一種簡單高效的新生鼠海馬神經元原代培養(yǎng)方法

謝麗，　趙樹進，　嚴華成，3，　石磊

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東廣州　510010；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州　510006；3.廣州軍區(qū)疾病預防控制中心，廣東廣州　510507）

·基礎研究·

一種簡單高效的新生鼠海馬神經元原代培養(yǎng)方法

謝麗1，2，趙樹進1，嚴華成1，3，石磊1

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科，廣東廣州510010；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510006；3.廣州軍區(qū)疾病預防控制中心，廣東廣州510507）

【目的】建立一種簡單、高效、高純度的新生小鼠海馬神經元的原代培養(yǎng)方法。【方法】取出生24 h內的C57BL/6J新生鼠，分離海馬組織，采用胰蛋白酶消化加機械吹打的方法獲得單個細胞，用含體積分數(shù)1%B27及2%Glutamax-100X、終濃度25 μmol/L Glutamate的Neurobasal-A培養(yǎng)基接種培養(yǎng)，3 d后用去Glutamate成分的上述培養(yǎng)基換液，并加阿糖胞苷作用48 h以抑制膠質細胞增長。于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，采用微管蛋白相關標志物2（MAP2）及Hoechst 33258免疫熒光染色鑒定神經元純度。【結果】此培養(yǎng)方法獲得的海馬神經元生長狀態(tài)良好，細胞形態(tài)從接種時的圓形透亮、無突起，到培養(yǎng)第7天后發(fā)展為神經元胞體聚集、樹突發(fā)達并形成縱橫交錯的神經網絡；經鑒定，神經元的純度高達97.2%以上，且能穩(wěn)定存活2～3周?！窘Y論】該方法操作簡單、高效，所得神經元純度高，結果穩(wěn)定。

海馬神經元；原代培養(yǎng)；新生小鼠

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的一個重要部分，參與記憶、學習、認知、情緒等多種高級精神活動［1］。體外培養(yǎng)海馬神經元是目前研究阿爾茨海默病、癲癇、腦卒中等神經系統(tǒng)疾病的重要模型［2］。自1977 年Banker等［3］首次在體外成功分離并培養(yǎng)出海馬神經元以來，海馬神經元的體外分離培養(yǎng)技術一直在不斷地發(fā)展和完善。但是海馬神經元培養(yǎng)過程復雜以及培養(yǎng)條件苛刻，因此如何得到純度和產量高、活性好的海馬神經元仍然值得探討。胎鼠和新生鼠都可用于海馬神經元的培養(yǎng)，但新生鼠的海馬神經元的分化程度較胎鼠的高，增加了高純度培養(yǎng)的難度［4］。本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，嘗試獲得一種簡單、高效、高純度的新生鼠海馬神經元培養(yǎng)方法，為相關中樞神經系統(tǒng)疾病的研究提供穩(wěn)定的細胞模型，現(xiàn)報道如下：

1　材料和方法

1.1實驗動物出生24 h內C57BL/6J小鼠，雌雄不限，普通（SPF）級，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2011-0015。

1.2主要試劑與儀器胎牛血清（FBS）（以色列Biological Industries公司）；多聚賴氨酸（PLL，美國Sigma公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DMEM/F12（美國 Hyclone公司）；DNAse I（瑞士Roche公司）；Neurobasal-A培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：10888022）；Glutamax-100X（美國Gibco公司）；谷氨酸（美國 Sigma公司）；B27（美國Gibco公司）；濃縮型正常山羊血清（中國博士德生物公司）；微管蛋白相關標志物2（MAP2）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；Alexa fluor 488標記的山羊抗兔IgG（美國谷歌生物公司）；Hoechst 33258染色液（中國凱基生物公司）。150i/240i二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、Axiovert 40 CFL熒光倒置顯微鏡（德國蔡司公司）。

1.3海馬神經元的培養(yǎng)

