人參皂苷Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制研究

張曉圓，　李榮江，　孫繼賢，　孫硯輝，　張苗苗，　伍志學(xué)，　張韌，　鄺棗園

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州　510006；2.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院普外科，廣東深圳　518102）

人參皂苷Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制研究

張曉圓1，李榮江2，孫繼賢1，孫硯輝1，張苗苗1，伍志學(xué)1，張韌1，鄺棗園1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州510006；2.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院普外科，廣東深圳518102）

【目的】 探討人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的影響。【方法】通過(guò)四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法測(cè)定不同濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響，并確定用于研究抑制LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移功能作用的Rh2濃度和作用時(shí)間。設(shè)置空白對(duì)照組及Rh2實(shí)驗(yàn)組（5、10、20、40、60 μmol/L），通過(guò)劃痕試驗(yàn)，對(duì)LoVo細(xì)胞劃痕加藥處理24 h后，觀察不同濃度Rh2對(duì)細(xì)胞遷移的影響。采用Transwell法觀察不同濃度Rh2對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。采用Western blot檢測(cè)不同濃度Rh2對(duì)CD44、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2（TIMP2）、E-Cadherin和β-catenin表達(dá)水平的影響?！窘Y(jié)果】MTT結(jié)果顯示：0～40 μmol/L Rh2處理LoVo細(xì)胞24 h對(duì)其生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。隨Rh2作用時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞抑制作用逐步增強(qiáng)。劃痕試驗(yàn)和Transwell結(jié)果表明：隨著Rh2濃度增加，其對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用增強(qiáng)，20 μmol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細(xì)胞24 h與空白對(duì)照組比較具顯著抑制作用。Western blot結(jié)果表明：隨著Rh2濃度的升高，CD44、MMP2蛋白表達(dá)水平下降，TIMP2、E-Cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)水平上升?！窘Y(jié)論】人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力有抑制作用，其抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴性。

人參皂苷Rh2；LoVo細(xì)胞；細(xì)胞遷移；細(xì)胞轉(zhuǎn)移；蛋白表達(dá)；細(xì)胞培養(yǎng)

我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，聯(lián)合化療和生物治療有助于提高患者的5年生存率，然而，其藥物本身的毒副作用極大限制了其應(yīng)用范圍。隨著傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的復(fù)興，越來(lái)越多的中藥以及中藥單體被應(yīng)用于臨床科學(xué)試驗(yàn)［1-3］。人參皂苷Rh2是人參中分離提純的一種單體，其在各種腫瘤的相關(guān)研究中有著較為顯著的作用，研究表明：Rh2能有效抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721［4］、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2和HT-29［5］、小鼠宮頸癌細(xì)胞U14［6］、人食管癌細(xì)胞Eca-109［7］、馬立克氏病腫瘤細(xì)胞系MSB-1［8］、人白血病多藥耐藥（MDR）細(xì)胞K562/ VCR［9-10］的增殖，提高機(jī)體免疫力［11］，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)受到抑制［12］。然而，針對(duì)人參皂苷Rh2對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究，目前尚無(wú)研究報(bào)道。

目前，體外研究腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力主要采用Transwell實(shí)驗(yàn)。Transwell實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)體外腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力來(lái)判斷腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的高低［1-2］。本研究擬采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人參皂苷Rh2對(duì)體外結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲能力的影響，并初步探討其分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo株由香港科技大學(xué)贈(zèng)送；Rh2購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司（Cat No.A0241，純度大于982.6 mg/g），溶于二甲基亞砜（DMSO）中配成10 mmol/L母液分裝凍存?zhèn)溆茫凰募谆嫉螓}（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清、液體培養(yǎng)基RPMI-1640和細(xì)胞培養(yǎng)用2.5 g/L胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；膠原預(yù)包被的Transwell（Cat No.3422）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；兔抗人 β-Tubulin（BM1453）、β-catenin （BA0426）、CD44（BA0321）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2（BA3716）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP2 （BA0576-2）和E-Cadherin（BA0475-2）抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2主要儀器Boxun SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)（中國(guó)上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；Thermo Fisher Scientific細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Motic AE2000倒置顯微鏡（中國(guó)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；IX71熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；i’Mark 680酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Bio-Rad電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）等。

