過表達(dá)DKK1、Sost重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)MG63細(xì)胞和相關(guān)蛋白的影響

萬雷，　黃宏興，　黃紅，　柴生颋，　魏合偉，　張志海，　王吉利

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東廣州　510240；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州　510405）

過表達(dá)DKK1、Sost重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)MG63細(xì)胞和相關(guān)蛋白的影響

萬雷1，黃宏興1，黃紅2，柴生颋1，魏合偉1，張志海1，王吉利2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東廣州510240；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

【目的】針對(duì)Wnt信號(hào)通路抑制因子Dickkopf（DKK）1、骨硬化蛋白Sclerostin（Sost）基因構(gòu)建過表達(dá)重組腺病毒載體，觀察其對(duì)MG63細(xì)胞和相關(guān)蛋白的影響?！痉椒ā繕?gòu)建DKK1、Sost過表達(dá)重組腺病毒載體，將培養(yǎng)好的MG63細(xì)胞分為空白對(duì)照組、空載病毒組（NC對(duì)照組）、過表達(dá)DKK1組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK1+Sost組5組，根據(jù)組別不同分別用上述過表達(dá)重組腺病毒感染MG63細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶（ALP）活性、鈣離子濃度和骨調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】與空白對(duì)照組比較，過表達(dá)DKK1組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK1+Sost組的細(xì)胞光密度值、ALP活性值均顯著降低，而鈣離子濃度顯著升高，以過表達(dá)DKK1+Sost組變化最明顯（P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，過表達(dá)DKK1組、過表達(dá)Sost組、過表達(dá)DKK1+Sost組的骨保護(hù)蛋白（OPG）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（Lrp）5、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）2、骨橋蛋白（OPN）表達(dá)量均降低，而腫瘤壞死因子（TNF）-α表達(dá)量則升高，以過表達(dá)DKK1+Sost組變化最明顯，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）?！窘Y(jié)論】過表達(dá)DKK1、Sost可降低MG63細(xì)胞增殖和ALP活性，升高鈣離子濃度，對(duì)骨調(diào)節(jié)蛋白有一定影響，尤以兩者同時(shí)過表達(dá)時(shí)的作用最強(qiáng)。

