白藜蘆醇對(duì)H2O2及TGF-β2誘導(dǎo)人小梁網(wǎng)細(xì)胞的影響及機(jī)制探討

齊艷，趙秀娟，徐琳琪，吳旭東△，汪建濤

細(xì)胞與分子生物學(xué)

白藜蘆醇對(duì)H2O2及TGF-β2誘導(dǎo)人小梁網(wǎng)細(xì)胞的影響及機(jī)制探討

齊艷1，2，趙秀娟2，徐琳琪1，2，吳旭東2△，汪建濤1△

目的 觀察過(guò)氧化氫（H2O2）及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β2誘導(dǎo)人小梁網(wǎng)細(xì)胞（HTMCs）后對(duì)纖維連接蛋白（FN）、膠原蛋白1型（COL1）、核因子（NF）-κB P65蛋白和白細(xì)胞介素（IL）-1β基因表達(dá)的影響及白藜蘆醇（RSV）的干預(yù)作用。方法 （1）選取匯合度70%～80%的HTMCs分為5組。實(shí)驗(yàn)組于無(wú)血清培養(yǎng)基中分別加入濃度為150、300、450、800 μmol/L的H2O2處理，對(duì)照組的培養(yǎng)基中不加H2O2。Western blot法檢測(cè)各組FN、COL1、NF-κB P65、NF-κB P65磷酸化（P-NF-κB P65）蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)IL-1β基因的表達(dá)。（2）HTMCs細(xì)胞分為3組。對(duì)照組以不含H2O2及RSV的無(wú)血清培基處理，H2O2組以300 μmol/L的H2O2處理，H2O2+RSV組同時(shí)加入300 μmol/L的H2O2及25 μmol/L的RSV處理。檢測(cè)各組上述蛋白和基因的表達(dá)情況。免疫熒光檢測(cè)各組NF-κB P65 在HTMCs中的定位。（3）HTMCs細(xì)胞分為3組。對(duì)照組以不含TGF-β2及RSV的無(wú)血清培基處理，TGF-β2組以5 μg/L的TGF-β2處理，TGF-β2+RSV組為同時(shí)加入5 μg/L的TGF-β2及25 μmol/L的RSV處理。檢測(cè)各組上述蛋白和基因的表達(dá)情況。結(jié)果 （1）與對(duì)照組比較，150、300、450、800 μmol/L組FN和P-NF-κB P65蛋白表達(dá)水平均增高，300、450、800 μmol/L組COL1蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平增高（P＜0.05），其他指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）H2O2組較對(duì)照組FN、COL1、P-NF-κB P65蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平均增高，而H2O2+RSV組較H2O2組上述指標(biāo)均降低，H2O2+RSV組較對(duì)照組僅IL-1β降低（P＜0.05）。對(duì)照組僅細(xì)胞質(zhì)表達(dá)NF-κB P65，H2O2組細(xì)胞胞質(zhì)及核中均有NF-κB P65表達(dá)，且核中表達(dá)較多；H2O2+RSV組細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)NF-κB P65較核中多。（3）TGF-β2組較對(duì)照組FN、COL1、P-NF-κB P65的蛋白和IL-1β基因水平表達(dá)均增高（P＜0.05），TGF-β2+RSV組較TGF-β2組上述指標(biāo)均降低（P＜0.05）。結(jié)論 H2O2和TGF-β2能上調(diào)HTMCs的FN、COL1、P-NF-κB P65蛋白及IL-1β基因的表達(dá)，可能參與青光眼的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。RSV能抑制H2O2和TGF-β2對(duì)HTMCs的影響，對(duì)青光眼發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

青光眼；小梁網(wǎng)；過(guò)氧化氫；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2；細(xì)胞外基質(zhì)；核因子-κB；白細(xì)胞介素1β；纖維連接蛋白；膠原蛋白1型；白藜蘆醇

