中藥筋脈通對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)影響的研究

楊　丹　梁曉春　屈　嶺　吳群勵　吳亞楠　石　玥　戴　威

中藥筋脈通對糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)影響的研究

楊丹梁曉春屈嶺吳群勵吳亞楠石玥戴威

目的 觀察中藥筋脈通對鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）大鼠背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）感覺神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 雄性SD大鼠18只，腹腔內(nèi)注射STZ誘導建立糖尿病大鼠模型，隨機分為糖尿病組、筋脈通組與?；撬峤M，每組6只大鼠，并設正常對照組6只。成模后每天1次灌胃給藥，持續(xù)16周。藥物干預16周后，用電子Von Frey儀檢測機械痛閾值，取大鼠背根神經(jīng)節(jié)，按常規(guī)方法制成切片后，在電鏡下觀察背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的病理學改變。結(jié)果 糖尿病大鼠的機械痛閾值較正常組顯著明顯下降（P<0.01），背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重度損傷，神經(jīng)元細胞中線粒體數(shù)量顯著減少（P<0.01），并且線粒體腫脹及空泡化比率、凋亡率顯著升高（P<0.01）；中藥筋脈通可顯著提高機械痛閾值（P<0.01），減輕神經(jīng)元的損傷，提高神經(jīng)元中線粒體的數(shù)量（P<0.05），并且降低線粒體的腫脹及空泡化比率及凋亡率（P<0.01），且中藥筋脈通的療效優(yōu)于牛磺酸（P<0.01）。結(jié)論 中藥筋脈通對抑制糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元及其線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷而對糖尿病所致周圍神經(jīng)病變起到一定的保護作用。

糖尿病周圍神經(jīng)病變； 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元； 筋脈通； 超微結(jié)構(gòu)； 線粒體

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一［1］，隨著病程的進展，可有30% ～90%的糖尿病患者存在周圍神經(jīng)病變。DPN早期主要表現(xiàn)為感覺功能障礙，臨床表現(xiàn)為四肢末端對稱性的神經(jīng)性疼痛和/或感覺異常，晚期可出現(xiàn)下肢的潰瘍，糖尿病足，甚至導致截肢。臨床研究證實中藥筋脈通可改善糖尿病患者的臨床癥狀［2］。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）神經(jīng)元是初級感覺神經(jīng)元，負責將外界疼痛刺激轉(zhuǎn)換為內(nèi)在神經(jīng)沖動并將其傳導至脊髓。本研究應用鏈脲佐菌素（streptozotgcin，STZ）誘導大鼠1型糖尿病周圍神經(jīng)損傷模型，觀察周圍神經(jīng)損傷后糖尿病大鼠機械疼痛閾值和背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元及神經(jīng)元中線粒體超微結(jié)構(gòu)的病理學改變，并從對感覺神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響方面，探討中藥筋脈通對糖尿病周圍神經(jīng)病變的保護作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物清潔級 雄性SD大鼠，體質(zhì)量270～310 g， 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2009-0017。

1.1.2主要藥物和試劑 筋脈通膠囊（由菟絲子、女貞子、桂枝、水蛭、延胡索、細辛、荔枝核等7味藥物組成），中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院院內(nèi)制劑，由北京九龍制藥廠加工生產(chǎn)，每粒含生藥0.35 g，生產(chǎn)批號：061019；?；撬幔ㄅ；撬峤M rine）（Sigma-Aldrich，美國）；精蛋白鮮胰島素注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，中國），原位末端標記法［terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL］凋亡試劑盒（Roche，美國）。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型 建立及分組給藥適應性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常對照組和造模組。造模前禁食不禁水12小時，造模組大鼠按60 mg/kg的劑量，一次性左下腹腔內(nèi)注射0.45%的STZ溶液。正常對照組按60 mg/kg的劑量，一次性左下腹腔內(nèi)注射0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液。72小時后用血糖儀測尾尖靜脈血血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L者為造模成功，作為糖尿?。ㄌ悄虿。┐笫蟆８鶕?jù)隨機數(shù)字表法將造模成功的18只糖尿病大鼠隨機分為3組：模型對照組、筋脈通組及牛磺酸組，每組各6只。腹腔內(nèi)注射枸櫞酸鹽緩沖液的大鼠，72小時后測尾尖靜脈血血糖，血糖<7.0 mmol/L的大鼠，作為正常對照組，共6只，體質(zhì)量與鼠齡均相匹配，且均為雄性。糖尿病大鼠每天皮下注射精蛋白鋅胰島素注射液1～3 IU，維持血糖在30 mmol/L以下，防止因血糖過高無法存活至實驗終點。成模后即開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)16周，筋脈通及牛磺酸組均按成人劑量15倍給藥，即筋脈通組給藥量1.31 g/（kg·d）（給藥劑量為生藥量），?；撬峤M給藥量1.20 g/（kg·d）。糖尿病組和正常對照組灌服蒸餾水10 mL/（kg·d）。