1.3.1培養(yǎng)板預處理培養(yǎng)板用工作濃度為0.1 mg/mL的多聚賴氨酸提前鋪板，放入37°C培養(yǎng)箱中，半小時后回收多聚賴氨酸，放入37°C培養(yǎng)箱中過夜，臨用前用磷酸鹽緩沖液（PBS）潤洗2次，晾干備用。

1.3.2溶液配制終止消化培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基加入體積分數(shù)10%FBS、體積分數(shù)1%雙抗（青霉素/鏈霉素）。維持培養(yǎng)基：Neurobasal-A培養(yǎng)基加入體積分數(shù) 2%B27、體積分數(shù) 1% Glutamax-100X、體積分數(shù)1%雙抗。接種培養(yǎng)基：維持培養(yǎng)基加入終濃度25 μmol/L Glutamate。

1.3.3培養(yǎng)方法取出生 24 h內 C57BL/6J小鼠，用體積分數(shù) 75%乙醇消毒，取出大腦組織，置入冰凍的 Hank’s平衡鹽溶液（HBSS）中分離雙側海馬組織，并仔細剔除血管及腦膜。將分離好的海馬組織剪碎至約1 mm3的小塊，加入約5倍組織體積的 2.5 g/L胰蛋白酶，放入 37°C孵育箱消化10 min，期間搖晃1次；加入約50 μL的DNA解旋酶以及終止消化的培養(yǎng)基（體積分數(shù)10% FBS、DMEM/F12、體積分數(shù)1%雙抗）終止消化。先加入半量的終止消化液，機械輕柔吹打約 15下，靜置 2 min，吸走上層細胞液，再加入另一半，重復上述操作，將剩余液制成單細胞懸液。取20 μL細胞液用于計數(shù)，其余 1 000 r/min室溫離心5 min，棄去上清液；加接種液培養(yǎng)基，尖嘴吸管輕柔吹打分散細胞后，按4×105個/mL的密度接種于預先包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板內。放入37°C、體積分數(shù) 5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種72 h后，加入含5 μmol/L阿糖胞苷的維持培養(yǎng)基全量換液，以抑制膠質細胞的增殖，作用48 h后用維持培養(yǎng)基全量換液。之后每隔2 d用維持培養(yǎng)基半量換液，選取不同時間點在倒置顯微鏡下觀察神經元生長狀態(tài)并拍照。

1.4純度鑒定取培養(yǎng)7 d的新生鼠海馬神經元，用 40 g/L的多聚甲醛室溫固 30 min，PBS清洗5 min×3次；加入體積分數(shù)0.2% Tritonx-100透化 5 min，體積分數(shù) 10%濃縮型正常山羊血清室溫封閉 30 min；加入 MAP2抗體（稀釋比例為1∶200），4°C冰箱過夜。次日取出，棄一抗，PBS清洗5 min×3次。避光加入Alexa Fluor 488標記的二抗（稀釋比例為1∶100），室溫30 min后，PBS清洗 5 min×3次；加入Hoechst 33258染色液，避光染色 5～10 min，PBS清洗 5 min×3次；加入PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照，記錄，用Adobe PhotoShop CS6軟件制作MAP2染色圖與Hoechst 33258染色圖的疊加圖，并計算純度百分比。根據(jù)帶綠色熒光的細胞占總細胞的比例即可判斷神經元的純度。

2　結果

2.1形態(tài)學觀察圖1結果顯示：培養(yǎng)1 d后細胞貼壁良好，呈圓形、橢圓形或錐體形，立體感強，部分細胞已伸出短小突起；培養(yǎng)第3天，胞體飽滿，折光性與立體感強，突起繼續(xù)增長，可見單極、雙極、多極多種突起，有些突起相互連接；培養(yǎng)第5天時，神經元胞體開始聚集，突起增多并相互連接呈網絡；培養(yǎng)第 7天，神經元樹突發(fā)達，神經元突起更密集，縱橫交錯，難以辨認突起的起源，形成發(fā)達的神經網絡。

