血必凈注射液對創(chuàng)傷后內(nèi)皮細(xì)胞合成血管生成素2及血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的影響

湯建勇，　張海暉，　李天生，　何惠娟，　張媛莉

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東湛江　524000；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東湛江　524000）

血必凈注射液對創(chuàng)傷后內(nèi)皮細(xì)胞合成血管生成素2及血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的影響

湯建勇1，張海暉1，李天生1，何惠娟2，張媛莉1

（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東湛江524000；2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣東湛江524000）

【目的】觀察細(xì)胞外熱休克蛋白70（eHSP70）模擬創(chuàng)傷刺激內(nèi)皮細(xì)胞后血管生成素2（Ang-2）及血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）的變化，探討血必凈注射液對血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。【方法】培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，檢測eHSP70刺激0、2、4、8、16、32 h后細(xì)胞Ang-2、VE-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)量，找出最佳刺激時(shí)間，然后設(shè)空白對照組、eHSP70組（終濃度為0.1 μg/mL）、血必凈組（終濃度為50 mg/mL）、血必凈+eHSP70組共4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，檢測最佳時(shí)間點(diǎn)各組上述指標(biāo)改變?！窘Y(jié)果】 eHSP70刺激后Ang-2的mRNA及蛋白表達(dá)量增加并于4 h達(dá)到高峰，而VE-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)量經(jīng)eHSP70刺激后降低，并于4 h達(dá)到最低值。各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)4 h后，eHSP70組與血必凈+eHSP70組細(xì)胞Ang-2的mRNA及蛋白表達(dá)量較空白對照組顯著增高（P＜0.05），而血必凈+eHSP70組的表達(dá)量較eHSP70組顯著下降（P＜0.05）；與空白對照組相比較，eHSP70組VE-cadherin的mRNA及蛋白的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而血必凈+eHSP70組及血必凈組上述指標(biāo)表達(dá)量均顯著上升（P＜0.05），其中尤以血必凈組的表達(dá)增高最為顯著（P＜0.05）?！窘Y(jié)論】血必凈注射液通過調(diào)控eHSP70 對Ang-2與VE-cadherin的表達(dá)影響，對創(chuàng)傷刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

血必凈注射液；細(xì)胞外熱休克蛋白70；血管生成素2；血管內(nèi)皮鈣黏蛋白；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)

近期研究表明，機(jī)體受到創(chuàng)傷、低氧等刺激后可以釋放損傷相關(guān)分子模式（DAMP）分子，與病原體相關(guān)分子模式（PAMP）分子協(xié)同作用激活先天免疫系統(tǒng)促發(fā)炎癥反應(yīng)進(jìn)而造成血管內(nèi)皮的功能障礙［1］。其中細(xì)胞外熱休克蛋白70（eHSP70）是DAMP分子中研究的熱點(diǎn)。而血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管生成素2（Ang-2）是血管內(nèi)皮損傷的生物標(biāo)志物，本課題組前期研究表明Ang-2是影響膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）作為細(xì)胞黏附連接中的重要組成蛋白，對內(nèi)皮細(xì)胞通透性影響十分顯著［3］。本研究觀察了血必凈注射液對創(chuàng)傷后內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2及VE-cadherin的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞株由廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心何惠娟老師贈送。

1.2主要試劑和儀器eHSP70（以色列ProSpec公司）；DMEM（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（KP106-02）及熒光定量PCR試劑盒（FP205-02）購于中國TIANGEN公司；兔抗人血管生成素2抗體（美國abcam公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；引物（上海生工股份有限公司）；血必凈注射液（主要成分為紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等，生藥濃度為500 g/L，10 mL/支靜脈注射制劑，批號：04202）；7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；PowerPac通用電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs復(fù)蘇傳代后，取3～8代生長良好的內(nèi)皮細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長成單層后，換成含體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞生長同步于G0期用于實(shí)驗(yàn)。

1.4不同時(shí)間的eHSP70刺激實(shí)驗(yàn)G0期細(xì)胞加入無菌過濾的eHSP70（終濃度為0.1 μg/mL）培養(yǎng)基，分別于0、2、4、8、16、32 h這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞用于提取蛋白和RNA以明確最佳刺激時(shí)間。