1.2.2檢測血糖 分別于藥物干預前、干預后4周、8周、12周及16周取尾尖靜脈血，用血糖儀測定血糖。

1.2.3檢測機械痛閾值 應用電子Von Frey儀在藥物干預16周后、處死大鼠前進行測定。將大鼠置于升高的金屬網(wǎng)上，蓋以透明的有機玻璃罩。大鼠適應環(huán)境15分鐘，待大鼠的梳理和探究活動基本消失后，用探頭纖維垂直剌激大鼠后肢足底中部，使探頭纖維稍成S形，觀察是否出現(xiàn)縮足反應。大鼠在刺激后出現(xiàn)快速的縮足反應，記為陽性反應，并記錄電子屏幕上的受力數(shù)值（g）。身體活動所引起的縮足反應則不記作陽性反應。第一次測量后，待大鼠適應環(huán)境3～5分鐘，再次測量。每只大鼠每側(cè)足底測量3次，并記錄。取平均值作為大鼠的機械痛閾值。

1.2.4 電鏡標本的制備 各組大鼠均于灌胃16周后處死，用12%的烏拉坦以1 mL/100 g體質(zhì)量進行腹腔注射麻醉后，暴露坐骨神經(jīng)，用玻璃分針鈍性分離，將神經(jīng)完整拉出，切取膨大的背根神經(jīng)節(jié)組織，分別用2.5%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定2小時；乙醇梯度脫水、純丙酮脫水；按照丙酮與環(huán)氧樹脂 Epon812包埋劑浸透，再用純環(huán)氧樹脂Epon812浸透2～3小時；環(huán)氧樹脂Epon812包埋、聚合、固化處理形成包埋塊；制成超薄切片，用200目銅網(wǎng)撈片，電子雙重染色；JEM1010透射電子顯微鏡觀察背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)并拍照。在30，000倍電鏡下每組選取5個DRG神經(jīng)元計數(shù)其中的線粒體個數(shù)及其變性線粒體個數(shù)，計算線粒體變性率。

1.2.5熒光標記原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法檢測背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡 將背根神經(jīng)節(jié)組織梯度脫水后制備成蠟塊，經(jīng)切片、脫蠟后，按照TUNEL試劑盒所示的操作步驟進行操作，切片經(jīng)脫水、透明、封片、鏡檢，激光共聚焦顯微鏡下觀察并用Leica正常對照focal圖像分析軟件照相。每組任意選擇5個視野，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡比率。

1.3統(tǒng)計學分析

應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠血糖值比較

藥物干預前后各組大鼠血糖情況如表1所示：藥物干預前造模各組大鼠即糖尿病組、筋脈通組及?；撬峤M血糖與正常組相比顯著升高（P<0.01），藥物干預前糖尿病組、筋脈通組及?；撬峤M各組之間的血糖無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

藥物干預16周后糖尿病組、筋脈通組及牛磺酸組的大鼠血糖與正常組相比均顯著升高（P<0.01），糖尿病組、筋脈通組及?；撬峤M各組之間的大鼠血糖在藥物干預16周后無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。正常組、糖尿病組、筋脈通組及?；撬峤M各組大鼠的血糖在藥物干預16周后與干預前比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1　藥物干預前、后各組大鼠血糖的比較（x±s，mmol/L）

