HPLC/MS測定環(huán)孢素A單用及聯(lián)用氟康唑的血藥濃度

易林高，吳明釵，黃 鵬，陳曉孩，陸日鳴（.瑞安市人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 溫州 3500；.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院，浙江 溫州 35035）

HPLC/MS測定環(huán)孢素A單用及聯(lián)用氟康唑的血藥濃度

易林高1，吳明釵1，黃 鵬1，陳曉孩1，陸日鳴2
（1.瑞安市人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江 溫州 325200；2.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院，浙江 溫州 325035）

目的：建立質(zhì)譜法測定環(huán)孢素A（CsA）的血藥濃度，并用其測定CsA單/聯(lián)用氟康唑的血藥濃度。方法：采用液質(zhì)聯(lián)用法測定單/聯(lián)用氟康唑時CsA的血藥濃度，色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱，柱溫50 ℃，流動相為乙腈-0.1%甲酸，流速0.5 mL·min-1；質(zhì)譜條件：ESI（電噴霧離子源），正離子檢測，霧化氣壓力設(shè)為20 psi。結(jié)果：CsA在100 ～ 20 000 ng·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.999 6），日內(nèi)、日間RSD均低于5%，平均萃取回收率為90%；聯(lián)合使用氟康唑的CsA比單獨使用CsA在第5天血藥谷濃度平均高178.0%，峰濃度平均高161.3%。結(jié)論：本方法簡便、專屬、準確、靈敏度高，可用于CsA血藥濃度測定及藥動學(xué)的研究；正在聯(lián)合使用CsA和氟康唑的患者，氟康唑會明顯增高CsA的血藥濃度，應(yīng)減少CsA的用量，并密切監(jiān)測CsA的血藥濃度。

環(huán)孢素A；氟康唑；含量測定；血藥濃度

環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）因具有較強的免疫活性，已成為廣泛用于器官移植術(shù)后抗排異反應(yīng)的基礎(chǔ)免疫抑制劑［1］。器官移植是治療終末期器官衰竭的有效手段，CsA和激素是防止移植物丟失主要藥物，易導(dǎo)致移植患者的真菌感染，臨床上經(jīng)常治療性或預(yù)防性使用三唑類抗真菌藥；而此類藥物通常會抑制細胞色素P450酶，影響其它藥物的代謝，進而影響CsA的血藥濃度，為臨床正在使用CsA又同時感染真菌患者的治療帶來困難［2］。本文研究了唑類抗真菌藥氟康唑與CsA聯(lián)合應(yīng)用時，前者對后者血藥濃度（峰濃度及谷濃度）的影響，為臨床合理用藥提供理論參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

Bruker Esquire系列HCT離子阱質(zhì)譜儀，配有ESI離子源（德國Bruker公司）；1200型HPLC色譜儀包括MWD檢測器、四元泵、在線真空脫氣機、自動進樣器（美國Agilent公司）；AB104-S電子分析天平（梅特勒-托利多上海儀器公司）；XW-80旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；GT16-3高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）。CsA對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量98.9%，批號30405-201103）。甲醇、乙腈（德國Merck公司），水為超純水。

1.2實驗動物

8只雄性清潔級SD大鼠，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（浙）2010-0044。所有動物實驗的操作規(guī)程和協(xié)議都按照溫州醫(yī)學(xué)院動物保護和使用委員會頒布的《實驗動物使用和保護指導(dǎo)守則》進行。隨機將SD大鼠分為A、B兩組，每組4只，采用統(tǒng)一的飼料和水喂養(yǎng)，溫度控制在22 ℃。

1.3液質(zhì)分析條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（2.1 mm × 50 mm，5 μm），柱溫50 ℃。流動相：乙腈-0.1%甲酸，流速0.5 mL·min-1，梯度洗脫：0 min，10%乙腈；2 min，90%乙腈；7 min，90%乙腈；8 min，10%乙腈；11 min，運行完成。進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：ESI（電噴霧離子源），正離子檢測，霧化氣壓力設(shè)為20 psi；干燥氣（N2）流速為6 L·min-1，干燥氣溫度為350 ℃。選擇離子模式（SIM）方式定量，檢測離子為 m/z 1248（環(huán)孢素）。

1.4標準液配制

CsA對照品溶液：精密稱取CsA對照品適量，用甲醇溶解并稀釋制得0.5 mg·mL-1的對照品儲備液，置陰涼處保存。臨用時用流動相稀釋得各種濃度的CsA對照品溶液。