DKK1；Sost；過表達(dá)基因；腺病毒；MG63細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是由于年齡增加，性腺功能減退所導(dǎo)致的骨代謝疾病，嚴(yán)重危害老年人的健康。Wnt信號(hào)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與骨代謝關(guān)系密切的一個(gè)重要胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)眾多的胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子參與Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)［1］。而Wnt信號(hào)通路抑制因子Dickkopf （DKK）1和骨硬化蛋白Sclerostin（Sost）是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，在Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮了重要作用，被視為骨相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松、骨修復(fù)的治療靶點(diǎn)［2］。為了深入研究骨發(fā)育和骨重塑的分子機(jī)制，本研究構(gòu)建了過表達(dá)DKK1、Sost重組腺病毒載體，并觀察其對(duì)MG63細(xì)胞及相關(guān)蛋白的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1試劑和儀器人成骨肉瘤細(xì)胞（MG63）由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Pen/Strep和Opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000 Trizol Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶均購自美國Invitrogen公司；膠回收/純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物有限公司；BJ5183感受態(tài)細(xì)胞購自上海杰美基因公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國生物有限公司；KpnⅠ、XhoⅠ、PmeⅠ、PacⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；蛋白酶K、ALP活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司；抗Wnt信號(hào)通路抑制因子DKK1抗體購自美國CST公司；抗骨硬化蛋白（Sost）抗體、抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2抗體、抗骨橋蛋白（OPN）抗體、抗骨保護(hù)蛋白（OPG）抗體、抗腫瘤壞死因子（TNF）-α抗體均購自美國Abcam公司；RIPA細(xì)胞裂解液、Triton 100、EGTA、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；Calcium OtangeTM Indicators購自美國Molcular Probes公司；抗結(jié)締組織生長因子（CTGF）抗體、抗低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（Lrp）5抗體、抗成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）2抗體購自美國Santa公司；蛋白Marker購自美國Fermentasa公司；蛋白酶抑制劑/磷酸化抑制劑、ECL發(fā)光液購自德國Merck公司。DHP-9052細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國上海一恒公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（中國江蘇蘇凈公司）；H1650-W/H1650W高速低溫離心機(jī)（中國湘儀公司）；TC-S普通PCR儀（中國博日公司）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀（美國 Bio-Rad公司）；Mini Trans-Blot蛋白轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司）；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Nanodrop-2000微量核酸定量儀（美國Thermo公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和總RNA提取MG63細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于T75培養(yǎng)瓶，加入適量DMEM高糖培養(yǎng)基［含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS），1%青霉素—鏈霉素（Pen/Strep）］于體積分?jǐn)?shù)5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待長至80%左右融合，消化、收集細(xì)胞，以1∶3比例進(jìn)行傳代。棄培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)基，以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，吸盡液體，加入1 mL Trizol，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3目的基因過表達(dá)重組腺病毒載體構(gòu)建在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列DKK1（801 bp）、Sost（642 bp），采用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，并添加KpnⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)。以cDNA為模板，擴(kuò)增DKK1、Sost基因，與穿梭質(zhì)粒pENTER、PCR產(chǎn)物KpnⅠ、NotⅠ雙酶切，在T4 DNA酶作用下將DKK1、Sost基因與穿梭質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑選抗性克隆進(jìn)行酶切鑒定，轉(zhuǎn)化子涂布Kan+抗性平板，對(duì)提取的重組穿梭質(zhì)粒用KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切進(jìn)行測序鑒定。PmeⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒，PacⅠ酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒，將鑒定正確的重組腺病毒包裝質(zhì)粒命名為過表達(dá)DKK1（Ad-DKK1）、過表達(dá)Sost（Ad-Sost）。重組腺病毒包裝質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切線性化后，用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，收集病毒液，測定病毒滴度。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分為空白對(duì)照組、空載病毒組（NC對(duì)照組）、過表達(dá)DKK1 （Ad-DKK1）組、過表達(dá)Sost（Ad-Sost）組、過表達(dá)DKK1+Sost（Ad-DKK1+Ad-Sost）組5組，分別用重組腺病毒Ad-DKK1、Ad-Sost分別/同時(shí)感染各組MG63細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)（MOI）為50。重組腺病毒感染48 h后，分別消化收集細(xì)胞，采用qPCR、Western Blot檢測DKK1、Sost在MG63細(xì)胞中的表達(dá)，以確定過表達(dá)重組腺病毒感染MG63后Sost、DKK1基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用ABI7500公司自帶的PCR系統(tǒng)軟件分析，觀察擴(kuò)增曲線。采用2－△△Ct相對(duì)定量法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中△Ct＝Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct＝△Ct待測樣品中目的基因-△Ct對(duì)照樣品中目的基因，相對(duì)樣品模板量＝2－△△Ct。設(shè)定空白組某個(gè)樣本的檢測結(jié)果為參照基準(zhǔn)（數(shù)值為1），計(jì)算出其他樣本結(jié)果，并進(jìn)行組間比較。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Image J軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，計(jì)算目的蛋白光密度值，以目的蛋白光密度值與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參光密度值的比值（p）來表示結(jié)果。

1.5細(xì)胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度檢測MG63細(xì)胞感染重組腺病毒48 h后，分空白對(duì)照組、過表達(dá)DKK1（Ad-DKK1）組、過表達(dá)Sost（Ad-Sost）組、過表達(dá)DKK1+Sost（Ad-DKK1+Ad-Sost）組4組，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，分別采用MTT法檢測MG63細(xì)胞增殖，用酶標(biāo)儀490 nm測定光密度（D）值，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量后測定ALP活性，流式法分析細(xì)胞鈣離子濃度。

