益氣除痰方對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤增殖及AKT表達(dá)的影響

翟林柱，　陳昌明，　趙媛媛，　林麗珠

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州　510405；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心內(nèi)科，廣東廣州　510060）

益氣除痰方對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤增殖及AKT表達(dá)的影響

翟林柱1，陳昌明1，趙媛媛2，林麗珠1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東廣州510405；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心內(nèi)科，廣東廣州510060）

【目的】研究益氣除痰方對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-ly10細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制?！痉椒ā繎?yīng)用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測(cè)益氣除痰方對(duì)OCI-ly10細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，以流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）染色檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用益氣除痰方和阿霉素誘導(dǎo)OCI-ly10細(xì)胞凋亡的能力。以Western blot法檢測(cè)益氣除痰方對(duì)OCI-ly10細(xì)胞絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）及磷酸化AKT（Thr308、Ser473）表達(dá)的影響?！窘Y(jié)果】益氣除痰方含藥血清對(duì)OCI-ly10細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用，且具有一定的時(shí)間—濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，聯(lián)合應(yīng)用益氣除痰方含藥血清和阿霉素組的凋亡率、阿霉素單藥組凋亡率及含藥血清組凋亡率均較陰性對(duì)照組顯著升高，其中聯(lián)合組促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用顯著強(qiáng)于阿霉素單藥組及含藥血清組（均P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示益氣除痰方含藥血清可顯著降低總AKT和p-AKT（Thr308）的表達(dá)?！窘Y(jié)論】益氣除痰方對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-ly10細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制及促進(jìn)凋亡的作用，并對(duì)阿霉素具有一定的抗腫瘤增效作用，其作用機(jī)制可能與抑制了AKT磷酸化的信號(hào)通路相關(guān)。

益氣除痰方；彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤/中西醫(yī)結(jié)合療法；細(xì)胞凋亡；AKT；蛋白表達(dá)；細(xì)胞培養(yǎng)

彌漫大 B細(xì)胞淋巴瘤（diffused large B-cell lymphoma，DLBCL）是一種具有高度侵襲性的淋巴瘤，是成人非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）中最常見的亞型，約占所有NHL的30%～40%［1］。近年來(lái)，隨著對(duì)該病認(rèn)識(shí)的逐漸深入，包括靶向治療、化療以及放療等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段的聯(lián)合應(yīng)用可以使部分患者得到治愈，但仍然有40% ～50%的患者最終因腫瘤進(jìn)展而死亡［1］。因此，如何進(jìn)一步提高非霍奇金淋巴瘤尤其是DLBCL的治療效果，成為目前亟待解決的臨床難題。

益氣除痰方是本院腫瘤科所創(chuàng)立的治癌良方，可以延長(zhǎng)中晚期非小細(xì)胞肺癌的生存期，患者可以保持較高的生活質(zhì)量，并且與化療聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用［2］。根據(jù)“異病同治”的中醫(yī)辨證原則，本課題組在運(yùn)用益氣除痰方治療NHL尤其是DLBCL上也已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)［3］。研究發(fā)現(xiàn)益氣除痰方與化療聯(lián)合使用，以及在化療結(jié)束后用于維持治療可以延遲部分患者的復(fù)發(fā)時(shí)間，已有成功治療的患者長(zhǎng)期生存［3］。但該方抑制DLBCL細(xì)胞的機(jī)制尚不明確，本研究擬通過(guò)觀察益氣除痰方作用下DLBCL細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律，從體外水平探討益氣除痰方抑制DLBCL的分子機(jī)制，為益氣除痰方在淋巴瘤治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株人DLBCL淋巴瘤細(xì)胞株OCI-ly10細(xì)胞由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠20只，體質(zhì)量150～220 g，均為雌性，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0006。

1.3主要試劑及儀器益氣除痰方所用中藥和阿霉素注射液（批號(hào)：H44024360）均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。鼠抗人磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶p-AKT（Thr308）一抗、鼠抗人P-AKT （Ser473）一抗、兔抗人AKT一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠及羊抗兔二抗購(gòu)自博奧森公司；體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)HyCLone公司；改進(jìn)杜氏培養(yǎng)基IMDM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）；垂直、轉(zhuǎn)移電泳槽及電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4抗癌中藥制備及中藥血清制備

