柔毛水楊梅對人微血管內皮細胞增殖、遷移、成管能力的影響

劉城，　宋雨鴻，　王月剛，　裴靜嫻，　賴艷嫻，　申艷

（廣州市第一人民醫(yī)院心血管內科，廣東廣州　510180）

柔毛水楊梅對人微血管內皮細胞增殖、遷移、成管能力的影響

劉城，宋雨鴻，王月剛，裴靜嫻，賴艷嫻，申艷

（廣州市第一人民醫(yī)院心血管內科，廣東廣州510180）

【目的】 研究柔毛水楊梅對人微血管內皮細胞增殖、遷移、成管能力的影響?！痉椒ā繉⒉煌瑵舛龋?～200 ng/mL）柔毛水楊梅作用于人微血管內皮細胞（HMVEC-Ls），分別采用MTS法檢測細胞的增殖活性，劃痕法檢測細胞的遷移能力，Matrigel法檢測細胞的成管能力以及Western blot法驗證低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）、端粒酶逆轉錄酶（TERT）的表達水平?！窘Y果】MTS結果顯示：柔毛水楊梅與HMVEC-Ls共同培養(yǎng)7 d，25～200 ng/mL不同濃度組均可促進HMVEC-Ls增殖，與對照組（0 ng/mL）比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），以100 ng/mL組促進HMVEC-Ls增殖能力最顯著（P＜0.05）。劃痕實驗結果顯示：與對照組比較，50～150 ng/mL組HMVEC-Ls遷移率顯著增大，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），以150 ng/mL組HMVEC-Ls遷移率最高。成管實驗結果：與對照組比較，50～150 ng/mL組HMVECLs成管長度顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），亦以150 ng/mL組HMVEC-Ls成管長度最大。Western blot檢測結果：與對照組比較，150 ng/mL柔毛水楊梅濃度組HIF-1α、TERT和VEGF表達均顯著升高（P＜0.05）?！窘Y論】柔毛水楊梅可通過促進人微血管內皮細胞增殖、遷移、管樣形成而發(fā)揮促血管新生效應，其機制可能與HIF-1α-TERT-VEGF途徑介導的血管新生有關。

柔毛水楊梅；人微血管內皮細胞；血管新生；細胞培養(yǎng)

血管新生是機體對組織缺氧的一個適應性反應，在一系列的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，如：胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎癥、腫瘤生長和血管瘤的形成等［1］。促血管新生已成為缺血性血管疾?。ㄈ纾汗谛牟?、缺血性腦血管病以及外周血管?。┑闹委熜路较颍?］。柔毛水楊梅（Geum japonicum Thunb. var.chinense F.Bolle，GJ）是薔薇科路邊青屬植物，性寒，味苦、辛，功能補腎平肝、活血消腫，目前還發(fā)現其具有較強的促血管新生效能，但國內外對柔毛水楊梅的促血管新生研究相對較少。本研究擬通過觀察柔毛水楊梅對體外培養(yǎng)的人微血管內皮細胞（HMVEC-Ls）增殖、遷移、成管能力的影響，并同時對低氧誘導因子-1α（HIF-1α）、血管內皮生長因子（VEGF）、端粒酶逆轉錄酶（TERT）等促血管新生基因或相關基因表達的影響，以期初步探討柔毛水楊梅促血管新生的機制，現報道如下。

1　材料和方法

1.1藥物、試劑與儀器柔毛水楊梅為柔毛水楊梅全草（購自貴州省貴陽市孟關地區(qū)）的甲醇提取物［3］；HMVEC-Ls及其專用培養(yǎng)基（美國Clonetics公司）；CellTiter 96 Assay MTS/PES試劑盒（美國Promega公司）；Growth factor-reduced Matrigel（美國BD Bioscience公司）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；鼠抗人HIF-1α、TERT 及VEGF單克隆抗體（美國Chemicon公司），2.5 g/L胰酶溶液 ［不含乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）］/（含EDTA）（美國Gibco公司）；細胞用1285型生物安全柜（美國Thermo公司）；TS100-F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Z2型細胞計數儀（美國Beckman Coulter公司）；550伯樂550酶標儀（美國Bio-Rad公司）；全自動Western blot實驗系統(tǒng)（美國ProteinSimple公司）。