青光眼在全球致盲眼病中居第2位，嚴(yán)重威脅患者的視覺(jué)質(zhì)量［1］。小梁網(wǎng)細(xì)胞（trabecular meshwork cells，TMCs）細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的異常沉積可使房水流出阻力增加，引起眼壓升高，這是開角型青光眼（open angle glaucoma，OAG）的主要發(fā)病機(jī)制之一［2］。氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β2等可引起TMCs的ECM異常沉積［3-5］。其中，氧化應(yīng)激還可通過(guò)激活核因子（nuclear factor，NF）-κB，使多種炎性因子表達(dá)升高［6］。研究表明，OAG患者小梁網(wǎng)組織中炎性因子白細(xì)胞介素（IL）-1β表達(dá)升高［7］。因此，青光眼的發(fā)生發(fā)展也可能與炎癥的發(fā)生有關(guān)。白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是非黃酮類多酚化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力［8］。研究表明，RSV可抑制TMCs中活性氧的生成［9］及多種炎性因子的表達(dá)［10］，但RSV能否抑制TMCs的ECM異常增多尚少見相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察RSV對(duì)H2O2及TGF-β2刺激下TMCs的ECM、NF-κB P65 及IL-1β的影響，探討RSV對(duì)青光眼的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人小梁網(wǎng)細(xì)胞株（human trabecular meshwork cells，HTMCs）購(gòu)自美國(guó)ScienCell實(shí)驗(yàn)室；過(guò)氧化氫（H2O2）購(gòu)自中國(guó)aladdin公司；TGF-β2購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；RSV購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）抗體、膠原纖維1型（Collagen 1，COL1）抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，NF-κB P65磷酸化（P-NF-κB P65）抗體、NF-κB P65抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司，β-actin抗體購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司；Western blot用羊抗鼠二抗及羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)KPL公司，免疫熒光用羅丹明標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；DAPI購(gòu)自北京索萊寶公司，Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PVDF轉(zhuǎn)印膜購(gòu)自瑞士Roche公司，Bradford蛋白定量試劑購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HTMCs培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、20 mmol/L L-谷氨酰胺、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 μmol/L非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，待匯合度達(dá)70%～80%后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 不同濃度H2O2對(duì)HTMCs的處理 選取匯合度70%～80%的HTMCs，在無(wú)血清培養(yǎng)基中分別加入濃度為150、300、450、800 μmol/L的H2O2處理2 h，另設(shè)不加H2O2處理HTMCs培養(yǎng)2 h為對(duì)照組。

1.3.1 Western blot法檢測(cè)FN蛋白、COL1蛋白、NF-κB P65蛋白、P-NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平 不同濃度H2O2處理HTMCs 2 h后，收集細(xì)胞，用含蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA裂解液（25 mmol/L Tris-HCl pH=7.6，5 mol/L NaCl，1%TritonX-100，1% Na-deoxycholate，0.1%SDS，1 mmol/L EDTA）裂解HTMCs，冰上操作提取蛋白。用Bradford試劑進(jìn)行蛋白定量后，取20～40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。分離膠總丙烯酰胺百分濃度選為8%（W∶V）。電泳結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)（4℃，300 mA，2 h）將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜（FN抗體1∶8 000，COL1抗體1∶5 000，NF-κB P65抗體1∶3 000，P-NF-κB P65抗體1∶1 000，β-actin抗體1∶2 000）。次日，經(jīng)TBST漂洗3次后，室溫孵育二抗1 h（羊抗兔、羊抗鼠抗體1∶1 000）。TBST漂洗3次后，在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光試劑，放入凝膠成像儀自動(dòng)成像系統(tǒng)曝光。以β-actin為內(nèi)參，Western blot法檢測(cè)FN蛋白、COL1蛋白、NF-κB P65蛋白、P-NF-κB P65蛋白的表達(dá)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)IL-1β基因的表達(dá) 不同濃度H2O2處理HTMCs 2 h后，收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取吸光度比值（A260/280）在1.8～2.0之間的總RNA（1 μg）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。先使用DNase I去除可能的DNA污染后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板在7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。引物序列（5′→3′）GAPDH：上游GCACCGTCAAGGCTGAGAAC；下游TGGTGAAGACGCCAGTGGA；IL-1β：上游AACCTCTTCGAG GCACAAGG；下游GGCGAGCTCAGGTACTTCTG；GAPDH和IL-1β擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為138和107 bp。反應(yīng)體系：模板cDNA 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.1 μL，2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)足反應(yīng)體系至10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，60℃退火和延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。選取GAPDH作為內(nèi)參基因。2-ΔΔCt法比較相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=樣本ΔCt-對(duì)照ΔCt。各指標(biāo)重復(fù)3次取均值。