1.6骨調(diào)節(jié)蛋白OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN、TNF-α的檢測MG63細(xì)胞感染重組腺病毒48 h后，分空白對(duì)照組、過表達(dá)DKK1 （Ad-DKK1）組、過表達(dá)Sost（Ad-Sost）組、過表達(dá)DKK1+Sost（Ad-DKK1+Ad-Sost）組4組，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯色后進(jìn)行圖像分析。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。因方差齊性的假定不滿足，故采用無方差齊性假設(shè)的多重比較方法Tamhane’s。其他檢測結(jié)果采用q檢驗(yàn)和Duncan檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Ad-DKK1、Ad-Sost重組腺病毒載體構(gòu)建目的基因的核苷酸序列見表1。

表1　目的基因的核苷酸序列Table 1　Nucleotide sequence of the objective genes

2.2Ad-DKK1、Ad-Sost重組腺病毒感染MG63后各組DKK1、Sost基因相對(duì)表達(dá)量表2、表3和圖1結(jié)果表明：與空白對(duì)照組和NC對(duì)照組比較，Ad-DKK1、Ad-Sost重組腺病毒感染MG63細(xì)胞后DKK1、Sost mRNA水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明Ad-DKK1、Ad-Sost重組腺病毒可以有效感染MG63細(xì)胞，且感染后DKK1、Sost基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。

表2　Ad-DKK1重組腺病毒感染MG63后各組DKK1基因相對(duì)表達(dá)量比較Table 2　Comparison of the relative mRNA expression of DKK1 in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 recombinant adenovirus?。ā纒，n2－△△Ct）

表2　Ad-DKK1重組腺病毒感染MG63后各組DKK1基因相對(duì)表達(dá)量比較Table 2　Comparison of the relative mRNA expression of DKK1 in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 recombinant adenovirus　（±s，n2－△△Ct）

①P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；②P＜0.01，與NC對(duì)照組比較

組別空白對(duì)照組NC對(duì)照組Ad-DKK1組Ad-DKK1+Ad-Sost組N 3 3 3 3 DKK1 1.00±0.05 1.16±0.08 5.09±0.41①②3.95±0.25①②

表3　Ad-Sost重組腺病毒感染MG63后各組Sost基因相對(duì)表達(dá)量比較Table 3　Comparison of the relative mRNA expression of Sost in various groups after MG63 cells being infected with Ad-Sost recombinant adenovirus?。ā纒，n2－△△Ct）

表3　Ad-Sost重組腺病毒感染MG63后各組Sost基因相對(duì)表達(dá)量比較Table 3　Comparison of the relative mRNA expression of Sost in various groups after MG63 cells being infected with Ad-Sost recombinant adenovirus?。ā纒，n2－△△Ct）

①P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；②P＜0.01，與NC對(duì)照組比較

組別空白對(duì)照組NC對(duì)照組Ad-Sost組Ad-DKK1+Ad-Sost組N 3 3 3 3 Sost 1.02±0.22 1.34±0.07 11.85±1.06①②10.93±0.94①②

圖1　DKK1、Sost和GAPDH擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖Figure 1　The amplification plot and melting curve of DKK1，Sost and GAPDH

2.3Ad-DKK1、Ad-Sost重組腺病毒感染MG63后各組DKK1、Sost的蛋白表達(dá)表4、表5和圖2結(jié)果表明：與空白對(duì)照組和NC對(duì)照組比較，Ad-Sost、Ad-DKK1重組腺病毒感染MG63后Sost、DKK1在MG63細(xì)胞中的表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表4　Ad-DKK1重組腺病毒感染MG63后DKK1蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the protein expression of DKK1 in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 recombinant adenovirus?。ā纒，p）

表4　Ad-DKK1重組腺病毒感染MG63后DKK1蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of the protein expression of DKK1 in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 recombinant adenovirus　（±s，p）

①P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；②P＜0.01，與NC對(duì)照組比較

?