2.2各組大鼠的機械痛閾值比較

糖尿病模型組大鼠的機械痛閾值較正常組出現(xiàn)顯著下降（P<0.01）。各治療組的機械痛閾值較糖尿病組有不同程度的回升：筋脈通組及?；撬峤M兩治療組的左側(cè)機械痛閾值較糖尿病組升高（P<0.05），且兩治療組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；筋脈通組及?；撬峤M兩治療組的右側(cè)機械痛閾值較糖尿病組顯著提高（P<0.01），且組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2　各組大鼠機械痛閾測量表（x±s，g）

2.3大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)損傷的抑制作用比較

正常對照組：DRG細胞神經(jīng)髓鞘均勻一致，呈同心圓形排列，胞漿均勻。細胞核大，核膜規(guī)整，常染色質(zhì)豐富且分布均勻，核仁清晰居中。胞質(zhì)內(nèi)富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體，溶酶體少或無，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大小、形態(tài)均正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔清晰細長，表面核糖體密集。線粒體含量豐富且結(jié)構(gòu)正常，線粒體內(nèi)外膜、線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整清晰，分布均勻。

糖尿病組：DRG細胞神經(jīng)髓鞘排列紊亂疏松，出現(xiàn)板層分離現(xiàn)象，皺縮和裂隙，DRG細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)重度損傷。病理學異常表現(xiàn)如下：背根神經(jīng)節(jié)細胞水腫，細胞核明顯變小，核膜明顯皺褶，部分模糊，核仁偏向一側(cè)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴張，線粒體腫脹變性，線粒體外膜破壞，線粒體嵴斷裂、稀疏、甚至消失，大部分呈空泡樣變、甚至溶解，溶酶體明顯增多。

筋脈通組及?；撬峤M：筋脈通及?；撬醿芍委熃MDRG細胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕度損傷，背根神經(jīng)節(jié)細胞呈現(xiàn)輕度水腫，部分神經(jīng)節(jié)細胞可見細胞核膜破壞，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)略增大，線粒體數(shù)目減少且輕度腫脹，細胞結(jié)構(gòu)改變較糖尿病組輕，損傷程度介于正常組與糖尿病組之間。見圖1。

圖1　大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)損傷的抑制作用比較（×30，000）

2.4各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)下線粒體數(shù)量比較

對相同倍數(shù)視野下每個DRG神經(jīng)元中線粒體進行計數(shù)。如表3所示，各組單個DRG神經(jīng)元中線粒體的平均數(shù)目。正常對照組單個DRG神經(jīng)元中含有線粒體的數(shù)目為（225±21）個。糖尿病組單個DRG神經(jīng)元中含有線粒體的數(shù)目為（136±19）個，較正常對照組顯著下降（P<0.01）。筋脈通組DRG神經(jīng)元中含有線粒體的數(shù)目為（182±23）個，較糖尿病組顯著升高（P=0.012）。?；撬峤MDRG神經(jīng)元中含有線粒體的數(shù)目為（170±20）個，較糖尿病組顯著升高（P=0.041）。筋脈通組與?；撬峤M兩組中線粒體數(shù)目比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表3　超微結(jié)構(gòu)下各組大鼠單個DRG 神經(jīng)元線粒體數(shù)量及變性率比較（x±s）

2.5各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)下線粒體變性率比較

如表3所示，正常對照組DRG神經(jīng)元中線粒體腫脹且線粒體棘消失、空泡化的線粒體出現(xiàn)率為（18.70±2.21）%，糖尿病組DRG神經(jīng)元中線粒體腫脹且線粒體棘消失、空泡化的線粒體出現(xiàn)率為（66.68±4.27）%，糖尿病組變性線粒體的比率較正常對照組顯著增加（P<0.01）。

