肺腫瘤小鼠MDSC、Treg及傳統(tǒng)T細(xì)胞變化研究

鄭愛華，鄭全輝，張愛紅

肺腫瘤小鼠MDSC、Treg及傳統(tǒng)T細(xì)胞變化研究

鄭愛華1，鄭全輝2△，張愛紅1

目的 探討肺腫瘤小鼠骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和傳統(tǒng)T細(xì)胞的變化及機(jī)制。方法 采用配對(duì)設(shè)計(jì)將20只C57BL/6小鼠隨機(jī)均分為L(zhǎng)ewis肺癌細(xì)胞注射組（LLC組）和正常對(duì)照組（NC組），LLC組采用皮下注射LLC細(xì)胞100 μL（1×106）制備肺腫瘤小鼠模型，對(duì)照組注射等量生理鹽水。待腫瘤形成后取小鼠脾細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺腫瘤小鼠MDSC、Treg及CD4+和CD8+T細(xì)胞比例和數(shù)量變化，膜聯(lián)蛋白-V（Annexin-Ⅴ）染色檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞凋亡變化，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）染色檢測(cè)CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖變化。結(jié)果 與NC組相比，LLC組脾臟MDSC比例和數(shù)量明顯增加，CD4+Foxp3+Treg所占CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量明顯增加，而CD4+和CD8+T細(xì)胞所占脾細(xì)胞比例和數(shù)量明顯降低（均P＜0.05）。與NC組相比，LLC組CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖明顯降低，同時(shí)CD8+T細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論 MDSC和Treg細(xì)胞在肺腫瘤小鼠數(shù)量增加，同時(shí)，MDSC和Treg抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖，并促進(jìn)CD8+T細(xì)胞凋亡。

肺腫瘤；癌，Lewis肺；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；CD4陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞；CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；骨髓源性抑制細(xì)胞

肺癌目前仍是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展的免疫學(xué)病理機(jī)制仍不明確。正常的免疫應(yīng)答狀態(tài)是機(jī)體抵抗腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素，其中，CD4+和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮主要作用，而骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則主要發(fā)揮免疫抑制功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者免疫功能往往處于失調(diào)狀態(tài)，這種免疫失調(diào)狀態(tài)伴隨機(jī)體免疫細(xì)胞亞群變化，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。本研究以皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞建立腫瘤小鼠模型，探討肺腫瘤小鼠效應(yīng)性CD4+和CD8+T細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性MDSC和Treg細(xì)胞的數(shù)量變化及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系（LLC）購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，在含10%胎牛血清及雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/L）的DMEM（GIBCO公司）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為飽和濕度、37℃、5%CO2，2～3 d更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞總數(shù)達(dá)到95%融合時(shí)用0.25%胰酶及0.02% EDTA溶液消化、傳代培養(yǎng)。

1.1.2 動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠20只，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院［許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0017］，在華北理工大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑及儀器 紅細(xì)胞裂解液、Fc受體阻斷劑（2.4G2）、PerCP標(biāo)記大鼠抗小鼠CD4（RM-4.5）、PE標(biāo)記大鼠抗小鼠CD8a（53-6.7）、FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD25（7D4）、PE標(biāo)記大鼠抗小鼠Gr-1（RB6-8C5）、FITC標(biāo)記大鼠抗小鼠CD11b（M1/70）、膜聯(lián)蛋白-V（Annexin-Ⅴ）凋亡染色試劑盒、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)BD公司。PE標(biāo)記大鼠抗小鼠Foxp3抗體（FJK-16S）及Foxp3細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。低溫冷凍離心機(jī)為德國(guó)Beckman公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀FACS Calibur為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肺腫瘤小鼠模型的制備 消化、收集LLC細(xì)胞，離心去上清，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，將細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力＞95%。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。取6～8周齡小鼠20只，雌雄各半，采用配對(duì)設(shè)計(jì)隨機(jī)分成正常對(duì)照（normal control，NC）組和LLC組，每組10只。小鼠皮膚進(jìn)行乙醇消毒后LLC組每只于腋窩皮下注射LLC細(xì)胞100 μL（1×106），NC組注射等量生理鹽水。