表5　Ad-Sost重組腺病毒感染MG63后Sost蛋白表達(dá)比較Table 5　Comparison of the protein expression of Sost in various groups after MG63 cells being infected with Ad-Sost recombinant adenovirus　（±s，p）

表5　Ad-Sost重組腺病毒感染MG63后Sost蛋白表達(dá)比較Table 5　Comparison of the protein expression of Sost in various groups after MG63 cells being infected with Ad-Sost recombinant adenovirus?。ā纒，p）

①P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；②P＜0.01，與NC對(duì)照組比較

組別空白對(duì)照組NC對(duì)照組Ad-Sost組Ad-DKK1+Ad-Sost組N 3 3 3 3 Sost 0.31±0.05 0.33±0.05 0.86±0.06①②0.83±0.05①②

圖2　各組DKK1、Sost表達(dá)凝膠電泳圖（Western blot法）Figure 2　Gel electrophoresis results for DKK1 and Sost expression in various groups（by Western blot method）

2.4Ad-DKK1、Ad-Sost對(duì)各組MG63細(xì)胞增殖、ALP活性、鈣離子濃度的影響結(jié)果表6結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，Ad-DKK1組、Ad-Sost組和Ad-DKK1+Ad-Sost組的細(xì)胞活性均明顯降低，鈣離子濃度均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白對(duì)照組比較，Ad-Sost組和Ad-DKK1+Ad-Sost組的ALP活性均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Ad-DKK1組的ALP活性雖較空白對(duì)照組也降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Ad-DKK1組比較，Ad-Sost組和Ad-DKK1+Ad-Sost組的細(xì)胞活性、ALP活性均顯著降低，鈣離子濃度均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與Ad-Sost組比較，Ad-DKK1+Ad-Sost組的細(xì)胞活性、ALP活性均降低，鈣離子濃度增高，細(xì)胞活性和鈣離子濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而ALP活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表6　Ad-DKK1、Ad-Sost對(duì)各組MG63細(xì)胞增殖、ALP、鈣離子濃度影響Table 6　Comparison of the cell viability，ALP activity，and Ca2+concentration in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 and Ad-Sost recombinant adenovirus　（±s）

表6　Ad-DKK1、Ad-Sost對(duì)各組MG63細(xì)胞增殖、ALP、鈣離子濃度影響Table 6　Comparison of the cell viability，ALP activity，and Ca2+concentration in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 and Ad-Sost recombinant adenovirus?。ā纒）

①P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；②P＜0.01，與Ad-DKK1組比較；③P＜0.01，與Ad-Sost組比較

組別空白對(duì)照組Ad-DKK1組Ad-Sost組Ad-DKK1+Ad-Sost組N 3 3 3 3 D（λ=490 nm）100±6.952 77.808±4.484①59.764±6.973①②45.171±5.975①②③JALP/（U·μL-1）5.925±0.251 5.364±0.300 3.287±0.363①②3.044±0.368①②cca2+/（nmol·L-1）118.7±12.22 207.01±7.39①254.51±21.55①②283.58±14.8①②③

2.5Ad-DKK1、Ad-Sost對(duì)MG63細(xì)胞中骨調(diào)節(jié)蛋白的影響結(jié)果表7結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，3組OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN均降低，而TNF-α升高，尤以Ad-DKK1+Ad-Sost組變化最顯著。與空白對(duì)照組比較，Ad-DKK1組Lrp5、CTGF、FGF2、OPN差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-Sost組 Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN、TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；Ad-DKK1+Ad-Sost組 OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN、TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與Ad-DKK1組比較，Ad-Sost 組OPG、Lrp5、BMP2、FGF2、OPN均有降低，而CTGF、TNF-α稍升高，兩組 Lrp5比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-DKK1+Ad-Sost組的OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN均降低，TNF-α稍升高，兩組OPG、Lrp5、CTGF、FGF2、OPN比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與Ad-Sost組比較，Ad-DKK1+Ad-Sost組的 OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN均降低，TNF-α稍升高，2組OPG、CTGF、FGF2比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