筋脈通組DRG神經(jīng)元中線粒體腫脹且線粒體棘消失、空泡化的線粒體出現(xiàn)率為（39.89±2.57）%，牛磺酸組DRG神經(jīng)元中腫脹及空泡化的線粒體出現(xiàn)率為（51.89±5.96）%，兩治療組DRG神經(jīng)元中線粒體的變性率均較糖尿病組顯著下降（P<0.01），并且筋脈通組變性線粒體出現(xiàn)率顯著低于?；撬峤M（P<0.01）。

2.6各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞調(diào)亡比較

每組隨機選取5個視野，TUNEL熒光檢測結(jié)果顯示：正常對照組DRG細胞凋亡較少；糖尿病組DRG凋亡明顯增加，各治療組介于兩者之間。計算細胞的凋亡率并分析如下，見表4：與正常對照組相比，糖尿病組的細胞調(diào)亡率顯著升高（P<0.01），筋脈通與?；撬峤M兩治療組與正常對照組相比，細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異（P<0.01）；與糖尿病組相比，筋脈通與?；撬峤M兩治療組的細胞調(diào)亡率均降低，其中筋脈通組降低顯著（P<0.01），?；撬峤M較糖尿病組細胞調(diào)亡率降低具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；兩治療組間細胞調(diào)亡率比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表4　各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞凋亡率比較（x±s）

3　討論

DPN的發(fā)病機制十分復雜，持續(xù)的高糖狀態(tài)所致復雜的下游代謝途徑參與到疾病的發(fā)病過程中，包括多元醇通路活性的增加、非酶糖基化終產(chǎn)物的形成、氧化應激作用的增強、神經(jīng)營養(yǎng)支持功能的受損以及蛋白激酶C的活化和/或絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活性［3-5］。而高糖所致線粒體途徑活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成與以上這些機制均有關(guān)聯(lián)，表明線粒體功能障礙及其在氧化應激中所起的觸發(fā)作用，可見線粒體在DPN病因?qū)W中發(fā)揮了重要的媒介作用及在糖尿病神經(jīng)病變的神經(jīng)元中扮演著調(diào)節(jié)者的角色［6-8］。

DRG是外周感覺神經(jīng)傳入中樞神經(jīng)的第一站，其結(jié)構(gòu)和功能對于神經(jīng)傳導的影響尤為重要。糖尿病神經(jīng)病變是以周圍神經(jīng)DRG神經(jīng)元的退行性改變?yōu)樘卣鞯?，線粒體是細胞內(nèi)對缺氧最敏感的細胞器，因此DRG中線粒體尤其會受到影響。在神經(jīng)細胞中，線粒體的地位尤其重要。線粒體為神經(jīng)元的各項活動提供能量，并且?guī)缀跏悄芰康奈ㄒ惶峁┱?。線粒體并被認為是糖尿病中與神經(jīng)元相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)鍵調(diào)控者［7］。由于DRG中的線粒體是高糖環(huán)境下神經(jīng)元產(chǎn)生ROS的主要來源，因此它們更易受到損傷。過量ROS的生成可促進氧化應激反應，通過DNA、蛋白的修飾作用或通過誘導的線粒體凋亡通路，促使線粒體功能障礙和線粒體退行性改變［9-11］?？梢姡悄虿r高糖可通過 ROS的生成、線粒體損傷和凋亡促使神經(jīng)的損傷和死亡［12］。大量證據(jù)表明，糖尿病神經(jīng)病變發(fā)生時，神經(jīng)元中的線粒體受到損害［13］。

如何保護高糖狀態(tài)下神經(jīng)元及其線粒體結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮其生理功能的研究，已成為DPN治療的策略之一。前期實驗結(jié)果表明［2］，筋脈通能夠顯著減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變患者臨床癥狀，改善病變神經(jīng)傳導速度。本實驗將暴露于高糖環(huán)境下的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元及其線粒體作為糖尿病周圍神經(jīng)病變的模型進行研究，對損傷神經(jīng)相應感覺神經(jīng)元及其線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化進行了觀察。實驗結(jié)果證實糖尿病可導致大鼠縮足閾值下降，出現(xiàn)痛覺過敏。而筋脈通可提高大鼠的機械痛閾值，改善DPN所導致的痛覺過敏。