1.4 RSV對(duì)H2O2誘導(dǎo)的FN蛋白、COL1蛋白、NF-κB P65蛋白、P-NF-κB P65蛋白及IL-1β基因表達(dá)的影響 選取匯合度70%～80%的HTMCs，分為3組。對(duì)照組以不含H2O2及RSV的無(wú)血清培養(yǎng)基處理，H2O2組以300 μmol/L的H2O2處理，H2O2+RSV組同時(shí)加入300 μmol/L的H2O2及25 μmol/L 的RSV處理，以上各組均培養(yǎng)2 h。Western blot法檢測(cè)各組FN蛋白、COL1蛋白、NF-κB P65蛋白、P-NF-κB P65蛋白的表達(dá)，方法同1.3.1。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β基因的表達(dá)，方法同1.3.2。

1.5 免疫熒光檢測(cè)RSV對(duì)H2O2誘導(dǎo)的NF-κB P65核移位的影響 分組同1.4。4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min后，用含0.5%Triton X-100的PBS溶液透化處理5 min，PBS洗3次后，用5 g/L BSA室溫封閉1 h。4℃過(guò)夜孵育一抗（NF-κB P65-抗體1∶400），PBST洗2次后，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBST洗2次后，1 mg/L DAPI室溫孵育5 min，PBS洗3次后，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 RSV對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)的FN蛋白、COL1蛋白、NF-κB P65蛋白、P-NF-κB P65蛋白及IL-1β基因表達(dá)的影響 選取匯合度70%～80%的HTMCs，分為3組。對(duì)照組以不含TGF-β2及RSV的無(wú)血清培養(yǎng)基處理，TGF-β2組以5 μg/L的TGF-β2處理HTMCs，TGF-β2+RSV組為同時(shí)加入5 μg/L的TGF-β2及25 μmol/L的RSV處理，以上各組均培養(yǎng)12 h。Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞FN蛋白、COL1蛋白、NF-κB P65蛋白、P-NF-κB P65蛋白的表達(dá)，方法同1.3.1。實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞IL-1β基因的表達(dá)，方法同1.3.2。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多樣本組間兩兩比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊采用LSD-t法，方差不齊采用Dunnett T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Comparison of related protein and gene expressions between H2O2-treated groups表1H2O2不同濃度組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.1 Comparison of related protein and gene expressions between H2O2-treated groups表1H2O2不同濃度組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與150 μmol/L組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組150 μmol/L組300 μmol/L組450 μmol/L組800 μmol/L組F n 3 3 3 3 3蛋白表達(dá)FN 1.140±0.122 2.621±0.067a2.312±0.198ab2.187±0.157ab1.782±0.143ab47.198＊＊COL1 1.053±0.161 1.709±0.402 2.521±0.511a2.250±0.708a2.480±0.592a4.459＊P-NF-κB P65 0.988±0.018 1.155±0.046a1.813±0.115ab2.067±0.026ab1.815±0.059ab165.067＊＊NF-κB P65 0.939±0.053 0.985±0.075 1.049±0.087 1.056±0.072 0.934±0.025 2.339基因表達(dá)IL-1β 1.052±0.072 1.703±0.737 2.192±0.520a3.982±0.162a9.939±1.752a66.712＊＊

2 結(jié)果

2.1 H2O2不同濃度組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，150、300、450、800 μmol/L組FN 和P-NF-κB P65蛋白表達(dá)水平均增高，300、450、800 μmol/L組COL1蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平增高（P＜0.05），其他指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與150 μmol/L組比較，300、450、800 μmol/L組PNF-κB P65蛋白表達(dá)水平增高，F(xiàn)N蛋白表達(dá)水平下降，但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。不同濃度組NF-κB P65蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖1。

2.2 RSV干預(yù)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HTMCs中相關(guān)指標(biāo)的影響 各組NF-κB P65蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H2O2組較對(duì)照組FN蛋白、COL1蛋白、PNF-κB P65蛋白及IL-1β基因表達(dá)水平均增高，而H2O2+RSV組較H2O2組上述指標(biāo)均降低（P＜0.05）。H2O2+RSV組較對(duì)照組僅IL-1β降低（P＜0.05），其他指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2、表2。