1.5血必凈干預(yù)實(shí)驗(yàn)①空白組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；②eHSP70組：無血清培養(yǎng)基含eHSP70（終濃度0.1 μg/mL）［4］；③血必凈組：加入終濃度為50 mg/mL的血必凈無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)［5］；④eHSP70+血必凈組：依次加入eHSP70（終濃度0.1 μg/mL）和血必凈（終濃度為50 mg/mL）培養(yǎng)；各組培養(yǎng)時(shí)間為最佳刺激時(shí)間，然后收集細(xì)胞提取總RNA和蛋白進(jìn)行檢測。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Ang-2、VE-cadherin表達(dá)從GenBank獲取待測基因的cDNA序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，序列為：Ang-2正向引物5’-AACTTTCGGAAGAGCATGGAC-3’，反向引物5’-CGAGTCATCGTATTCGAGCGG-3’；VE-cadherin正向引物5’-AGGACATAACACCACGAAACG-3’，反向引物5’-CGGTCAAACTGCCCATACTT-3’；GADPH正向引物5’-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3’，反向引物5’-CAGTGATGGCATGGACTGTG-3’。采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA并測定純度和濃度，取每組RNA各1 μg，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用含SYBR Green I染料的擴(kuò)增試劑，按使用說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15 min，隨后的40個(gè)循環(huán)包括95℃、10 s，60℃、32 s。每種待測基因均行3復(fù)孔檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束獲Ang-2、VE-cadherin、GADPH mRNA的循環(huán)閾值（Ct），采用△△Ct（△△Ct= △Ct-△△Ct基礎(chǔ)值，△Ct=Ct目的-Ct內(nèi)參）法進(jìn)行相對定量分析，以2-△△Ct法［6］作為目的RNA的相對表達(dá)量。

1.7Western blot檢測Ang-2、VE-cadherin蛋白的表達(dá)收集上述各時(shí)間組及藥物處理組細(xì)胞，并提取細(xì)胞總蛋白，以二喹啉甲酸（BCA）法［7］進(jìn)行蛋白定量。各組取總蛋白約30 μg進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉1 h后，分別加入兔抗人Ang-2多克隆抗體、兔抗人VE-cadherin單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體（工作濃度分別為1∶500、1∶5 000、1∶500），4℃孵育過夜；次日加入二抗（工作濃度為1∶5 000），室溫孵育1 h后用超敏辣根過氧化物酶（ECL）化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，于暗室曝光。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，條帶使用Image J分析軟件分析灰度值，以Ang-2、VE-cadherin與內(nèi)參 GAPDH的灰度值比值（p）表示Ang-2、VE-cadherin蛋白相對含量。

1.8統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)的eHSP70刺激后內(nèi)皮細(xì)胞的Ang-2及VE-cadherin表達(dá)變化

2.1.1內(nèi)皮細(xì)胞的Ang-2、VE-cadherin mRNA水平變化圖1結(jié)果顯示：經(jīng)eHSP70刺激后，其他各時(shí)間組與0 h組比較，內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2 mRNA表達(dá)均顯著增加（P＜0.05），其他各時(shí)間組與4 h組比較，Ang-2 mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；經(jīng)eHSP70刺激后，其他各時(shí)間組與0 h組比較，內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的mRNA表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），其他各時(shí)間組與4 h組比較，VE-cadherin 的mRNA表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。

圖1　eHSP70刺激后各時(shí)間組細(xì)胞Ang-2和VE-Cadhein的mRNA表達(dá)　（±s，N=6）Figure 1　Ang-2 and VE-cadherin mRNA expression in HUVEC at different time points after eHSP70 stimulation

2.1.2內(nèi)皮細(xì)胞的Ang-2及VE-cadherin蛋白水平變化圖2和圖3結(jié)果顯示：與0 h組比較，其他各時(shí)間組內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2的蛋白表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）；其他各組與4 h組比較，Ang-2的蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。與0 h組比較，其他各時(shí)間組內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；其他各組與4 h組比較，VE-cadherin的蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）。

圖2　eHSP70刺激后各時(shí)間組細(xì)胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表達(dá)凝膠電泳圖Figure 2　Gel electrophoresis results for Ang-2 andVE-cadherin protein expression in HUVEC at different time points after eHSP70 stimulation

圖3　eHSP70刺激后各時(shí)間組細(xì)胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表達(dá)?。ā纒，N=6）Figure 3 Ang-2 and VE-cadherin protein expression in HUVEC at different time points after eHSP70 stimulation