1.2.2 免疫細(xì)胞表面分子染色 于腫瘤形成后約2周處死小鼠。分離脾臟并制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整各組織細(xì)胞懸液濃度為1×107/mL，各取100 μL加入流式管中，加入2.4G2，4℃封閉10 min，然后直接加入10 μL（1∶10～1∶100稀釋）熒光素標(biāo)記的抗細(xì)胞表面分子抗體，4℃避光染色30 min。細(xì)胞染色緩沖液離心洗滌2次（每次1 000 r/min，5 min）后上機(jī)檢測(cè)，CD11b+Gr1+MDSC細(xì)胞、CD4+CD25+T細(xì)胞、CD4+和CD8+T細(xì)胞所占脾細(xì)胞比例（即MDSC ratio、CD4+CD25+T ratio、CD4+T ratio、CD8+T ratio）采用CellQuest軟件分析獲得，以上不同免疫細(xì)胞亞群數(shù)量由其所占脾細(xì)胞比例乘以脾細(xì)胞總數(shù)獲得。細(xì)胞凋亡分析采用Annexin V染色試劑盒，按說(shuō)明書操作，數(shù)據(jù)分析同上。

1.2.3 Foxp3細(xì)胞內(nèi)染色 取以上脾細(xì)胞懸液，按上述步驟進(jìn)行淋巴細(xì)胞CD4、CD25表面分子染色。細(xì)胞染色緩沖液離心洗滌2次后收集細(xì)胞，每管加入100 μL細(xì)胞固定/打孔液，充分混勻后4℃避光放置20 min。每管用1 mL打孔/洗滌緩沖液，離心洗滌2次（每次1 000 r/min，5 min）后收集細(xì)胞，每管用100 μL打孔/洗滌緩沖液重懸，加入適量稀釋的Foxp3抗體，4℃避光染色30 min。每管用1 mL打孔/洗滌緩沖液，離心洗滌2次后上機(jī)檢測(cè)，CD4+Foxp3+Treg所占CD4+T細(xì)胞比例（CD4+Foxp3+Treg/CD4+T ratio）和數(shù)量分析同上。

1.2.4 BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖 小鼠每24 h腹腔注射BrdU溶液，每只1 mg，連續(xù)注射3 d。處死后收集脾臟細(xì)胞，首先進(jìn)行細(xì)胞表面染色，4℃30 min。細(xì)胞經(jīng)固定、透膜后加入DNase I（100 mg/L），37℃，1 h，加入熒光素標(biāo)記抗BrdU單克隆抗體染色，流式細(xì)胞儀分析及數(shù)據(jù)處理同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺腫瘤模型制備 與NC組相比，LLC組1周后腋下開始出現(xiàn)可觸及的腫瘤，全部成瘤，3周后腫瘤明顯增大，幾乎累及整個(gè)腋窩，解剖小鼠后可見明顯腫瘤團(tuán)塊形成，表明腫瘤模型制備成功，見圖1。

Fig.1 Mouse lung tumor models were made by subcutaneous injection of LLC cells in armpit圖1 小鼠皮下肺腫瘤模型制備

2.2 肺腫瘤小鼠MDSC和Treg細(xì)胞變化 與NC組相比，LLC組MDSC所占脾細(xì)胞比例和數(shù)量顯著增加（P＜0.01）。2組CD4+CD25+T細(xì)胞所占脾細(xì)胞比例和數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但LLC組CD4+Foxp3+Treg所占CD4+T細(xì)胞比例和數(shù)量較NC組明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），見圖2、表1。

2.3 肺腫瘤小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞變化 與NC組相比，LLC組脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞所占脾細(xì)胞比例和數(shù)量均明顯降低（P＜0.05），見圖3、表2。

2.4 小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞凋亡和增殖變化 2 組CD4+T細(xì)胞凋亡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與NC組相比，LLC組CD8+T細(xì)胞凋亡比例增加，CD4+和CD8+T細(xì)胞增殖降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3、圖4。

Fig. 2 The changes of MDSC and Treg cells in the spleen of LLC injected mice detected by flow cytometry圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)2 組小鼠脾臟MDSC 和Treg 細(xì)胞變化

Tab.1 Comparison of the ratio and number of MDSC and Treg cells between two groups表12組小鼠MDSC和Treg細(xì)胞比例和數(shù)量比較（n=10，±s）