1.3MTT法測(cè)定不同濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞增殖的影響5×103/孔LoVo細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，加入0、5、10、20、40、60 μmol/L Rh2分別處理24、48、72 h，每個(gè)濃度做6個(gè)平行孔，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)取每孔的吸光度（D）值。

1.4Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移的影響將細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL的LoVo細(xì)胞鋪于24孔板（每孔500 μL）上，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)16～24 h，使形成單層細(xì)胞，換成無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜；用200 μL移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次；加入5、10、20、40、60 μmol/L無(wú)血清培養(yǎng)基配制Rh2溶液，平行2個(gè)樣本，孵育24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。最后通過(guò)計(jì)數(shù)爬入“一”字劃痕空白區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的遷移能力。

1.5Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，用PBS和無(wú)血清培養(yǎng)基先后洗滌1次；用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為2×105/mL，在24孔板（下室）加入600 μL含體積分?jǐn)?shù)15%血清的培養(yǎng)基；上室用70 μL無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)箱孵育3 min，吸棄培養(yǎng)基后加入經(jīng)過(guò)不同濃度的人參皂苷Rh2處理的100 μL細(xì)胞懸液；繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h，用鑷子小心取出chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800μL甲醇的孔中；室溫固定30min，取出chamber，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800 μL Giemsa染液的孔中；室溫染色30 min，輕輕用PBS沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干；移至載玻片上，顯微鏡下隨機(jī)取9個(gè)大小一致的視野計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。最后通過(guò)計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)來(lái)反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

1.6Western blot檢測(cè)CD44、MMP2、TIMP2、ECadherin和β-catenin表達(dá)具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)［12］，對(duì)Rh2處理后的細(xì)胞進(jìn)行裂解提取蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印好的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜封閉后依次加入相應(yīng)一抗和二抗，膜入發(fā)光液中孵育后，用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行掃描，最后對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)法分析；多組間的比較采用單因數(shù)方差分析法分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)法分析。按α=0.05水平，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞活性的影響為了排除藥物的細(xì)胞毒性或細(xì)胞增殖作用對(duì)遷移和轉(zhuǎn)移功能的影響，首先采用MTT法檢測(cè)不同濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。表1結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，采用濃度為5、10、20、40 μmol/L Rh2處理LoVo細(xì)胞24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)Rh2濃度≥60 μmol/L處理24 h、濃度≥40 μmol/L處理48 h、濃度 ≥ 20 μmol/L處理72 h時(shí)，LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），提示人參皂苷Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞活力的影響有時(shí)間和濃度依賴性。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，把Rh2作用濃度控制在40 μmol/L以內(nèi)，作用時(shí)間為24 h進(jìn)行研究。

表1　不同濃度人參皂苷Rh2處理不同時(shí)間后對(duì)LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Table 1　The inhibition of different concentrations of Rh2 on the growth of LoVo cells at different time points（±s）

表1　不同濃度人參皂苷Rh2處理不同時(shí)間后對(duì)LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Table 1　The inhibition of different concentrations of Rh2 on the growth of LoVo cells at different time points（±s）

①P＜0.05，②P＜0.001，與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照組比較

組別　c/（μmol·L-1）N　D（λ=490 nm）空白對(duì)照組Rh2 1組Rh2 2組Rh2 3組Rh2 4組Rh2 5組Rh2 6組0 5 1 0 20 40 60 80 6 6 6 6 6 6 6 t=24 h 0 0.02±0.03 0.03±0.01 0.05±0.02 0.06±0.03 0.10±0.02①0.21±0.04②t=48 h 0 0.03±0.02 0.07±0.03 0.08±0.02 0.10±0.02①0.23±0.04②0.29±0.07②t=72 h 0 0.04±0.05 0.06±0.04 0.10±0.02①0.15±0.02②0.31±0.04②0.45±0.05②

2.2Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響圖1、圖2結(jié)果顯示：5～60 μmol/L濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移的影響結(jié)果，隨著藥物濃度增加對(duì)細(xì)胞遷移能力的抑制增強(qiáng)，20 μmol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細(xì)胞24 h，與空白對(duì)照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05）。