1.4.1中藥制備益氣除痰方由西洋參15 g、生半夏及山慈菇各15 g等組成，實(shí)驗(yàn)中所用湯劑處方中的藥材，選用中國(guó)藥典2005年版（一部）收載品種，中藥飲片由專家鑒定。中藥用純化水煎煮3次，其中生半夏首次先煎30 min，純化水用量分別為飲片的10倍、8倍、8倍量，時(shí)間各30 min，收集煎煮液，過(guò)濾，濃縮至含生藥量2 g/mL，密閉4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2含藥血清制備SPF級(jí)SD大鼠20只，隨機(jī)分成2組，即益氣除痰方組（10只）及生理鹽水對(duì)照組（10只）。益氣除痰方組按Meeh-Rubner氏公式給予 10倍等效劑量的藥物，每日2次，間隔8 h，連續(xù)5 d；第5天上午灌胃2次，間隔1 h于末次灌胃后1 h腹主動(dòng)脈取血，室溫下靜置2～3 h后離心 15 min，取上清；56℃水浴箱滅活，0.22 μm濾膜過(guò)濾滅菌，分裝后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)胞培養(yǎng)OCI-ly10細(xì)胞維持于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的IMDM培養(yǎng)基中，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃下體外常規(guī)培養(yǎng)。

1.6CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測(cè)益氣除痰方抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液稀釋單細(xì)胞懸液，以約2 000個(gè)/孔細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別加入陰性對(duì)照組（空白血清，A1組）、10%含藥血清（體積分?jǐn)?shù)，下同，A2組）、20%含藥血清（A3組）、30%含藥血清（A4組）、40%含藥血清（A5組），50%含藥血清（A6組），各組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃溫育4 h后，以酶標(biāo)儀450 nm單波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（D）值，并記錄結(jié)果。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OCI-ly10細(xì)胞，接種至24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分別加入30%含藥血清+0.1 μg/mL阿霉素（聯(lián)合組，A組）、0.1 μg/mL阿霉素（阿霉素組，B組）、30%含藥血清（含藥血清組，C組）以及空白試劑（陰性對(duì)照組）。置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。用冰PBS洗滌2次細(xì)胞，2 000 r/min離心 5 min，棄上清。加入 500 μL的 Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V異硫氰酸熒光素（FITC）混勻后，加入碘化丙啶（PI）混勻。加入流式分析管中。室溫、閉光，反應(yīng)5～15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，Annexin V及PI的發(fā)射波長(zhǎng)分別為525 nm和610 nm，每個(gè)樣品測(cè)定20 000個(gè)細(xì)胞，以CXP Analysis軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.8細(xì)胞總蛋白的提取和定量

1.8.1蛋白提取對(duì)照組和試驗(yàn)組分別用含30%大鼠空白血清的培養(yǎng)液和30%大鼠含藥血清的培養(yǎng)液作用48 h后，采用放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA）裂解液抽提的細(xì)胞總蛋白，具體步驟如下：細(xì)胞裂解液100 μL加入懸浮細(xì)胞團(tuán)，冰浴15 min，4℃、14 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為總蛋白，-80℃保存。

1.8.2蛋白定量按說(shuō)明書步驟進(jìn)行，首先混合好A和B液，取80 μL混合液加入96孔板中；取蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（4、2、1、0.5、0.25、0 μL）和裂解好的蛋白樣品4 μL分別加入混合液中，37℃孵育30 min。采用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

1.9Western blot檢測(cè)對(duì)照組和試驗(yàn)組各取50 μg的蛋白樣品，加入1/2體積的3×聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）加樣緩沖液，煮沸5 min，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，封閉1 h后，分別加入合適稀釋濃度的一抗（稀釋比例分別為AKT 1∶500、p-AKT 1∶1 000），4℃冰箱孵育過(guò)夜；吐溫緩沖液TBST洗3次，再加入1∶10 000稀釋的二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠IgG）。室溫孵育1.5 h。ECL顯色法顯色，X光膠片掃描成像。結(jié)果以GAPDH表達(dá)量定為1，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示AKT及p-AKT的相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料以百分率表示。多組、多個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較用Univariate，SNK法，多組間同一時(shí)間點(diǎn)比較用 One-Way ANOVA、LSD/SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CCK-8檢測(cè)結(jié)果圖1結(jié)果顯示：大鼠空白血清對(duì)OCI-ly10細(xì)胞活力基本無(wú)影響，各含藥血清組（10%～50%含藥血清）對(duì)OCI-ly10細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，其中以30%、40%、50%含藥血清對(duì)細(xì)胞抑制作用較明顯，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用越顯著（P＜0.01）。本研究取30%含藥血清作為后續(xù)試驗(yàn)選用血清。

圖1　CCK-8法檢測(cè)益氣除痰方對(duì)淋巴瘤細(xì)胞OCI-ly10的抑制作用Figure 1　Inhibitory effect of QPR on OCI-ly10 detected by CCK8　（±s，N=3）

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表1及圖2結(jié)果顯示：聯(lián)合組、阿霉素組、含藥血清組的凋亡率均顯著高于陰性對(duì)照組，其中聯(lián)合組促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用顯著強(qiáng)于阿霉素組及含藥血清組（P＜0.01）。