近年有研究表明Wnt信號(hào)通路在骨組織的生長發(fā)育以及個(gè)體成年后的骨代謝平衡中扮演重要角色，抑制Wnt通路會(huì)引起骨代謝異常，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，激活Wnt信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)骨形成，是目前骨骼系統(tǒng)相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制和骨代謝研究的新熱點(diǎn)［3］?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)眾多的胞內(nèi)蛋白質(zhì)分子參與Wnt信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)節(jié)，DKK1和Sost是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，在Wnt信號(hào)通路介導(dǎo)的骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮了重要作用［2］。由Sost基因表達(dá)的硬骨素作為骨形成抑制蛋白，是一種剛發(fā)現(xiàn)的調(diào)控骨形成的負(fù)性因子，屬于胱氨酸結(jié)構(gòu)超家族的一員［4］。Sost能夠特異性地在成熟骨骼的骨細(xì)胞中表達(dá)［5］。研究顯示：Sost能競爭性結(jié)合Wnt信號(hào)通路中的共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（Lrp5）來抑制該信號(hào)通路，從而引起骨形成障礙［6-7］。有研究對(duì)大鼠的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Sost基因缺失的大鼠可慢慢呈現(xiàn)高骨量狀態(tài)，并且通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使大鼠Sost基因呈高表達(dá)狀態(tài)可以使大鼠因骨量丟失而發(fā)生嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松，可見Sost與骨形成關(guān)系密切［8-9］。DKK1是骨形成過程中的另一個(gè)抑制因子，在許多骨骼疾病和某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要作用，其對(duì)Wnt信號(hào)通路也有抑制作用，作用機(jī)理與Sost作用機(jī)理相同，其作用途徑大都通過Wnt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)［10-11］。DKK1首先與Wnt信號(hào)通路受體Lrp5直接或間接結(jié)合，競爭性拮抗Wnt蛋白與其受體的結(jié)合，進(jìn)而形成多聚體復(fù)合物，促使胞內(nèi)信號(hào)分子β-catenin磷酸化，使其在細(xì)胞漿內(nèi)被水解，該過程阻斷β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而競爭性地阻斷Wnt信號(hào)通路的正常傳導(dǎo)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DKK1、Sost重組腺病毒感染MG63細(xì)胞后，可以降低MG63細(xì)胞活性和ALP活性，提高細(xì)胞中的鈣離子濃度，尤以過表達(dá)DKK1+Sost組變化最明顯，提示這是由于過表達(dá)的DKK1、Sost基因競爭性結(jié)合Wnt信號(hào)通路中的共受體Lrp5而抑制該信號(hào)通路的開放，從而引起MG63細(xì)胞增殖能力和ALP活性下降，為DKK1、Sost過表達(dá)可引起骨形成不足，骨量丟失提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，目前未見類似過表達(dá)重組腺病毒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞的研究報(bào)道。

表7　Ad-DKK1、Ad-Sost對(duì)各組MG63細(xì)胞中骨調(diào)節(jié)蛋白的影響Table 7 Comparison of the related bone regulating proteins expression in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 and Ad-Sost recombinant adenovirus?。邸纒，c/（μmol·L-1）］

表7　Ad-DKK1、Ad-Sost對(duì)各組MG63細(xì)胞中骨調(diào)節(jié)蛋白的影響Table 7 Comparison of the related bone regulating proteins expression in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 and Ad-Sost recombinant adenovirus?。邸纒，c/（μmol·L-1）］

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與Ad-DKK1組比較；⑤P＜0.01，與Ad-Sost組比較