圖1　不同濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移的影響（×200）Figure 1　Effects of different concentrations of Rh2 on the migration of LoVo cells observed under inverted fluorescence microscope（×200）

2.3Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移功能的影響圖3、圖4結(jié)果顯示：5～60 μmol/L濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，隨著藥物濃度增加對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制增強(qiáng)，20 μmol/L以上濃度的Rh2處理LoVo細(xì)胞24 h，與空白對(duì)照組比較有顯著抑制作用（P＜0.05），結(jié)果與抑制遷移能力一致。

2.4Rh2對(duì)CD44、MMP-2、TIMP-2、E-Cadherin、βcatenin蛋白表達(dá)的影響圖5、圖6結(jié)果顯示：5～60μmol/L的Rh2對(duì)各蛋白表達(dá)的影響，隨著Rh2藥物濃度的升高，與空白對(duì)照組比較，CD44、MMP2蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），TIMP2、E-Cadherin、β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）。

圖2　各濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞遷移能力的影響Figure 2　Effects of different concentrations of Rh2 on the migration of LoVo cells（±s，N=3）

圖3　不同濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響（×400）Figure 3　Effects of different concentrations of Rh2 on the transfer of LoVo cells observed under inverted fluorescence microscope（×400）

圖4　各濃度Rh2對(duì)LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響Figure 4　Effects of different concentrations of Rh2 on the transfer of LoVo cells?。ā纒，N=9）

圖5　各組CD44、MMP2、TIMP2、E-Cadherin和βcatenin表達(dá)凝膠電泳圖Figure 5　Gel electrophoresis results for CD44，MMP2，TIMP2，E-Cadherin and β-catenin expression in different groups

3　討論

結(jié)腸癌是胃腸道中常見(jiàn)的惡性腫瘤，晚期治療效果不佳，惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是最終導(dǎo)致患者死亡的主要原因。人參皂苷Rh2單體能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，逆轉(zhuǎn)其異常分化，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移能力，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能提高療效、減少副作用。本研究結(jié)果顯示：一定濃度的人參皂苷Rh2能顯著抑制LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，且抑制作用隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)，結(jié)果與陶麗華、樸麗花、Kim和姚興軍等［13-17］關(guān)于人參皂苷Rh2能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力的報(bào)道相一致。

圖6　各組CD44、MMP2、TIMP2、E-Cadherin和β-catenin表達(dá)比較Figure 6　Comprison of CD44，MMP2，TIMP2，E-Cadherin and β-catenin expression levels in different groups?。ā纒，N=3）

腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的某些分子密切相關(guān)。β-catenin和E-Cadherin基因介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附，與細(xì)胞黏附分子CD44相互作用，它們的低表達(dá)有助于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［18-20］。而細(xì)胞基底膜的降解是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要因素，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與組織抑制因子（TIMP）的平衡對(duì)維持細(xì)胞基底膜的完整具有重要作用［21］。上調(diào)β-catenin、E-Cadherin基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞黏附，下調(diào)MMP2并同時(shí)上調(diào)TIMP2基因表達(dá)，阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解，并進(jìn)而降低與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移黏附分子CD44基因的表達(dá)，可以起到抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。

惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性之一就是腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤從原位增殖性病變發(fā)展到侵襲、轉(zhuǎn)移等復(fù)雜過(guò)程，其與降解酶類、黏附分子、癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力及其受體等多種原因都分不開(kāi)，細(xì)胞外基質(zhì)的降解、基底膜完整性的破壞，是腫瘤細(xì)胞完成浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的先決條件［21］。阻止腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)擴(kuò)散的天然屏障是基底膜，正?；啄な怯散粜湍z原等成分構(gòu)成的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，固有細(xì)胞不能正常通過(guò)［22］。細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要由蛋白水解酶來(lái)完成，基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs是一類鋅離子依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，能夠降解基底膜，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MMPs活性的主要調(diào)節(jié)因子是組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs），TIMPs能夠與激活狀態(tài)的MMPs，即TIMP2與MMP2結(jié)合，從而能夠抑制MMPs的產(chǎn)生及其活性，是腫瘤發(fā)生惡變與轉(zhuǎn)移的阻抑因素［23］。陳磊峰等［24］研究證實(shí)在原發(fā)性肝癌細(xì)胞中降低MMP2的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。王文祥等［21］實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TMIP2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，即伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中TMIP2的表達(dá)減弱。盧錦娥等［25］研究說(shuō)明在宮頸癌演變過(guò)程中，細(xì)胞通過(guò)TIMP2表達(dá)水平的上調(diào)從而起到抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移特性。本研究結(jié)果表明：隨著Rh2藥物濃度的升高，MMP2蛋白表達(dá)水平下降，TIMP2蛋白表達(dá)水平上升，二者維持在一個(gè)相對(duì)平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，阻止了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制了人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。