2.3 RSV干預(yù)對(duì)TGF-β2誘導(dǎo)的HTMCs中相關(guān)指標(biāo)的影響 各組NF-κB P65蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TGF-β2組較對(duì)照組FN蛋白、COL1蛋白、P-NF-κB P65蛋白和IL-1β基因水平表達(dá)均增高（P＜0.05），TGF-β2+RSV組較TGF-β2組上述指標(biāo)均降低（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.1 Comparison of related protein expressions between H2O2-treated groups圖1 H2O2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

Fig.2 Comparison of H2O2-induced related protein expressions under RSV treatment圖2 RSV對(duì)H2O2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

Fig.3 Comparison of TGF-β2-induced related protein expressions under RSV treatment圖3 RSV對(duì)TGF-β2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

Tab.2 Comparison of H2O2-induced related protein and gene expressions under RSV treatment表2 RSV對(duì)H2O2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.2 Comparison of H2O2-induced related protein and gene expressions under RSV treatment表2 RSV對(duì)H2O2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與H2O組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組H2O2組H2O2+RSV組F n 3 3 3蛋白表達(dá)FN 1.254±0.313 2.238±0.229a1.540±0.157b13.126＊＊COL1 1.093±0.104 1.826±0.027a0.997±0.046b136.362＊＊P-NF-κB P65 1.163±0.147 1.738±0.035a1.218±0.074b32.282＊＊NF-κB P65 1.049±0.050 1.101±0.107 0.890±0.082 2.339基因表達(dá)IL-1β 1.020±0.447 1.832±0.203a0.345±0.093ab159.856＊＊

2.4 RSV干預(yù)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的NF-κB p65蛋白核移位的影響 對(duì)照組NF-κB P65只在細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)；H2O2組細(xì)胞的胞質(zhì)及核中均有NF-κB P65表達(dá)，且部分細(xì)胞中細(xì)胞核表達(dá)NF-κB P65較細(xì)胞質(zhì)中多；H2O2+RSV組的大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)NF-κB P65較細(xì)胞核中多，見圖4。

3 討論

Tab.3 Comparison of TGF-β2-induced related protein and gene expressions under RSV treatment表3 RSV對(duì)TGF-β2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 （±s）

Tab.3 Comparison of TGF-β2-induced related protein and gene expressions under RSV treatment表3 RSV對(duì)TGF-β2干預(yù)下各組相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平比較 （±s）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與TGF-β2組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組TGF-β2組TGF-β2+RSV組F n 3 3 3蛋白表達(dá)FN 0.985±0.054 1.438±0.069a0.850±0.059b75.449＊＊COL1 0.918±0.076 1.561±0.065a1.231±0.102b47.124＊＊P-NF-κB P65 0.932±0.075 1.551±0.038a0.975±0.072b88.084＊＊NF-κB P65 1.179±0.156 1.133±0.082 1.093±0.044 0.507基因表達(dá)IL-1β 1.029±0.078 3.082±0.692a0.995±0.684b13.495＊＊

研究顯示，青光眼眼壓升高與TMCs的ECM異常沉積有關(guān)［2］。氧化應(yīng)激是造成ECM異常積聚的重要機(jī)制之一［3］。Shen等［11］用300 μmol/L的H2O2處理HTMCs 2 h構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，發(fā)現(xiàn)ECM成分FN、COL1等表達(dá)水平升高。Li等［6］用200 μmol/L的H2O2處理豬TMCs造成慢性氧化應(yīng)激后，發(fā)現(xiàn)NF-κB活性及炎性因子IL-1表達(dá)均升高。因此，氧化應(yīng)激損傷不僅上調(diào)ECM相關(guān)蛋白表達(dá)，而且可以激活NF-κB信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)的參與。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，150、300、450、800 μmol/L組FN和P-NF-κB P65蛋白表達(dá)水平均增高，300、450、800 μmol/L組COL1蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平增高，表明300 μmol/L H2O2處理HTMCs即可建立氧化應(yīng)激損傷模型，從而激活NF-κB，上調(diào)炎性因子表達(dá)，造成ECM成分異常積聚。Yun等［12］用1 μmol/L的H2O2處理間充質(zhì)干細(xì)胞，分別在處理15、30、60、90 min時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NF-κB蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，但其磷酸化水平均升高；在處理12 h 時(shí) FN表達(dá)下降，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-12表達(dá)升高，表明H2O2可通過(guò)激活NF-κB來(lái)上調(diào)MMP相關(guān)蛋白的表達(dá)，使FN蛋白降解。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，150、300、450、800 μmol/L組NF-κB P65蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，與150 μmol/L組比較，300、450、800 μmol/L組P-NF-κB P65蛋白表達(dá)水平增高，F(xiàn)N蛋白表達(dá)水平下降，與上述研究結(jié)果相近。因此，結(jié)合相關(guān)研究，筆者認(rèn)為，F(xiàn)N蛋白在低濃度的H2O2處理下升高明顯，在高濃度的H2O2處理下表達(dá)下降，可能與相關(guān)MMP蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而導(dǎo)致FN蛋白發(fā)生降解有關(guān)。