對大鼠DRG的超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可導致背根神經(jīng)節(jié)細胞的壞死及其DRG感覺神經(jīng)元的退行性改變的病理學變化，高糖可顯著減少DRG內(nèi)線粒體數(shù)量，增加背根節(jié)內(nèi)DRG神經(jīng)元內(nèi)腫脹和空泡化線粒體的出現(xiàn)率。筋脈通可使DPN大鼠DRG內(nèi)線粒體數(shù)量增加，感覺神經(jīng)元線粒體的腫脹及空泡化變性程度減輕，進一步從筋脈通對DRG及其線粒體的超微結(jié)構(gòu)影響的角度，探討了其可能的作用機制，中藥筋脈通可能通過抑制糖尿病所致感覺神經(jīng)元中線粒體的退行性病變，從而保護背根神經(jīng)發(fā)揮其正常的生物學功能，維持神經(jīng)正常的感覺、傳導功能，同時通過抑制糖尿病大鼠DRG細胞內(nèi)源性途徑即線粒體途徑的細胞的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，糖尿病可導致背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元及其線粒體壞損傷并降低糖尿病大鼠的機械痛閾值，筋脈通可改善上述病理學改變并提高其機械痛閾值。本研究提供了中藥筋脈通治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的超微結(jié)構(gòu)方面的證據(jù)。

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（本文編輯：董歷華）

Effects of Jinmaitong on ultrastructure of DRG neurons in STZ-DM rats

YANG Dan，LIANG Xiao-chun，QU Ling，et al. Department of Traditional Chinese Medicine，PUMC Hospital，PUMC&CAMS，Beijing 100730，China

LIANG Xiao-chun，E-mail：xcliang@vip.sina.com

Objective To study the effects of Jinmaitong on ultrastructure of dorsal root ganglion（DRG）neurons in STZ-induced diabetic rats.Methods The STZ-induced diabetic rats were randomly divided into 4 groups including normal control group（Con），Diabetic group（DM），JMT group（JMT）and Taurine group（Tau）.Six rats were in each group.All rats were given intragastric administration for 16 weeks and then culled.The mechanical withdrawal threshold was tested by electronic Von Frey instrument before death.The DRG of the rats was collected and used for transmission electron microscopy. Results Compared with the control group，the mechanical pain threshold of the DM group was significantly decreased（P<0.01）.The ultrastructure of mitochondria in DRG neurons of the DM group was severely damaged.The number of mitochondria in neurons was significantly decreased（P<0.01），and the rate of swelling mitochondria and mitochondria vacuolar degeneration in DRG neurons was significantlyincreased of the DM group（P<0.01）.The mechanical pain threshold and the number of mitochondria of two treatment groups were significantly improved compared with the DM group.The rate of swelling mitochondria and mitochondria vacuolar degeneration of two treatment groups were decreased strikingly（P<0.01），and the JMT group was more effective than the Tau group（P<0.01）.Conclusion JMT could ameliorate the peripheral neuropathy by improving the pathological morphology of mitochondria in DRG neurons.

Diabetic peripheral neuropathy； Dorsal root ganglia； Jinmaitong；Ultrastructure； Mitochondria

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.06.003

北京市自然科學基金（7122147）

100730 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心（楊丹、梁曉春、屈嶺、吳群勵、吳亞楠、石玥）；中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所電鏡室（戴威）

楊丹（1980-），女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：糖尿病慢性并發(fā)癥的中西醫(yī)結(jié)合臨床研究。E-mail：jsj000jsj@163.com

梁曉春（1956-），女，博士，教授，博士生導師。中國中西醫(yī)結(jié)合學會常務理事，中國中西醫(yī)結(jié)合學會內(nèi)分泌代謝病專業(yè)委員會副主任委員，北京中西醫(yī)結(jié)合學會糖尿病專業(yè)委員會主任委員。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病慢性并發(fā)癥。E-mail：xcliang@vip.sina.com

2015-12-27）