E-Cadherin是廣泛存在于各類上皮細(xì)胞中的鈣依賴性跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，除具有調(diào)節(jié)胚胎組織的發(fā)育、組織形成、參與細(xì)胞與細(xì)胞間信息傳遞交流等作用外，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的黏附聚集、維持上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性、維持細(xì)胞極性和參與分化調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。E-Cadherin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)缺失使細(xì)胞間的同質(zhì)黏附力下降，導(dǎo)致腫瘤易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［20，26］。包俊杰等［26］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，從正常乳腺組織發(fā)展到乳腺癌組織再到腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織的過(guò)程中，E-Cadherin表達(dá)逐漸減少。翁密霞等［20］也通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ECadherin的下調(diào)與缺失和非小細(xì)胞型肺癌的進(jìn)展、分化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。吳繼鋒等［27］的研究結(jié)果顯示，E-Cadherin表達(dá)與腫瘤的類型及分化有關(guān)，惡性程度越高、分化越差的腫瘤其E-Cadherin喪失越明顯。本研究結(jié)果表明：E-Cadherin蛋白表達(dá)水平與Rh2藥物濃度呈正相關(guān)，也證明了Rh2在抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面的作用。

β-catenin主要位于細(xì)胞膜，主要功能為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和參與基因的表達(dá)。李進(jìn)展等［28］研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在胃癌組織中的低表達(dá)率提示其與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，而E-Cadherin與β-catenin的正相關(guān)表達(dá)與協(xié)同作用提示了它們?cè)谀[瘤惡性轉(zhuǎn)移中的意義。本研究結(jié)果中，隨著Rh2藥物濃度的升高，E-Cadherin與β-catenin的表達(dá)也呈正相關(guān)性的增長(zhǎng)，為Rh2抑制人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移提示重要意義。

CD44分子作為一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白的黏附分子，分布十分廣泛。其主要參與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的特異性粘連過(guò)程，在細(xì)胞的黏附、血管的形成和腫瘤的浸潤(rùn)和增殖中發(fā)揮重要作用［19］。姚杰等［29］通過(guò)對(duì)肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中CD44的表達(dá)狀態(tài)的研究，發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶CD44表達(dá)與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)CD44表達(dá)呈正相關(guān)，提示患者肺癌病灶中的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44表達(dá)越高，其發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也就越高。本研究結(jié)果中，CD44蛋白表達(dá)水平隨著Rh2藥物濃度的升高而下降，再次驗(yàn)證了Rh2在抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面的作用。

近年來(lái)，不止一種中藥成方或中藥單體被用于研究其對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞侵襲或轉(zhuǎn)移能力的影響，例如安昌勇等［30］研究證實(shí)了槲皮素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞處理48 h后，LoVo細(xì)胞增殖、侵襲能力受到明顯抑制，其半數(shù)抑劑量（IC50）值約為40 μmol/L；李素云等［31］研究證實(shí)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的臨床使用方扶正抑癌方含藥血清大劑量組能有效降低LoVo細(xì)胞侵襲力和運(yùn)動(dòng)能力；郭穎等［1］研究證實(shí)了青蒿琥酯亦可抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲能力。然而上述藥物與人參皂苷Rh2比較，人參皂苷Rh2的用藥劑量較小而且作用時(shí)間較快，具有明顯優(yōu)勢(shì)，這無(wú)疑為臨床結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的治療提供了新的方向。

綜上所述，人參皂苷Rh2在體外培養(yǎng)試驗(yàn)中證實(shí)能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，為臨床結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的治療提供了依據(jù)，然而其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

［1］郭穎，郭建華，符航，等.青蒿琥酯對(duì)人大腸癌LoVo細(xì)胞侵襲影響的初步研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32（1）：60.