1.5血清樣本處理

取大鼠全血500 μL，加入3 mL乙醚渦旋1 min，8000 r·min-1離心10 min，取上清液2.5 mL，氮氣吹干，流動相100 μL復(fù)溶，20 μL進樣。

1.6藥動學(xué)實驗

8只大鼠統(tǒng)一進食，在實驗前一晚開始禁食，A組第1天CsA灌胃法給藥，每只大鼠于早上（7∶30）和晚上（19∶30）進食前2 h給予CsA 24 mg·kg-1·d-1，連服5 d。每只大鼠在每天早上給藥前及給藥后1 h取血0.5 mL測定CsA全血濃度（峰濃度及谷濃度）。B組于早上（7∶30）和晚上（19∶30）進食前2 h給予CsA 24 mg·kg-1·d-1和氟康唑24 mg·kg-1·d-1，其它同A組。給藥結(jié)束后，停藥14 d。A組和B組交換，A組4只大鼠灌胃法給予CsA和氟康唑，B組4只大鼠灌胃法給予CsA，其它同前。將血樣本儲存在- 40 ℃冷凍柜。以建立的HPLC/MS法測定各時間點CsA的血藥濃度。

2 結(jié)果

2.1專屬性實驗

CsA在ESI正離子全掃描方式下，主要生成［M+H］準分子離子峰，分別為m/z 1225和m/z 1248，其中m/z 1248稍高，故將其作為定量分析時的選擇性檢測離子。在上述試驗條件下，CsA的保留時間分別為5.1 min，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾。見圖1。

圖1　環(huán)孢素A的色譜圖A - 空白血清，B - 空白血清+ CsA；1 - 環(huán)孢素AFig 1 Chromatograms of CsAA - blank serum， B - blank serum + CsA；1 - CsA

2.2全血標準曲線制備

取空白全血450 μL，精密加入50 μL不同濃度的CsA對照品，使其濃度分別為100、200、500、1000、2000、5000、10 000、20 000 ng·mL-1，按“1.5”項下血樣方法處理，按“1.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰及峰面積。以CsA的峰面積（Y）對濃度（X）進行回歸，得回歸方程：Y = 3.606 6×103X + 1.306 4×104，最低檢測濃度為16.9 ng·mL-1。結(jié)果顯示CsA在100 ～20 000 ng·mL-1區(qū)域內(nèi)有良好的線性關(guān)系（n = 5，r = 0.999 6）。

2.3精密度和回收率考察

取空白全血450 μL，按“2.2”項下方法制備低、中、高濃度（500、2000和10 000 ng·mL-1）含CsA的血清樣品，每個濃度5份，考察回收率和精密度。每個濃度樣品1 d內(nèi)測定5次，計算回收率和日內(nèi)RSD，每個濃度連續(xù)測定5 d，計算日間RSD。上述3種濃度測定結(jié)果的RSD均在5%范圍內(nèi)，詳見表1。

表1　全血CsA的精密度和回收率. x　± s，n = 5Tab 1 Precision and recovery of CsA in whole blood. x　± s ，n = 5

2.4萃取回收率測定

精密量取低、中、高濃度的CsA標準溶液500 μL，將溶劑揮干，用100 μL流動相溶解，記錄樣品離子流峰面積AS。用全血配制同樣低、中、高3種不同濃度的樣品，按“1.5”項下進行血樣處理，按“1.3”項下色譜條件進樣，記錄樣品離子流峰的面積AE，按下式計算萃取回收率。E% = AE/AS×6/5×100%。詳見表2。

表2　全血CsA 的萃取回收率.x　± s，n = 5Tab 2 Extraction recovery of CsA in whole blood. x　± s ，n = 5

2.5應(yīng)用

測定CsA單用及聯(lián)用氟康唑后，從第1天到第5天CsA的血藥濃度，第5天CsA單用的谷濃度（1176±194）ng·mL-1，合用的谷濃度（2093±255）ng·mL-1，平均升高178.0%；第5天CsA單用的峰濃度（1937±195）ng·mL-1，合用的峰濃度（3124±257）ng·mL-1，平均升高161.3%。具體見表3。

表3　CsA單用及聯(lián)用氟康唑的峰谷濃度情況Tab 3 Peak trough concentration of CsA alone and in combination with fluconazole

3 討論

3.1梯度洗脫

減少血液中雜質(zhì)對CsA干擾，改善峰形，擬用不同濃度的甲醇或乙腈作為流動相，如80%甲醇、85%甲醇、70%乙腈、80%乙腈等，結(jié)果顯示雜質(zhì)對其有干擾或峰的形狀不理想，改用梯度洗脫后，峰形和分離情況明顯好轉(zhuǎn)，利用0 ～ 2 min 10%乙腈沖洗雜質(zhì)，然后改用90%的乙腈洗脫CsA，獲得較好的峰形，且也與雜質(zhì)能較好的分離。