1.2細胞增殖評價96孔板中以2.0×103cells/孔的密度鋪板。8 h后換成HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基維持24 h，將柔毛水楊梅用HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（不含FBS和生長因子）進行不同濃度梯度的倍比稀釋后每孔加入100 μL，使終濃度分別為0、25、50、75、100、150、200 ng/mL，種植在96孔培養(yǎng)板中，每組實驗重復3次，每組每次為6個孔，分別于接種后的第7天應用MTS/PES試劑盒測細胞增殖率。在Bio-Rad 550型酶標儀于490 nm波長處測量吸光度（D），細胞增殖能力用細胞增殖率表示：p細胞增殖（%）＝D給藥組/D對照組×100%。

1.3劃痕實驗將HMVEC-Ls以1.0×104cells/皿的密度接種于35 mm培養(yǎng)皿內，并置于37℃、體積分數5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)72 h以形成完全融合的單細胞層，于白紙上每隔3 mm劃平行線，將完全融合的HMVEC-L培養(yǎng)皿置于其上，使用200 μL無菌吸頭沿線進行劃痕；然后用PBS輕輕洗去脫落細胞碎片，用分別含有0、50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅的HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（不含FBS和生長因子）并置于37℃、體積分數5%CO2飽和濕度中繼續(xù)培養(yǎng)；于12 h后拍照并使用圖像分析軟件IPP 6.1分析。細胞遷移能力以遷移率表示：p細胞遷移（%）＝（原劃痕面積－殘留面積）/原劃痕面積×100%。

1.4成管實驗將Matrigel基質膠及96孔板置于4℃冰箱中過夜，向預冷的96孔板中加入Matrigel基質膠，每孔80 μL，37℃放置 2 h成膠。將HMVEC-Ls以1.0×104cells/孔的密度接種于預先由Matrigel基質膠包被的96孔板中并置于37℃體積分數5%CO2孵箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁后，立即更換為含有0、50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅的HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（不含FBS和生長因子）繼續(xù)培養(yǎng)；于12 h后在光學顯微鏡下觀察管樣結構并用圖像分析軟件IPP 6.1分析。細胞成管能力以每視野（×100）下所有管樣結構長度之和表示：l成管（mm/視野）=Σ（l1+l2+…+ln）/視野。

1.5Western blot檢測HIF-1α、TERT、VEGF的表達HMVEC-Ls以1×105接種到75 cm2培養(yǎng)瓶并置于37℃、體積分數5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，8 h后更換為HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（體積分數2%FBS，不含生長因子）繼續(xù)培養(yǎng)；24 h后再次更換為分別含有0、50、100、150 μg/mL柔毛水楊梅的HMVEC-Ls專用培養(yǎng)基（2%FBS，不含生長因子）繼續(xù)培養(yǎng)；96 h后分別收集細胞，用預冷的RIPA液裂解細胞，離心后，取上清測蛋白濃度，進行Western blot檢測。結果采用光密度掃描儀掃描、影像軟件Gel-pro analysis分析，用目的條帶的灰度值代表表達量，灰度值=面積×密度。

1.6統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，應用One-way ANOVA方差分析。方差齊性時組間比較采用LSD法，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。

2　結果

2.1柔毛水楊梅對HMVEC-Ls增殖的影響如圖1所示，將不同濃度的柔毛水楊梅與HMVEC-Ls共同孵育7 d后，不同濃度柔毛水楊梅均能顯著促進HMVEC-Ls增殖（P＜0.05）。當柔毛水楊梅濃度＜100 ng/mL時，HMVEC-Ls的細胞生長率隨柔毛水楊梅濃度的增加而增高（P＜0.05），呈明顯的濃度依賴關系。但當柔毛水楊梅濃度＞100 ng/mL后，HMVEC-Ls的細胞生長率顯著下降（P＜0.05）。

圖1　不同濃度柔毛水楊梅對HMVEC-Ls增殖的影響Figure 1　Effects of GJ at various concentrations on HMVEC-Ls proliferation　（±s，n=6）