［2］陳茜，陳麗娟，黨媛媛，等.姜黃素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B侵襲轉(zhuǎn)移的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2016，37（1）：134.

［3］張醇，楊雪，范霞，等.吳茱萸堿對(duì)人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2010，23（8）：866.

［4］王華，周濱，郭星，等.人參皂苷Rh2對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和細(xì)胞骨架的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27 （6）：1226.

［5］李秋影，顏璐璐，馬曉慧，等.20（S）-人參皂苷Rh2對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和周期的影響［J］.中成藥，2011，33（11）：1874.

［6］張?zhí)m蘭，高文遠(yuǎn)，馬曉慧，等.人參皂苷Rh2對(duì)宮頸癌U14荷瘤小鼠的治療作用研究［J］.中成藥，2013，35（2）：215.

［7］李麗，齊鳳英，劉俊茹，等.人參皂苷Rh2對(duì)食管癌細(xì)胞Eca-109細(xì)胞周期的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30（20）：1617.

［8］王帥玉，付本懂，申海清，等.人參皂苷Rh2對(duì)MSB-1細(xì)胞的增殖抑制作用及其機(jī)理［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（8）：1052.

［9］徐曉軍，石淑文，湯永民，等.人參皂苷Rh2抗白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/VCR作用研究［J］.中草藥，2010，41（7）：1131.

［10］王占峰，羅毅男，洪新雨，等.人參皂苷Rh-2抗腫瘤作用機(jī)制的研究［J］.北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，6（1）：50.

［11］Liu X J，Tan Y H，Wu Y Y，et al.Inhibition and induction of apoptosis effects of Diosgenin on rat hepatoma cells CBRH7919 ［J］.Chin J Mod Med，2010，20（7）：980.

［12］杜標(biāo)炎，張小賀，譚宇蕙，等.六味地黃丸含藥血清調(diào)控黑色素瘤B16細(xì)胞株縫隙連接蛋白表達(dá)的作用［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（2）：152.

［13］陶麗華，劉紅巖，韓銳.20（R）-人參皂苷Rh2抗B16-BL6黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2006，33（11）：1505.

［14］樸麗花，金政，蔡英蘭，等.人參皂甙Rh2抗乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2011，11 （4）：867.

［15］樸麗花，金政，蔡英蘭，等.人參皂甙對(duì)肝癌Bel-7402細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響［J］.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34 （1）：40.

［16］Kim S Y，Kim D H，Han S J，et al.Repression of matrix metalloproteinase gene expression by ginsenoside Rh2 in human astroglioma cells［J］.Biochem Pharmacol，2007，74（11）：1642.

［17］姚興軍，洪新雨，劉興吉，等.人參皂甙Rh2對(duì)腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤侵襲性的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2005，2（3）：36.

［18］袁霜雪，王東旭，伍秋香，等.白藜蘆醇抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖與Wnt/β-catenin的關(guān)系研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（4）：537.

［19］張秋菊，劉斌，邢傳平，等.結(jié)直腸癌組織中ESA和CD44的表達(dá)及其臨床病理意義［J］.世界華人消化雜志，2009，17（14）：1417.

［20］翁密霞，吳翠環(huán)，楊秀萍，等.E-cadherin、CD44v6和PCNA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義［J］.癌癥，2008，27（2）：191.

［21］王文祥，陳勝喜，文繼舫，等.MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2和CD44V6在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與轉(zhuǎn)移、預(yù)后的關(guān)系［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2007，15（2）：122.

［22］Dunst J，Haensgen G.Simultaneous radiochemotherapy in cervical cancer：recommendationsfor chemotherapy［J］.Strahlenther Onkol，2001，177（12）：635.

［23］Ueno N T，Yu D，Hung M C.Chemosensitization of HER-2/neu overexpressing human breast cancer cells to paclitaxel（Taxol）by adenovirus type 5 E1A［J］.Oncogene，1997，15（8）：953.

