lián)合檢測，有助于對腦膠質(zhì)瘤生物學行為的判斷，為進一步研究腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制及治療方案的選擇提供參考。

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（2015-10-10收稿 2016-01-04修回）

（本文編輯 陸榮展）

The study on expressions of osteopontin，caspase-3 and mt-P53 in glioma

GUO Keying，ZENG Suting，F(xiàn)AN Wei，CAO Siyuan，WANG Ying，LU Jinbiao，WANG Donglin△Department of Pathology，School of Medicine，Nantong University，Nantong 226001，China△

Objective To study the expressions of osteopontin（OPN），caspase-3 and mt-P53 proteins，and their relationship in gliomas.Methods Seventy gliomas specimens of patients（glioma group）were selected，and 10 samples of non-glioma brain tissue were used as control group.The SP method was used to detect the positive rates of protein expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 between two groups.The relationship between protein expressions of OPN，caspase-3 and mt-P53 in gliomas and grade of gliomas were detected by Western blot assay.Spearman rank correlation was compared between the positive expression of OPN，caspase-3 and rate mt-P53.Results The positive expression rates of OPN and mt-P53 were significantly higher in glioma group（64.29%and 60%）than those of control group（no positive expression），but the positive expression rate of caspase-3 was significantly lower than that of control group（47.14%vs.90%，P＜0.05）.There were no significant differences in OPN，caspase-3 and mt-P53 expressions between different gender，age，tumor size and tumor position（P＞0.05）.The higher the WHO classification，the higher the positive expression rates of OPN and mt-P53（P＜0.001），and the lower the positive expression rate of caspase-3（P＜0.001）.With the increased level of glioma grade，OPN and mt-P53 protein levels were increased，but caspase-3 protein expression level was decreased.There was a negatively correlation between OPN and the positive expression of caspase-3，but there was a positive correlation between OPN and the expression of mt-P53（rs=-0.720 and 0.722，P＜0.05）.There was a negative correlation between caspase-3 and mt-P53 expressions（rs=-0.556，P＜0.05）.Conclusion The higher the WHO classification，the higher the positive expression rates of OPN and mt-P53，while the lower the positive expression rate of caspase-3.The study reveals that OPN，caspase-3 and mt-P53 expressions are associated with the occurrence and the progress of gliomas. The combined detection of them can contribute to the judgment of biological behavior of gliomas.

glioma；osteopontin；caspase 3；genes，p53

R739.41

A

10.11958/20150213

國家自然科學基金資助項目（81272789）；南通大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（2014091）

南通大學醫(yī)學院病理學系（郵編226001）

郭可盈（1994），女，本科在讀，主要從事膠質(zhì)瘤研究

△通訊作者 E-mail:donglin@ntu.edu.cn