2.2柔毛水楊梅對HMVEC-Ls遷移的影響圖2、圖3結果顯示：與0 ng/mL柔毛水楊梅組比較，50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅組HMVEC-Ls遷移率顯著增大，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且以150 ng/mL柔毛水楊梅組遷移能力最強（P＜0.05）。說明柔毛水楊梅能促進HMVEC-Ls遷移，且促HMVEC-Ls遷移的能力隨濃度增加而增強。

圖2　不同濃度柔毛水楊梅對HMVEC-Ls遷移的形態(tài)學觀察（×100）Figure 2　The histological feature of HMVEC-Ls migration affected by different concentrations of GJ（×100）

2.3柔毛水楊梅對HMVEC-Ls成管的影響圖4結果顯示：HMVEC-Ls細胞接種于Matrigel基質膠后起始呈圓形或卵圓形，1～2 h后各濃度柔毛水楊梅組HMVEC-Ls細胞逐漸伸展開并伸出突起，4～5 h后相鄰突起相互連接形成小管樣結構。圖5結果顯示：與0 ng/mL柔毛水楊梅組比較，50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅組成管長度顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且以150 ng/mL柔毛水楊梅組成管長度最長（P＜0.05）。表明柔毛水楊梅能促HMVEC-Ls成管，且促HMVEC-Ls成管的能力隨濃度增加而增強。

2.4柔毛水楊梅對HIF-1α、TERT及VEGF表達的影響圖6、圖7結果顯示：與0 ng/mL柔毛水楊梅組比較，50、100、150 ng/mL柔毛水楊梅組HIF-1α蛋白表達顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，與0、50 ng/mL柔毛水楊梅組比較，100、150 ng/mL柔毛水楊梅組TERT的表達亦顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而150 ng/mL柔毛水楊梅組VEGF的表達顯著高于0、50、100 ng/mL柔毛水楊梅濃度組（均P＜0.05）。而且在150 ng/mL柔毛水楊梅組，HIF-1α、TERT及VEGF的表達均最強。

圖3　不同濃度柔毛水楊梅對HMVEC-Ls遷移的影響Figure 3　Effects of GJ at various concentrations on HMVEC-Ls migration?。ā纒，n=6）

圖4　不同濃度柔毛水楊梅對HMVEC-Ls成管的形態(tài)學觀察（×100）Figure 4 The histological feature of HMVEC－Ls tube formation affected by different concentrations of GJ（×100）

圖5　不同濃度柔毛水楊梅對HMVEC-Ls成管的影響Figure 5　Effects of GJ at various concentrations on HMVEC-Ls tube formation?。ā纒，n=6）

圖6　不同濃度柔毛水楊梅下HIF-1α、TERT 及VEGF蛋白表達的變化Figure 6　Protein expression levels of HIF-1α，TERT and VEGF in HMVEC-Ls treatd with GJ at various concentrations

圖7　不同濃度柔毛水楊梅對HIF-1α、TERT及VEGF表達的影響Figure 7　Effects of GJ at various concentrations on the expression levels of HIF-1α，TERT and VEGF

3　討論

缺血性血管疾病的預后與相應缺血區(qū)域內靶血管的側支循環(huán)狀況密切相關，近年來在缺血性血管疾病的防治從單純改變病變血管供血轉向如何促進側支循環(huán)建立，中藥促血管新生治療有望為促側支循環(huán)的建立開辟新的途徑，成為目前缺血性血管疾病治療中具有發(fā)展前景的新方向［2］。血管生成是一個復雜的過程，涉及血管內皮細胞的活化、增殖、遷移、管樣形成以及毛細血管發(fā)芽等過程［4］，僅依靠單一的促血管新生因子很難完成［5］。HIF-1α作為一個重要的核轉錄因子，能直接或間接地調控VEGF等100多種下游促血管新生靶基因參與血管新生過程，具有“總開關”的特點，是血管新生的中心環(huán)節(jié)［6］。篩選出一種中藥能激活HIF-1α并經HIF-1α誘導血管新生途徑促血管新生，且弄清其分子調控機制是未來研究的主要方向。本研究發(fā)現：在不同濃度柔毛水楊梅的作用下，HMVEC-Ls的增殖、遷移、成管能力增加，且具有濃度依賴性，這表明柔毛水楊梅具有較強的促血管新生的活性，在治療性血管新生領域具有良好研發(fā)前景，但其機制仍不清楚。