［24］陳磊峰，劉天德，杜曉紅，等.原發(fā)性肝癌細(xì)胞中Rock2調(diào)控MMP2對(duì)其侵襲遷移的作用［J］.腫瘤防治研究，2014，41 （1）：35.

［25］盧錦娥，梁立治，瘳燦，等.MMP2及其抑制物TIMP2在宮頸癌發(fā)展中的作用［J］.現(xiàn)代醫(yī)院：專業(yè)技術(shù)篇，2008，8 （7）：31.

［26］包俊杰，吳誠(chéng)義.E-cadherin、N-cadherin與CD44+/CD24-/low表型在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性及其意義［J］.中國(guó)癌癥雜志，2010，20（8）：596.

［27］吳繼鋒，馬偉，張紅，等.Snail基因及其蛋白、E-cadherin蛋白在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2009，18（2）：167.

［28］李進(jìn)展，王媛媛，詹曉芬，等.胃癌組織中E-Cadherin、βcatenin蛋白表達(dá)及意義［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（20）：3345.

［29］姚杰，王志剛，童文先，等.腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和CD44在肺癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)情況［J］.西南國(guó)防醫(yī)藥，2010，20（12）：1300.

［30］安昌勇，謝剛，湯為學(xué)，等.槲皮素對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞增殖侵襲能力及癌胚抗原CEA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2013，18（1）：24.

［31］李素云，周春仙，衛(wèi)洪昌，等.扶正抑癌方含藥血清對(duì)結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力及TGE-β1與TβRⅡ蛋白表達(dá)的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，24（1）：68.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Effect of Ginsenoside Rh2 on Migration and Transfer Ability of LoVo Cells and Its Mechanism

ZHANG Xiaoyuan1，LI Rongjiang2，SUN Jixian1，SUN Yanhui1，ZHANG Miaomiao1，WU Zhixue1，ZHANG Ren1，KUANG Zaoyuan1
（1.Dept.of Biotechnology，School of Basic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Dept.of General Surgery，Bao’an Central Hospital，Shenzhen 518102 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside Rh2 on the migration and transfer of human colon cancer LoVo cells.Methods Effects of different concentrations of Rh2 on the proliferation of LoVo cells were determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）method，and the correlation of the effects with Rh2 concentration and intervention time was also investigated.We set up the blank control group and the experimental groups（at 5，10，20，40，60 μmol/L respectively），and then applied the scratch test for observing the effect of treatment with different concentrations of Rh2 for 24 h on cell migration，and used Transwell method for the evaluation of the cell transfer.Western blot was used for detecting the expression level of CD44，matrix metalloproteinase 2（MMP2）and tissue inhibitor of metalloproteinase 2（TIMP2），ECadherin and β-catenin after treatment with different concentrations of Rh2.Results The results of MTT method showed that treatment with 0-40 μmol/L of Rh2 for 24 h had no effect on the growth of LoVo cells.With the prolongation of Rh2 intervention time and the increase of Rh2 concentration，inhibition of LoVo cells was also increased gradually.Scratch assay and Transwell method results showed that with the increase of Rh2 concentration，the inhibitory effect on LoVo cell migration and transfer was enhanced，and Rh2 over 20 μmol/L had obvious inhibitory effect on LoVo cells compared with the blank control group.The results of Western blot showed that with the increase of Rh2 concentration，CD44 and MMP2 protein expression levels decreased，andthe expression levels of TIMP2，E-Cadherin and β-catenin protein increased.Conclusion Ginsenoside Rh2 has inhibitory effect on human colon cancer LoVo cell migration and transfer， and its inhibition is in time-and concentration-dependent manner.

ginsenoside Rh2；LoVo cells；cell migration；cell transfer；protein expression；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0545-07

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.024

2016-03-01

張曉圓（1988-），女，碩士研究生；E-mail：396373192@qq.com

張韌（1977-），男，副教授；E-mail：zhangrenn@foxmail.com。鄺棗園（1966-），女，教授；E-mail：zykuang-2005@qq.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81102714）；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：JCYJ20140415105244226）