Tab.1 Comparison of the ratio and number of MDSC and Treg cells between two groups表12組小鼠MDSC和Treg細(xì)胞比例和數(shù)量比較（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別NC組LLC組t MDSC數(shù)量（×107）0.379±0.058 1.614±0.164 14.596＊＊MDSC ratio （%）5.871±1.183 17.886±1.812 11.406＊＊CD4+CD25+T ratio （%）2.828±0.609 2.328±0.422 1.760組別NC組LLC組t CD4+CD25+T數(shù)量（×107）0.177±0.038 0.191±0.028 1.637 CD4+Foxp3+Treg/ CD4+T ratio（%）10.015±1.164 21.972±2.032 13.342＊＊CD4+Foxp3+Treg數(shù)量（×107）0.118±0.015 0.191±0.051 3.736＊

Fig.3 The changes of CD4+and CD8+T cells in the spleen of two groups of mice detected by flow cytometry圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)2組小鼠脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞變化

Tab.2 Comparison of the ratio and number of CD4+and CD8+T cells between two groups表2 2組小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞比例和數(shù)量比較 （n=10，x±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis and proliferation of CD4+ and CD8+T cells between two groups of mice 表3 2組小鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞凋亡和增殖比較 （n=10，%，?±s）

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展伴隨機(jī)體免疫功能的異常變化，而這種變化往往與各種免疫細(xì)胞亞群的數(shù)量或功能改變密切相關(guān)。雖然機(jī)體有多種免疫細(xì)胞參與對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和清除，但傳統(tǒng)T細(xì)胞仍是抗腫瘤免疫的主力軍［2］。其中，CD8+效應(yīng)T細(xì)胞通過釋放穿孔素/顆粒酶，表達(dá)膜型FasL以及分泌腫瘤壞死因子（TNF）-α等機(jī)制直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而CD4+效應(yīng)T細(xì)胞則進(jìn)一步通過釋放Th1型細(xì)胞因子促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性［3］。然而，在機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答作用下，許多腫瘤仍能在體內(nèi)進(jìn)行性生長(zhǎng)，表明腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，或產(chǎn)生抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。MDSC和Treg是兩個(gè)發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞群，MDSC主要由未成熟的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及粒細(xì)胞組成。人MDSC被確定為CD33+CD11b+HLA-DRlow/-，小鼠MDSC被確定為Gr1+CD11b+［4］。Treg是一群細(xì)胞表面高表達(dá)白細(xì)胞介素（IL）-2受體α鏈（CD25），胞質(zhì)中表達(dá)Foxp3轉(zhuǎn)錄因子的CD4+T細(xì)胞亞群。MDSC主要通過分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β、IL-10等細(xì)胞因子抑制免疫應(yīng)答，而Treg既可通過細(xì)胞間直接接觸，也可通過產(chǎn)生TGF-β、IL-35等細(xì)胞因子抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞增殖［5-6］。

近年來(lái)研究表明，MDSC在多種因素引起的慢性炎癥和幾乎各種腫瘤發(fā)展過程中出現(xiàn)，主要由CD11b+Ly6CloLy6G+非成熟粒細(xì)胞和 CD11b+Ly6ChiLy6G-單核細(xì)胞組成［7-8］。本研究中采用LLC細(xì)胞腋下注射制備肺腫瘤小鼠模型，主要觀察了肺腫瘤形成早期（3周）不同免疫細(xì)胞變化。與以往研究結(jié)果一致［9-11］，本研究顯示MDSC在LLC細(xì)胞同系移植誘導(dǎo)的肺腫瘤小鼠中明顯增加，Treg在肺腫瘤小鼠中也呈明顯上升趨勢(shì)。Treg既可從胸腺中自然產(chǎn)生，具有CD4+CD25+表型，也可由外周CD4+CD25-初始T誘導(dǎo)產(chǎn)生，而轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)與否決定其是否具有真正Treg功能［12］。本研究表明，雖然Foxp3表達(dá)在肺腫瘤小鼠CD4+T中顯著增加，但CD4+CD25+T細(xì)胞的比例和數(shù)量沒有明顯變化，說(shuō)明肺腫瘤小鼠中增多的Treg主要由外周誘導(dǎo)產(chǎn)生。