組別空白對(duì)照組Ad-DKK1組Ad-Sost組Ad-DKK1+Ad-Sost組N 3 3 3 3 OPG 1.00±0.02 0.79±0.02 0.75±0.02 0.32±0.007②④⑤Lrp5 1.00±0.01 0.71±0.02①0.42±0.01②③0.33±0.01②④BMP2 1.00±0.01 0.86±0.05 0.68±0.03①0.55±0.03②CTGF 1.00±0.01 0.56±0.01②0.6±0.01②0.17±0.02②④⑤FGF2 1.00±0.01 0.75±0.02①0.64±0.01②0.19±0.01②④⑤OPN 1.00±0.04 0.65±0.02①0.42±0.01②0.39±0.01②③TNF-α 1.00±0.05 1.33±0.04 1.54±0.02②1.67±0.04②

正常骨代謝平衡有賴于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收協(xié)調(diào)統(tǒng)一。成骨細(xì)胞一方面通過合成骨基質(zhì)增加骨量，另一方面通過其分泌的腫瘤壞死因子（TNF）-α、骨保護(hù)蛋白（OPG）、骨橋蛋白（OPN）等調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成、活化，影響骨吸收。TNF-α是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，并參與正常炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。它不僅可增加破骨細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)量，而且可增加破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，對(duì)成骨細(xì)胞功能也有直接影響［13-14］。OPG是腫瘤壞死因子受體家族成員，成骨細(xì)胞分泌的OPG是核因子κB受體活化子配體的可溶性假受體，可通過與核因子κB受體活化因子配體結(jié)合，競爭性阻止核因子κB受體活化因子配體與破骨細(xì)胞中的核因子κB受體活化因子結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞形成和活化［15］。OPG還可阻斷TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡，減少TNF-α轉(zhuǎn)基因鼠的骨丟失［16］。Lrp5是一種細(xì)胞膜表面蛋白，是低密度脂蛋白受體家族成員中一員。最新研究表明，Lrp5存在于成骨細(xì)胞的表面，它的表達(dá)改變及功能丟失，可導(dǎo)致體外培養(yǎng)鼠頭蓋骨質(zhì)密度減低，骨質(zhì)厚度變薄，并在人的成長過程中影響骨質(zhì)獲得［17］。Lrp5參與的骨量調(diào)控機(jī)制為骨質(zhì)疏松癥等疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）2是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員之一，是一種分泌性多功能蛋白。在骨形成過程中，BMP2通過自/旁分泌，在細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)之間傳導(dǎo)信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增生，具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長發(fā)育及其重建過程［18］。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是一種新的可刺激成纖維細(xì)胞增殖和分泌膠原的生長因子，還具有促細(xì)胞增殖、遷移及分化等作用［19］。成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）2在骨和軟骨形成等發(fā)育和生理過程中的許多關(guān)鍵細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用［20］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)［21-22］證實(shí)，F(xiàn)GF-2是骨發(fā)育及形成過程中的重要調(diào)節(jié)因子，通過全身或局部給予FGF-2可增加生長發(fā)育中的大鼠骨膜內(nèi)骨形成。骨橋蛋白（OPN）是一種多功能分泌型糖蛋白，在骨基質(zhì)的礦化、吸收以及骨重塑等過程中均能發(fā)揮重要作用，介導(dǎo)骨組織細(xì)胞與骨基質(zhì)間的橋接，廣泛參與了骨相關(guān)疾病的病程進(jìn)展，顯示出多效的生物學(xué)活性［23］。