表1　各組對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 Comparison of apoptotic rate in various groups?。ā纒）

表1　各組對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響Table 1 Comparison of apoptotic rate in various groups?。ā纒）

①P＜0.01，與陰性對(duì)照組比較；②P＜0.01，與聯(lián)合組比較

組別陰性對(duì)照組阿霉素組含藥血清組聯(lián)合組N 3 3 3 3 p凋亡率/% 1.1±1.53 36.7±1.79①②42.9±2.01①②63.0±1.22①

圖2　各組誘導(dǎo)OCI-ly10細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖Figure 2　Flow cytometry results of OCI-ly10 apoptosis in various groups

2.3各組AKT及p-AKT的表達(dá)結(jié)果表2及圖3結(jié)果顯示，30%益氣除痰方含藥血清作用48 h后，與陰性對(duì)照組比較，含藥血清組AKT及p-AKT （Thr308）的表達(dá)水平顯著下降，而p-AKT（Ser473）的表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.05）。

表2　各組AKT、p-AKT相對(duì)表達(dá)比較Table 2 Comparison of relative expression of AKT and p-AKT in various groups?。ā纒，p）

表2　各組AKT、p-AKT相對(duì)表達(dá)比較Table 2 Comparison of relative expression of AKT and p-AKT in various groups?。ā纒，p）

①P＜0.05，與對(duì)照組比較

組別對(duì)照組中藥組N 3 3 AKT 1.07±0.23 0.09±0.02①p-AKT（Thr308）0.29±0.07 0.11±0.04①p-AKT（Ser473）0.01±0.02 0.12±0.05①

圖3　各組AKT、p-AKT的表達(dá)凝膠電泳圖譜Figure 3 Gel electrophoresis results for the expression of AKT and p-AKT in various groups

3　討論

中醫(yī)重視辨證論治，因人而異，在淋巴瘤的治療上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為：“無(wú)痰不作結(jié)”，《外科正宗》亦云：失榮者，因六欲不遂，損傷中氣，郁火所凝，墜痰失道，停結(jié)而成。故惡性淋巴瘤其病因之本在于虛與痰。林麗珠等［3］認(rèn)為惡性淋巴瘤以正虛為本，主要是臟腑氣血陰陽(yáng)失調(diào)，氣滯、痰濁、水濕、瘀血、癌毒相互搏結(jié)而成。病機(jī)主要責(zé)于內(nèi)虛與痰結(jié)，故補(bǔ)虛和祛痰為治療關(guān)鍵。

益氣除痰方是本院腫瘤科所創(chuàng)經(jīng)典治癌良方，全方通過(guò)益氣、消積、清利而共奏化痰之功，標(biāo)本兼顧。其中，西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰、益肺生津，生半夏及山慈菇散堅(jiān)消結(jié)、化痰解毒等。現(xiàn)代研究表明西洋參的最主要活性成分為皂苷類，目前西洋參皂苷類成分已經(jīng)分離鑒定出49種；西洋參除了傳統(tǒng)的生理活性外，其中所含人參皂苷在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥等生理活性方面具有很高價(jià)值［4］。生半夏抗腫瘤的主要成分為半夏多糖，對(duì)小鼠子宮頸癌14、肉瘤180、肝癌HCA及Hela細(xì)胞、胃腺癌細(xì)胞系BGC2823等有明顯的抑制作用［5］。山慈菇抗腫瘤的有效成分為秋水仙堿及其衍生物秋水仙酰胺，其抗腫瘤機(jī)理在于抑制微管蛋白，阻滯有絲分裂，使細(xì)胞分裂停止于中期，廣泛用于多種腫瘤的治療［6］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在益氣除痰方含藥血清作用下，DLBCL OCI-ly10細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，并且與含藥血清濃度及用藥時(shí)間成正比，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這種抑制主要與DLBCL細(xì)胞的凋亡增加有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道DLBCL的凋亡與若干異常激活的生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，其中最重要的是磷脂酰肌醇-3羥基激酶（PI3K）所介導(dǎo)的PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路［7］，激活的機(jī)制包括催化亞單位p110α的擴(kuò)增［8］，及張力蛋白同源的磷酸酶（PTEN）缺失［9］等。PI3K與胞膜表面活化后的B細(xì)胞受體（BCR）胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)結(jié)合后，激活催化亞單位p110α。p110α可通過(guò)消耗ATP使4，5－雙磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)化為第二信使3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。PIP3進(jìn)一步磷酸化下游絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT保守區(qū)域，使其充分激活。PI3K/PTEN/AKT作為該信號(hào)通路的上游分子，可以通過(guò)激活多種下游底物，對(duì)DLBCL細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移及凋亡等發(fā)揮重要作用［7］。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)在原發(fā)胃和腸道MALT（部分MALT淋巴瘤最終轉(zhuǎn)化為DLBCL）和DLBCL淋巴瘤中存在PI3K的催化亞單位—PIK3CA（p110α）蛋白的過(guò)表達(dá)（40%陽(yáng)性），并證明陽(yáng)性表達(dá)的患者無(wú)進(jìn)展生存期更短，預(yù)后更差（P＜0.05），從而為DLBCL淋巴瘤中PI3K/AKT通路的激活提供了有力的證據(jù)支持［10］。