本研究表明，與MDSC和Treg在肺腫瘤小鼠中的上升趨勢(shì)相反，CD4+和CD8+T細(xì)胞在肺腫瘤小鼠中明顯減少，其原因主要來(lái)源于二者增殖能力的顯著降低。另外，肺腫瘤小鼠CD8+T細(xì)胞凋亡比例也明顯增加。研究發(fā)現(xiàn)，MDSC除能大量產(chǎn)生IL-10、 TGF-β等免疫抑制性細(xì)胞因子外，還高表達(dá)精氨酸酶、一氧化氮合酶以及合成大量活性氧［13］。精氨酸酶、一氧化氮合酶可加速精氨酸的分解和一氧化氮的合成，而精氨酸減少最終將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的活化和增殖受阻［14］。另外，一氧化氮不但通過抑制IL-2受體下游信號(hào)蛋白抑制T細(xì)胞活化，而且通過活化Fas-FasL途徑促進(jìn)T細(xì)胞凋亡［15］。另有研究表明，腫瘤患者CD8+T細(xì)胞Fas表達(dá)增加，對(duì)MDSC或Treg誘導(dǎo)的凋亡敏感性增強(qiáng)［16］。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)肺腫瘤小鼠MDSC和Treg細(xì)胞比例和數(shù)量增加，而CD4+、CD8+T細(xì)胞則出現(xiàn)明顯的增殖受阻和凋亡增加，導(dǎo)致其細(xì)胞數(shù)量減少，提示肺腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程伴隨機(jī)體免疫功能的復(fù)雜變化，表現(xiàn)為抑瘤功能減弱，而促進(jìn)腫瘤發(fā)展的因素逐漸增強(qiáng)。因此，如何采取有效方法逆轉(zhuǎn)荷瘤機(jī)體的這一免疫功能變化將為臨床腫瘤患者治療提供新的思路。本研究主要探討了肺腫瘤形成早期以上免疫細(xì)胞變化，采用原位肺腫瘤小鼠模型進(jìn)一步探討肺腫瘤形成晚期免疫細(xì)胞數(shù)量和功能變化，以及肺腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞的影響尚需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中逐步加以闡明。

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（2015-11-20收稿 2016-03-24修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Changes of MDSC，Treg and traditional T cells in lung tumor mice

ZHENG Aihua1，ZHENG Quanhui2△，ZHANG Aihong1
1 Department of Emergency Medicine，Tangshan Gongren Hospital，Tangshan 063000，China；2 School of Basic Medicine，North China University of Science and Technology△

Objective To explore changes of the myeloid derived suppressor cell（MDSC），regulatory T cell（Treg），traditional T cell，and their mechanisms in lung tumor mice.Methods Twenty C57BL/6 mice were randomly divided into the experimental and the normal control groups.The experimental group was injected with Lewis lung cancer cells（LLC，100 μL 1×106）subcutaneously to prepare the lung tumor model mice，the normal control group was given the same amount of saline（NC）.Spleen cells were obtained from LLC and NC groups.Flow cytometry was used to detect the ratio and number changes of MDSC，Treg，CD4+and CD8+T cells in the lung tumor of mice.CD4+and CD8+T cell apoptosis were detected by Annexin-Ⅴstaining，and their proliferation were detected by 5-bromine deoxidization uracil nucleoside（BrdU）incorporation. Results Compared with normal control mice，the ratio and number of MDSC in spleen increased significantly in LLC group （P＜0.01），in addition，the ratio of CD4+Foxp3+Treg in CD4+T cells and their number in spleen increased significantly in LLC group.However，the ratio and number of CD4+and CD8+T cells in spleen decreased significantly in LLC group（P＜0.05）. The proliferation of CD4+and CD8+T cells decreased significantly in LLC group compared with that of NC group（P＜0.05），while the apoptosis of CD8+T cells increased significantly（P＜0.05）.Conclusion MDSC and Treg cells increase in lung tumor model mice，which inhibit proliferation of CD4+and CD8+T cells and promote apoptosis of CD8+T cells.

lung neoplasms；carcinoma，Lewis lung；T-lymphocytes，regulatory；CD4-positive T-lymphocytes；CD8-positive T-lymphocytes；cell proliferation；apoptosis；myeloid derived suppressor cell

R392.11

A

10.11958/20150345

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373111）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013209019）

1唐山市工人醫(yī)院急診內(nèi)科（郵編063000）；2華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

鄭愛華（1981），女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)治療相關(guān)研究

△通訊作者 E-mail:zhqhdlp@sohu.com