RSV為多酚化合物，具有抗炎、抗氧化等多種生物活性［8］。研究表明，RSV可有效抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下活性氧的增多及炎性因子的表達(dá)［9-10］。另外，RSV可通過(guò)上調(diào)去乙?；福╯irtuin type 1，SIRT1）表達(dá)活性，從而延緩TMCs衰老［13］。以上研究均表明RSV對(duì)TMCs的氧化應(yīng)激損傷具有一定保護(hù)作用，然而有關(guān)RSV對(duì)TMCs的ECM成分的影響如何均未明確。本研究結(jié)果顯示，與H2O2組相比，H2O2+RSV組FN、COL1、P-NF-κB P65的蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平均降低，NF-κB P65核移位現(xiàn)象也被有效抑制，提示RSV可有效抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活以及ECM相關(guān)蛋白的上調(diào)，從而發(fā)揮對(duì)TMCs的保護(hù)作用。但是，本研究還發(fā)現(xiàn)，H2O2+RSV組FN、COL1、P-NF-κB P65蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異，因此，RSV在一定程度上可體現(xiàn)出對(duì)HTMCs的保護(hù)作用，但仍需結(jié)合其他手段對(duì)青光眼進(jìn)行綜合治療。

TGF-β2是存在于人眼房水中的多功能多肽，其在原發(fā)性O(shè)AG患者房水中的濃度明顯高于正常人［14］。研究表明，TGF-β2可誘導(dǎo)TMCs的ECM成分表達(dá)增加［15-16］。TGF-β可通過(guò)激活NF-κB P65的核移位來(lái)促進(jìn)FN的表達(dá)，從而影響肺纖維化過(guò)程［17］。NF-κB P65作為轉(zhuǎn)錄因子還可以調(diào)控FN的轉(zhuǎn)錄水平，從而參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程［18］。ECM成分FN、COL1異常沉積加快了心肌的纖維化，NF-κB抑制劑PDTC可通過(guò)抑制NF-κB活性，從而阻止FN、COL1的異常積聚［19］。因此，TGF-β2與NF-κB均能調(diào)控FN、COL1的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β2組FN、COL1、P-NF-κB P65蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平均增高，提示在HTMCs中，TGF-β2誘導(dǎo)FN、COL1表達(dá)增加可能與NF-κB的激活密切相關(guān)。有關(guān)腎纖維化的相關(guān)研究表明，RSV可通過(guò)上調(diào)SIRT1來(lái)抑制TGF-β信號(hào)通路，降低COL1、FN的表達(dá)［20-21］。本研究結(jié)果顯示，與TGF-β2組相比，TGF-β2+RSV組FN、COL1、P-NF-κB P65蛋白和IL-1β基因表達(dá)水平均降低，證實(shí)了RSV能有效抑制TGF-β2誘導(dǎo)的FN、COL1表達(dá)增加及NF-κB的激活。然而，TGF-β2+RSV組NF-κB P65與TGF-β2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明RSV并不能完全抑制ECM的異常積聚。

綜上所述，青光眼的發(fā)生、發(fā)展與氧化應(yīng)激損傷、TGF-β2及NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。RSV可通過(guò)抑制NF-κB的激活、降低HTMCs炎性因子及ECM蛋白的表達(dá)，從而對(duì)青光眼TMCs的應(yīng)激損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。RSV有望成為治療青光眼的一種潛在藥物。