HIF-1與下游促血管新生靶基因的VEGF組成的HIF-1α-VEGF途徑在血管新生的病理生理過程中最具有代表性［7］。另外一方面，最初認為機體內所有內皮細胞都是均質的，但實質上內皮細胞間還具有功能的異質［8］。尤其是在病理狀態(tài)下（如缺血性血管疾?。軆绕ぜ毎麜霈F老化和功能減弱［9］，而通過端粒酶激活可以逆轉這種衰老、增加增殖能力［10］。TERT基因的表達水平對端粒酶的活性起關鍵作用［11］?，F有研究發(fā)現低氧條件下HIF-1α直接介導TERT表達上調［12］，且TERT在VEGF誘導的血管新生中起“催化劑”的作用［13］。由此推論：柔毛水楊梅可能經HIF-1α-TERTVEGF途徑促血管新生。為驗證前述假設，本研究運用Western blot等分子生物學實驗方法，發(fā)現柔毛水楊梅能上調HIF-1α表達，而作為HIF-1α下游促血管新生靶基因的VEGF，其表達則隨HIF-1α的表達上調而上調。與此同時，治療性血管新生中維護靶細胞微血管內皮細胞功能的關鍵因素——TERT的表達在該過程中亦上調，且與其上調HIF-1α、VEGF表達具有一致性。說明柔毛水楊梅促血管新生效應與HIF-1α-TERT-VEGF途徑誘導的血管新生有關。然而，HIF-1α、TERT、VEGF之間的調節(jié)關系目前仍不清楚，需要進一步深入研究。

綜上所述，柔毛水楊梅可通過調節(jié)血管內皮細胞的活化、增殖、遷移、管樣形成從而發(fā)揮促血管新生效應，為治療性血管新生帶來新希望。

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【責任編輯：黃玲】

Effect of Geum japonicum Thunb.var.chinense F.Bolle on Proliferation，Migratio and Tube Formation of Human Microvascular Endothelial Cellsin Vitro

LIU Cheng，SONG Yuhong，WANG Yuegang，PEI Jingxian，LAI Yanxian， SHEN Yan
（Dept.of Cardiology，Guangzhou First People’s Hospital，Guangzhou 510180 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the effects of Geum japonicum Thunb.var.chinense F.Bolle（GJ）on the proliferation，migration and tube formation of human microvascular endothelial cells（HMVEC-Ls）in vitro. Methods The HMVEC-Ls were treated with different concentrations of GJ methanol extract.HMVEC-Ls proliferation，migration and tube formation were measured by MTS assay，wound-healing cell migration assay and Matrigel assay，respectively.The effect of GJ methanol extract on the expression levels of hypoxia inducible factor 1α（HIF-1α），telomerase reverse transcriptase（TERT）and vascular endothelial growth factor（VEGF）were detected by Western blotting method.Results MTS results showed that HMVEC-Ls proliferation index in 25-200 ng/mL of GJ groups was increased（P＜0.05 as compared with that of the control group），the effect of 100 ng/mL of GJ group being the best.HMVEC-Ls migration ratio in 50-150 ng/mL of GJ groups was enhanced（P＜0.05 as compared with that of the control group），the effect of 150 ng/mL of GJ group being the best.The tube length of HMVEC-Ls in 50-150 ng/mL of GJ groups was enhanced（P＜0.05 as compared with that of the control group），the effect of 150 ng/mL of GJ group being the best.In addition，HIF-1α，TERT and VEGF protein expression levels were also significantly up-regulated by GJ（P＜0.05）.Conclusion GJ can promote HMVEC-Ls proliferation，migration and tube formation，and the mechanism is related with angiogenesis mediated by HIF-1α-TERT-VEGF pathway.

Geum japonicum Thunb.var.chinense F.Bolle（GJ）；human microvascular endothelial cells （HMVEC-Ls）；angiogenesis；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0551-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.025

2016-02-12

劉城（1981-），男，副主任醫(yī)師；E-mail：adrian_liu@msn.cn

國家自然科學基金資助項目（編號：81100235）