2.2eHSP70刺激4 h后各實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞Ang-2和VE-cadherin的表達(dá)水平變化

2.2.1各實(shí)驗(yàn)組之間細(xì)胞Ang-2和VE-cadherin的 mRNA水平變化圖4結(jié)果顯示：經(jīng)eHSP70刺激4 h后，與空白組比較，eHSP70組及eHSP70+血必凈組的內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2 mRNA表達(dá)量均顯著增加（P＜0.05），而血必凈組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與eHSP70組比較，血必凈組及eHSP70+血必凈組表達(dá)量均較之顯著下降（P＜0.05）。經(jīng)eHSP70刺激4h后，與空白組比較，eHSP70組VE-cadherin的mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），血必凈組及eHSP70+血必凈組VE-cadherin的表達(dá)增高（P＜0.05），其中尤以血必凈組增高為顯著（P＜0.05）。

圖4　各組細(xì)胞Ang-2、VE-cadherin mRNA表達(dá)的影響Figure 4 Comparison of Ang-2 and VE-cadherin mRNA expression level in HUVEC of different groups（±s，N=6）

2.2.2各組細(xì)胞Ang-2和VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平變化圖5和圖6結(jié)果顯示：經(jīng)eHSP70刺激4 h后，與空白組比較，eHSP70組及eHSP70+血必凈組的內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2蛋白表達(dá)量均顯著增加（P＜0.05），而血必凈組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與eHSP70組比較，血必凈組及eHSP70+血必凈組表達(dá)量均顯著下降（P＜0.05）。經(jīng)eHSP70刺激 4 h后，與空白組比較，eHSP70組VE-cadherin的蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），血必凈組及eHSP70+血必凈組VE-cadherin的表達(dá)增高（P＜0.05），其中尤以血必凈組增高為顯著（P＜0.05）。

圖5　各組細(xì)胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表達(dá)電泳圖Figure 5 Gel electrophoresis results for Ang-2 and VE-cadherin protein expression in HUVEC of different groups

圖6　各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ang-2、VE-cadherin蛋白表達(dá)影響的電泳圖Figure 6 Comparison of Ang-2 and VE-cadherin protein expression levels in HUVEC of different groups showed by gel electrophoresis?。ā纒，N=6）

3　討論

研究表明，eHSP70在創(chuàng)傷等應(yīng)激后循環(huán)血液和體液中會明顯增加［8-9］。早期Ganter［10］證實(shí)，在臨床創(chuàng)傷早期無微生物感染階段Ang-2呈現(xiàn)明顯上升。Ang-2作為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要生物標(biāo)志物，在創(chuàng)傷患者中的升高是否與eHSP70的作用相關(guān)目前尚未明確。eHSP70作為DAMP的一員，其受體與PAMP分子中的細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）相似，主要通過Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）中的TLR2和TLR4進(jìn)行信號傳導(dǎo)，誘發(fā)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［4］。本課題組前期已證實(shí)膿毒癥患者血漿Ang-2與脂多糖（LPS）呈正相關(guān)［2］。由此推斷，eHSP70可能通過調(diào)控Ang-2的表達(dá)從而進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。由于eHSP70能促進(jìn)多種炎癥因子的釋放，并且機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于eHSP70刺激炎癥因子釋放的最佳時(shí)間點(diǎn)仍尚未達(dá)成共識。Asea等［4］使用eHSP70刺激外周血單核細(xì)胞2 h后，白細(xì)胞介素1（IL-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子明顯增高。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)eHSP70刺激后，各時(shí)間組內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2的mRNA和蛋白表達(dá)量較空白組明顯增高，并且4 h達(dá)到表達(dá)峰值，提示4 h是eHSP70的最佳刺激時(shí)間，這與Alexzander Asea的結(jié)果較為一致。本研究證實(shí)eHSP70對Ang-2的表達(dá)具有上調(diào)作用，這為今后創(chuàng)傷后炎癥損傷的研究提供了一定的理論依據(jù)。