3.2柱溫選擇

CsA分子量較大，洗脫難度較高，可提高柱溫以改善CsA峰形，有報道選擇柱溫為60 ℃、55 ℃等［3-4］，但柱溫高對一般色譜柱損傷較大，明顯減少其壽命，本實驗經(jīng)過梯度洗脫、萃取法去雜質(zhì)等改良措施后用50 ℃的柱溫也能達到較好效果。

3.3氟康唑?qū)sA的影響

CsA主要經(jīng)肝臟細胞色素P450酶系中的CYP3A4、CYP3A5代謝［1，5］，血藥濃度可受許多藥物的影響。因此，在使用CsA的同時，合用肝藥酶抑制劑或誘導(dǎo)劑都會改變CsA的體內(nèi)代謝過程，從而影響CsA的血藥濃度［6-7］。

三唑類抗真菌藥主要在肝臟內(nèi)經(jīng)CYP3A4代謝［8］，如氟康唑會抑制細胞色素P450氧化酶同工酶CYP3A4的活性，從而影響CsA在肝內(nèi)的代謝，使其血藥濃度升高，增強毒性。氟康唑?qū)φ婢蕾嚨募毎豍450酶具有高度特異性的抑制作用，同時對人體細胞色素P450酶也有抑制作用。而CsA主要依賴肝細胞及腸壁細胞的P450酶代謝，所以氟康唑可影響CsA的代謝而使其血藥濃度升高，因此對于腎移植患者在應(yīng)用氟康唑時應(yīng)注意調(diào)整CsA的劑量，以免因CsA血藥濃度過高導(dǎo)致患者的肝腎功能損害。

綜上，本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合使用氟康唑的CsA比單獨使用CsA血藥谷濃度在第5天平均高178.0%；峰濃度在第5天平均高161.3%。因此，正在使用CsA的患者，聯(lián)用氟康唑時會明顯提高CsA的血藥濃度，增強其毒性，應(yīng)減少CsA的用量，并監(jiān)測其血藥濃度。

本方法操作簡便、專屬性強、準確度及靈敏度高，可用于CsA血藥濃度測定及藥動學(xué)的研究。

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Determination of the blood concentration of cyclosporine A alone and in combination with fluconazole by HPLC/MS

YI Lin-gao1， WU Ming-chai1， HUANG Peng1， CHEN Xiao-hai1， LU Ri-ming2
（1. Department of Pharmacy， Ruian People's Hospital， Wenzhou 325200， China； 2. Renji College of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China）

Objective: To establish a mass spectrometry method for determination of blood concentration of cyclosporine A （CsA）， and determine the blood concentration of cyclosporine A alone and in combination with fluconazole. Methods: The blood concentration of cyclosporine A in rats was detected and compared when cyclosporine alone and combined with fluconazole by using liquid chromatography-mass spectrometry. Chromatographic column Agilent Zorbax SB-C18was used. Column temperature was 50 ℃. Mobile phase was acetonitrile-0.1% formic acid. Flow rate was 0.5 mL·min-1. Mass spectrometry condition was as follows: ESI （electrospray ion source） was used， positive ion detection was used， atomizing gas pressure was set to 20 psi. Results: The linear relationship of CsA was good in the range of 100 - 20 000 ng·mL-1（r = 0.999 6）. Intra-day RSD and inter-day RSD were less than 5%. The average extraction recovery was 90%. The average blood trough concentration of CsA when CsA combined with fluconazole was higher （by 178.0%） than just cyclosporine alone in five days， and the peak concentration in combined utilization was higher （by 161.3%） than that of alone use. Conclusion: The method is simple， specific， accurate and high sensitivity，which can also be used for the determination of CsA blood concentration and pharmacokinetics study. Patients who are using CsA and fluconazole will obviously have high blood concentrations of CsA， should reduce the dosage of CsA， and monitor the blood concentration.

Cyclosporine A； Fluconazole； Content determination； Blood drug concentration

R917

A

1672 - 8157（2016）04 - 0211 - 03

浙江省藥學(xué)會醫(yī)院藥學(xué)專項科研資助項目（2013ZYY14）

易林高，男，副主任藥師，主要從事臨床藥學(xué)工作。E-mail：626794417@qq.com

2016-02-27

2016-05-20）