圖1　不同培養(yǎng)時間海馬神經元的形態(tài)（×200）Figure 1　Histology of mouse hippocampal neurons at different culturing time（×200）

2.2神經元免疫熒光鑒定及純度鑒定圖2結果顯示：培養(yǎng)至7 d的海馬神經元細胞形態(tài)比較典型，胞體飽滿，軸突、樹突粗大，相互交錯形成神經網絡，此時利用神經元特異性標志物微管蛋白相關標志物2（MAP2）免疫熒光染色來鑒定神經元及檢驗其純度。MAP2陽性細胞胞體和樹突呈綠色，軸突及神經膠質細胞均不染色，同時采用Hoechst 33258 DNA熒光素對海馬神經元細胞核進行藍染獲得總細胞數(shù)量，正常海馬神經元細胞核光滑，呈卵圓形，亮度均一。疊加圖中胞體染細胞和核染細胞基本上都能重合。計算MAP2陽性細胞占總細胞的百分率，神經元的純度達97.2%。

圖2　神經元的鑒定（×200）Figure 2 Identification of mouse hippocampal neurons（×200）

3　討論

海馬神經元原代培養(yǎng)是研究神經系統(tǒng)結構及功能的重要技術之一。由于海馬取材過程中難以完全分離神經元與膠質細胞，而膠質細胞可增殖從而影響后期神經元的實驗研究；再加上操作技術復雜難于掌握，因此要穩(wěn)定獲得純度高、活性好的海馬神經元仍然很不容易。目前國內外根據(jù)使用培養(yǎng)液的不同可分為多種培養(yǎng)方法［5］。以往神經元的原代培養(yǎng)一般采用DMEM培養(yǎng)基，并用阿糖胞苷來抑制神經膠質細胞的增長［6］。但因為DMEM培養(yǎng)基也非常適合其他雜質細胞的生長，而阿糖胞苷的用量過大亦會對神經元生長造成影響，故此種方法獲得的海馬神經元純度不高。同時有改進的方法采用DMEM/F12培養(yǎng)液作為種植液，4 h后用含B27的Neurobasal-A 培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)［7-8］，但細胞培養(yǎng)4 h后細胞貼壁不牢固，換液會增加神經元的損失。

本研究中Neurobasal-A培養(yǎng)基（10888022）是美國Gibco公司生產的專門用于新生鼠神經元培養(yǎng)的培養(yǎng)基；B27添加劑中含有多種神經細胞生長的必需神經因子，因此添加B27而非血清可促進神經元的生長而抑制非神經元的生長和繁殖［9］；Glutamine對神經元有保護作用，但此溶液不穩(wěn)定，每次用時需現(xiàn)配現(xiàn)加，而Glutamax-100X能在培養(yǎng)中長期穩(wěn)定地給神經元提供代謝所需的Glutamine，從而有利于神經元的長期存活［10］；Glutamate參與突觸的形成和維持［11］，在接種后的前3 d，培養(yǎng)基中加入Glutamate可加快神經元突觸生長，促使神經元更好地貼壁，提高存活率。本研究選擇的接種液培養(yǎng)基結合以上成分優(yōu)點，為新生鼠海馬神經元提供了一個良好的生長環(huán)境，24 h后已有一部分神經元突觸明顯。3 d后換用去Glutamate的維持培養(yǎng)基并加入0.1 mg/mL阿糖胞苷，進一步抑制非神經元細胞（主要是膠質細胞）的增長。為了避免阿糖胞苷對神經元的影響，48 h后用維持培養(yǎng)基全量換液。由此方法培養(yǎng)的新生鼠海馬神經元7 d后可形成縱橫交錯的神經網絡，用MAP2免疫熒光染色法對神經元進行鑒定，純度可達97.2%。