內(nèi)皮細(xì)胞間連接包括緊密連接、黏附連接、縫隙連接和韌帶連接［11-12］，其對內(nèi)皮通透性起著主要的調(diào)控作用。隨著人們對炎癥研究的深入，關(guān)于eHSP70升高引起內(nèi)皮功能障礙的研究取得了一定進(jìn)展。De Maio［13］的研究表明，HSP70能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞縫隙連接，從而使內(nèi)皮細(xì)胞間通透性增加。眾所周知，VE-cadherin通過與β-catenin結(jié)合形成VE-cadherin/β-catenin復(fù)合體是內(nèi)皮粘附連接的關(guān)鍵因素［14］。黏附連接蛋白表達(dá)的可調(diào)控性，對內(nèi)皮細(xì)胞通透性影響十分顯著。但目前關(guān)于eHSP70是否通過調(diào)控VE-cadherin的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增加、炎癥因子滲漏的文章鮮有報(bào)道。本研究顯示經(jīng)eHSP70刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)量較空白組明顯降低，提示eHSP70通過對VE-cadherin的作用導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加。

血必凈注射液作為一種活血化瘀藥物組成的中草藥提取制劑，有文獻(xiàn)［15］證實(shí)其具有拮抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫、下調(diào)炎癥因子、保護(hù)臟器等作用。然而，對于創(chuàng)傷后的無菌性炎癥機(jī)制的研究，以及血必凈注射液對創(chuàng)傷后內(nèi)皮細(xì)胞損害是否有保護(hù)作用的探討鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果表明血必凈注射液顯著抑制了eHSP70引起的Ang-2表達(dá)上調(diào)，但對正常的內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2表達(dá)無明顯影響；此外血必凈也顯著減弱了eHSP70對VE-cadherin表達(dá)的抑制作用，并且還能上調(diào)正常內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的表達(dá)。張宏業(yè)等［16］證實(shí)血必凈注射液作用后，急性缺血性腦卒中并發(fā)SIRS患者血清中TNF-α、IL-6水平明顯下降。高紅梅等［17］體外研究表明，以內(nèi)毒素刺激內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)予血必凈注射液加以干預(yù)，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中血管性血友病因子（vWF）及內(nèi)皮素（ET）含量明顯下降，提示血必凈對膿毒癥引起的內(nèi)皮損傷具有一定的保護(hù)作用。陳碩等［18］證實(shí)，血必凈能下調(diào)脂多糖作用下大鼠腹膜間皮細(xì)胞HMGB-1、RAGE等促炎因子的釋放，結(jié)合上述研究提示血必凈既能抑制感染引起的炎癥作用，也能抑制創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，eHSP7能誘導(dǎo)Ang-2的表達(dá)，同時(shí)抑制VE-cadherin的表達(dá)，其誘導(dǎo)作用于4 h最顯著，血必凈能明顯抑制eHSP70對內(nèi)皮細(xì)胞的上述作用。本研究結(jié)果表明血必凈注射液不僅能拮抗膿毒癥引起的炎癥反應(yīng)，而且對創(chuàng)傷后eHSP70引起的內(nèi)皮損傷具有顯著的保護(hù)作用。這為今后血必凈在創(chuàng)傷炎癥方面的治療提供了新的研究方向和理論依據(jù)。

［1］Barton G M.A calculated response：control of inflammation by the innate immune system［J］.J Clin Invest，2008，118（2）：413.

［2］陳秋萍，張媛莉，姚華國，等.膿毒癥患者血漿血管生成素-2與脂多糖水平變化及其相關(guān)性［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28 （12）：2011.

［3］GumbinerB M.Celladhesion：the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis［J］.Cell，1996，84：345.

［4］Asea A，Rehli M，Kabingu E，et al.Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70：role of toll-like receptor （TLR）2 and TLR4［J］.J Biol Chem，2002，277（17）：15028.

［5］馬俊清，路偉，黃楊，等.血必凈注射液對百草枯刺激的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2008，28（9）：808.

［6］Huang R Y，Chu Y L，Jiang Z B，et al.Glycyrrhizin suppresses lung adenocarcinoma cell growth through inhibition of thromboxane synthase［J］.Cell Physiol Biochem，2014，33（33）：375.

［7］李鐘，韓彬，黃惠珠，等.虎杖—桂枝藥對配伍對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠TLR4/MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，32（6）：1040.

［8］Zhang X M，Xu Z G，Zhou L.Plasma levels of Hsp70 and anti-Hsp70 antibody predict risk of acute coronary syndrome［J］.Cell Stress Chaperones，2010，15（5）：675.

［9］Dulin E，García-Barreno P.Extracellular heat shock protein 70 （HSPA1A）and classical vascular risk factors in a general population ［J］.Cell Stress Chaperones，2010，15（6）：929.