（圖4見插頁(yè)）

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（2016-03-11收稿 2016-04-29修回）

（本文編輯 陸榮展）

The role and mechanism of resveratrol on trabecular meshwork cells induced by H2O2and TGF-β2

QI Yan1，2，ZHAO Xiujuan2，XU Linqi1，2，WU Xudong2△，WANG Jiantao1△
1 Tianjin Medical University Eye Hospital，School of Optometry and Ophthalmology，Eye Institute，Tianjin 300384，China；2 Deparment of Cell Biology，College of Basic Medicine，Tianjin Medical University△

Objective To investigate hydrogen peroxide（H2O2）and transforming growth factor-β2（TGF-β2）induced fibronectin（FN），collagen 1（COL1），nuclear factor（NF）-κB P65 proteins and interlukin（IL）-1β gene expression in human trabecular meshwork cells（HTMCs），and the interventional mechanism of resveratrol（RSV）.Methods （1）HTMCs with 70 to 80%confluency were divided into 5 groups.The experimental groups were treated with serum-free medium and with H2O2at concentrations of 150，300，450 and 800 μmol/L.The control group was treated with 0 μmol/L H2O2.The protein levels of FN，COL1，NF-κB P65 and NF-κB P65 phosphorylation（P-NF-κB P65）were measured by Western blot assay.The expression of IL-1β gene was measured by qPCR.（2）HTMCs were divided into 3 groups.The control group was treated withserum-free medium and without H2O2and RSV.The H2O2group was treated with 300 μmol/L H2O2.The H2O2+RSV group was treated with 300 μmol/L H2O2and 25 μmol/L resveratrol（RSV）.The expressions of proteins and genes mentioned above were detected in three groups.NF-κB P65 nuclear translocation was assessed by immunofluorescence technique.（3）HTMCs were divided into 3 groups.The control group was treated with serum-free medium and without TGF-β2and RSV.The TGF-β2group was treated with 5 μg/L TGF-β2.The TGF-β2+RSV group was treated with 5 μg/L TGF-β2and 25 μmol/L RSV. The expressions of proteins and genes mentioned above were detected in three groups.Results （1）Compared with control group，the protein levels of FN and P-NF-κB P65 were significantly increased in 150，300，450 and 800 μmol/L groups，the expression levels of COL1 protein and IL-1β gene were significantly increased in 300，450 and 800 μmol/L groups（P＜0.05）.There were no statistical significances between other indicators.（2）The expression levels of FN，COL1，P-NF-κB P65 proteins and IL-1β gene were significantly higher in H2O2group than those in control group，and which were significantly lower in H2O2+RSV group than those in H2O2group.Compared with control group，only the expression of IL-1β gene was decreased in H2O2+RSV group（P＜0.05）.NF-κB P65 was only expressed in cytoplasm in control group，while it was expressed in both cytoplasm and nucleus in H2O2group.Compared with H2O2group，NF-κB P65 was mainly expressed in cytoplasm.（3）Compared with control group，the expressions of FN，COL1，P-NF-κB P65 proteins and IL-1β gene were significantly increased in TGF-β2group（P＜0.05）.Compared with TGF-β2group，the indicators mentioned above were significantly decreased in TGF-β2+RSV group（P＜0.05）.Conclusion H2O2and TGF-β2can upregulate the expression of FN，COL1，P-NF-κB P65 proteins and IL-1β gene in HTMCs，which may be involved in the development and progression of glaucoma.RSV can inhibit the influence of H2O2and TGF-β2in HTMCs and exert a protective effect on glaucoma.

glaucoma；trabecular meshwork；hydrogen peroxide；transforming growth factor beta2；extracellular matrix；NF-kappa B；interleukin-1beta；protein fiber connection；collagen 1；Resveratrol

R775.2

A

10.11958/20160149

國(guó)家自然科學(xué)基金（81270994，31570774，81500170）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（10ZCKFSY08400）；天津市教育委員會(huì)基金（093-201301）

1天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院，天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所，天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院（郵編300384）；2天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系

齊艷（1990），女，碩士在讀，主要從事眼視光學(xué)、青光眼研究

△通訊作者 吳旭東E-mail：wuxudong@tijmu.edu.cn；汪建濤E-mail：wangjiantao65@126.com