由于海馬神經元取材過程的復雜性以及其本身細胞的脆弱性，因此在進行培養(yǎng)的實際操作中需反復試驗摸索，步步細心謹慎。關鍵步驟中有幾點值得注意：①為避免多聚賴氨酸多神經元的影響，包被回收后需用PBS清洗2遍。②保證分離提取海馬的整個過程在冰臺低溫環(huán)境中進行，所用到的HBSS也應預冷。③在取腦過程中盡量避免血液的殘留，可用預冷的HBSS沖洗2次。在剝離血管和腦膜時應徹底剝離干凈。④胰酶消化的時間不宜過長也不宜過短，一般10 min左右即可。⑤終止消化吹打獲得單細胞懸液時應動作輕柔，本研究采用分步吹打的方法，一次吹打15～20下后將上層細胞吸走，既避免了反復吹打的機械損傷，又能充分分離成單個細胞。無需過篩，減少了過篩過程的細胞損失。⑥細胞密度對神經元的生長尤為重要，密度過低導致神經元不能相互接觸，影響細胞的存活與成熟，密度過高亦可致接觸抑制，以及細胞聚集成團。因此培養(yǎng)時需認真計數(shù)，細胞密度為4×105～5×105個/mL為宜。⑦在接種后的12 h內盡量避免晃動細胞板，因為此時間段有些神經元還未貼壁或貼壁不牢，以防細胞的聚集，導致細胞分布不均勻。⑧加入阿糖胞苷處理后，需全量換液，之后采用半量換液的方式，因為神經元自身會分泌神經營養(yǎng)因子類物質，換半液有助于保留這些營養(yǎng)物質。

綜上所述，本研究所用的新生鼠海馬神經元的培養(yǎng)方法流程簡化、操作簡單，培養(yǎng)所得的神經元活性高、純度高，可穩(wěn)定培養(yǎng)至3周，值得推廣運用。

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【責任編輯：黃玲】

A Simple and Effective Primary Culture Method for Newborn Mouse Hippocampal Neurons

XIE Li1，2，ZHAO Shujin1，YAN Huacheng1，3，SHI Lei1
（1.Dept.of Pharmacy，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010 Guangdong，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；3.Center for Disease Prevention and Control，Guangzhou Military Command，Guangzhou 510507 Guangdong，China）

ObjectiveTo establish a simple，effective and high-pureity primary culture method for newborn mouse hippocampal neurons.Methods C57BL/6J newborn mice within 24 hours after birth were used for the isolation of the hippocampus.Mechanical pipetting combined with enzymic digestion with trypsin was used to obtain monoplast suspension，and then the neurons were planted in Neurobasal-A medium containing volume fraction of 1%B27，2% Glutamax-100X and 25 μmol/L of Glutamate.After culturing for 3 days，the initial medium for the neurons was totally replaced by the above medium with Glutamate free and with cytosine arabinoside（Ara-C）added to inhibit the growth of glial cells for 48 hours.The morphological changes of neuron cells were observed under inverted phase-contrast microscope.Microtubule-associated protein-2（MAP2）and Hoechst33258 immunofluorescence were used to identify the purity of neurons.Results The growth of hippocampal neurons obtained from the culture method was well on the 7th day of culturing，showing as neuronal soma aggregation，well-developed cytodendrite and formation of criss-crossed nerve net，which were quite different from the round，transparent，and process-free cells at the beginning of planting.The purity of the obtained neurons was more than 95%and the neurons could survive for 2-3 weeks stably.Conclusion The method is simple and effective for obtaining the high-purity and stable neurons.

hippocampal neurons；primary culture；newborn mice

R34

A

1007-3213（2016）04-0570-04

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.029

2016-01-14

謝麗（1989-），女，碩士研究生；E-mail：1032070376@qq.com

石磊（1962-），女，教授；E-mail：lucyshi622_921@163.com

廣東省科技計劃項目（編號：2013A022100035）；廣州市科技計劃項目（編號：201509010012）；廣州市科技基金項目（編號：2013J2200027）