基于文獻(xiàn)報(bào)道，本研究進(jìn)一步探討益氣除痰方誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞凋亡與PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含藥血清作用下，不論是非磷酸化AKT還是磷酸化AKT蛋白（Thr308）表達(dá)都出現(xiàn)了明顯下降，這說(shuō)明益氣除痰方可通過(guò)抑制PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT來(lái)抑制DLBCL細(xì)胞生長(zhǎng)。而磷酸化AKT蛋白（Ser473）表達(dá)升高，可能與下游通路分子受到抑制產(chǎn)生負(fù)反饋影響有關(guān)［10］。既往孫玲玲［11］與周京旭［12］等均發(fā)現(xiàn)益氣除痰方可以促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞的失巢凋亡，并且凋亡原因部分與P-AKT的抑制相關(guān)。本研究結(jié)果與前述實(shí)體瘤的研究結(jié)果基本相符。由于血液系統(tǒng)腫瘤屬于非上皮來(lái)源腫瘤，其發(fā)生過(guò)程及臨床表現(xiàn)與上皮來(lái)源的肺癌等有很大差別，但從腫瘤細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)理上來(lái)講，兩者其實(shí)有很多共同之處，比如可以依賴相同的信號(hào)傳導(dǎo)通路。這也為中醫(yī)藥臨床“異病同治”提供了理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了益氣除痰方治療DLBCL的有效性，并對(duì)其中的機(jī)制從細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的角度進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)AKT蛋白是益氣除痰方誘導(dǎo)凋亡的靶蛋白。基于以上結(jié)果，后續(xù)研究將對(duì)益氣除痰方作用下的DLBCL PI3K/PTEN/AKT信號(hào)通路下游分子作進(jìn)一步探索。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Effect of Qi-benefiting and Phlegm-eliminating Recipe on Proliferation and Serine/threonine-protein Kinase AKT Expression of Diffused Large B-cell Lymphoma Cells

ZHAI Linzhu1，CHEN Changming1，ZHAO Yuanyuan2，LIN Lizhu1
（1.Center of Neoplasms，the First Affiliated Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.Dept.of Medical Oncology，Cancer Center of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510060 Guangdong，China）

Objective To investigate the effect of Qi-benefiting and Phlegm-eliminating Recipe（QPR）on the proliferation of diffused large B-cell lymphoma cells（OCI-ly10）and to explore its mechanism.Methods The inhibitory effect of QPR on the proliferation of OCI-ly10 cells was detected by Cell Counting Kit-8（CCK8）.The apoptosis of OCI-ly10 induced by QRP and doxorubicin was determined by flow cytometry combined with Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide（FITC/PI）staining method.The effect of QPR on the expression of serine/threonine protein kinase AKT and phosphorylated-AKT（Thr308 and Ser 473）was evaluated by Western blotting method.Results The growth of OCI-ly10 was inhibited by QPR-containing serum in time-concentration-dependent manner.The apoptotic rate of combination group（treated by QPR-containing serum and doxorubicin），doxorubicin group and QPR-containing serum group was significantly higher than that of the negative control group，and the combination group had the highest apoptotic rate（P＜0.05）.The results of Western blotting showed that AKT and p-AKT（Thr308）expression levels were down-regulated by QPR-containing serum（P＜0.05）.Conclusion QPR is effective on inhibiting OCI-ly10 growth and promoting OCI-ly10 apoptosis，and can enhance the anti-tumor effect of doxorubicin.Its possible mechanism may be associated with the inhibition of p-AKT related signaling pathway.

Qi-benefiting and Phlegm-eliminating Recipe；diffused large B-cell lymphoma/TCM-WM therapy；apoptosis；AKT；protein expression；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0556-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.026

2015-11-23

翟林柱（1980-），男，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師；E-mail：linzhuzhai@163.com

林麗珠，女，博士，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師；E-mail：lizhulin903@139.com

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（編號(hào)：81403228）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（編號(hào)：B2014176）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013B021800225）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年學(xué)者科研基金項(xiàng)目