本研究對(duì)感染過表達(dá)DKK1、Sost重組腺病毒的具有人成骨細(xì)胞表型特征的MG63細(xì)胞進(jìn)行骨調(diào)節(jié)蛋白檢測，結(jié)果顯示：過表達(dá)DKK1、Sost可降低OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN表達(dá)量，提高TNF-α表達(dá)量（P＜0.05或P＜0.01）。此外過表達(dá)DKK1、Sost感染MG63細(xì)胞后，3組相關(guān)骨調(diào)節(jié)蛋白OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN的表達(dá)量均較空白對(duì)照組降低，而TNF-α則升高，尤以DKK1和Sost共表達(dá)組明顯。DKK1和Sost是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可以競爭性結(jié)合Wnt信號(hào)通路中的共受體Lrp5來抑制該信號(hào)通路的正常信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞增殖分化能力下降，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞分泌的促骨形成蛋白下降，而促骨吸收蛋白相對(duì)升高。本研究觀察了過表達(dá)DKK1、Sost對(duì)MG63細(xì)胞增殖、ALP活性和鈣離子濃度及相關(guān)骨調(diào)節(jié)蛋白的影響作用，有助于進(jìn)一步分析Wnt信號(hào)通路抑制因子DKK1、Sost在骨形成中的作用，可為通過抑制DKK1、Sost而誘導(dǎo)Wnt信號(hào)通路來調(diào)節(jié)骨骼的重建過程提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Construction of DKK1，Sost Overexpressing Recombinant Adenovirus Vector and Effect of Overexpression on MG63 Cells and Related Proteins

WAN Lei1，HUANG Hongxing1，HUANG Hong2，CAI Shengting1，WEI Hewei1，ZHANG Zhihai1，WANG Jili2

（1.The Affiliated Orthopedics and Traumatology Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510240 Guangdong，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo construct recombinant adenovirus vector with overexpression of Wnt signal pathway inhibitors of Dickkopf 1（DKK1）and Sclerostin（Sost），and to investigate the effect of the overexpression of inhibitors on MG63 cells and related proteins.Methods The DKK1，Sost overexpressing recombinant adenovirus vector was constructed，and the cultured mature MG63 cells were divided into blank control group，non-virusload control group（NC group），DKK1 overexpression group，Sost overexpression group，and DKK1+Sost overexpression group.MG63 cells of different groups were infected by the corresponding DKK1，Sost overexpressing recombinant adenovirus，and then we observed the cell viability，alkaline phosphatase（ALP）activity，and Ca2+concentration and related bone-regulating proteins expression.Results Compared with the blank control group，the cells optical density（OD）value and ALP activity were significantly decreased，and Ca2+concentration was significantly increased in DKK1 overexpression group，Sost overexpression group，and DKK1+Sost overexpression group，and the changes of the observation indexes were more obvious in DKK1+Sost overexpression group（P＜0.01）.Compared with the blank control group，the expression levels of osteoprotegerin （OPG），low-density lipoprotein receptor-related protein 5（Lrp5），bone morphogenetic protein 2（BMP2），connective tissue growth factor（CTGF），fibroblast growth factor 2（FGF2），and osteopontin（OPN）were decreased，the expression quantity of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）was increased in the three overexpression groups，and the changes of the observation indexes were more obvious in DKK1+Sost overexpression group，the inter-group difference being significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion The overexpression of DKK1，Sost can decrease the MG63 cell viability and ALP activity，increase Ca2+concentration，and has certain effects on related bone regulating proteins，and the effects of the overexpression of DKK1 together with Sost are strongest.

DKK1；Sost；overexpressed gene；adenovirus；MG63 cells；cell culture

R392.11

A

1007-3213（2016）04-0578-07

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.031

2016-03-01

萬雷（1979-），男，副主任中醫(yī)師，博士研究生；E-mail：gzwl802@163.com

國家自然科學(xué)基金課題（編號(hào)：81302991）；廣東省自然科學(xué)基金課題（編號(hào)：S2013040016828，2014A030310127）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013B021800058）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)青年英才項(xiàng)目（編號(hào)：QNYC20120119）；2014廣東省“優(yōu)青計(jì)劃”項(xiàng)目（編號(hào)：yq2014041）