［10］Ganter MT，Cohen MJ，Brohi K，et al.Angiopoietin-2，marker and mediator of endothelial activation with prognostic significance earlyafter trauma［J］.Ann Surg，2008，247（2）：320.

［11］Gumbiner B M.Breaking through the tight junction barrier［J］. J Cell Biol，1993，123（6Pt 2）：1631.

［12］SchmelzM，F(xiàn)ranke WW.Complexus adhaerentes，a newgroup of desmoplakin-containingjunctionsinendothelial cell：the syndesmos connecting retothelial cells of lymph nodes［J］.Eur J Cell Biol，1993，61（2）：274.

［13］De MaioA.Extracellular Hsp70：export and function［J］.Current Protein&Peptide Science，2014，15（3）：225.

［14］Dejana E，Orsenigo F，Lampugnani M G.The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability ［J］.J Cell Science，2008，121（Pt 13）：2115.

［15］湯魯明，王林霞，孫來芳，等.血必凈注射液對創(chuàng)傷性急性肺損傷患者HMGB1水平的影響及其治療價(jià)值［J］.藥物與臨床，2013，51（26）：56.

［16］張宏業(yè)，鄧慶平，蔡樺楊，等.益氣活血法對急性缺血性腦卒中并發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征患者炎癥介質(zhì)的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（3）：222.

［17］高紅梅，常文秀，曹書華.“血必凈”注射液對內(nèi)毒素刺激的內(nèi)皮細(xì)胞的影響［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2005，25（6）：437.

［18］陳碩，高利麗，王二敏，等.血必凈對脂多糖作用下大鼠腹膜間皮細(xì)胞HMGB-1、RAGE及TGF-β1表達(dá)的影響［J］.中國免疫學(xué)雜志，2014，30（2）：266.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Influence of Xuebijing Injection on Formation of Angiopoietin 2 and Cadherin in Vascular Endothelial Cells Injured by Traumatic Stress

TANG Jianyong1，ZHANG Haihui1，LI Tiansheng1，HE Huijuan2，ZHANG Yuanli1
（1.Intensive Care Unit of Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000 Guangdong，China；2.Clinical Medical Research Center of Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524000 Guangdong，China）

Objective To observe the changes of angiopoietin 2（Ang-2）and vascular endothelial cadherin（VE-cadherin）in vascular endothelial cells injured by analogue trauma stress induced by intracellular heat shock protein70 （eHSP70），and to explore the protective effect of Xuebijing Injection（XI）on the endothelial cells.Methods The expression levels of Ang-2 and VE-cadherin mRNA and protein in the cultured human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were monitored at hour 0，2，4，8，16，32 after eHSP70 stimulation for the screening of the optimal stimulating time.The cultured HUVEC were randomized into blank control group，eHSP70 group（eHSP70 at final concentration of 0.1 μg/mL），XI group（XI at final concentration of 50 mg/mL），and XI+eHSP70 group，and the levels of Ang-2 and VE-cadherin at the optimal stimulating time were observed.Results After eHSP70 stimulation，the quantity of Ang-2 mRNA and protein expression in HUVEC was increased and then arrived at the peak value at hour 4，and the quantity of VE-cadherin mRNA and protein expression was decreased and then arrived at the valley value at hour 4.After medicine intervention for 4 h，the quantity of Ang-2 mRNA and protein expression in HUVEC of eHSP70 group and XI+eHSP70 group was increased（P＜0.05 compared with that in the blank control group），and XI+eHSP70 group had lower Ang-2 mRNA and protein level than eHSP70 group（P＜0.05）.Compared with the blank control group，the quantity of VE-cadherin mRNA and protein expression in eHSP70 group was decreased obviously（P＜0.05），and XI+ eHSP70 group and XI group had higher VE-cadherin mRNA and protein level than eHSP70 group（P＜0.05），in particular XI group had the highest level（P＜0.05）.Conclusion XI has protective effect on traumatic-stress induced endothelial cells injury through regulating Ang-2 and VE-cadherin expression medicated by eHSP70.

Xuebijing Injection；intracellular heat shock protein 70；angiopoietin 2；vascular endothelial cadherin；endothelial cells；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0560-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.027

2015-07-30；修改返回日期：2016-02-26

湯建勇（1989-），男，碩士研究生；E-mail：tjy_125@163.com

張媛莉（1970-），女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師；E-mail：zhangyuanly@126.com

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（編號：A2009484）