基于代謝組學技術(shù)的田黃方配伍機制分析

羅朵生，　李坤平，　榮向路，　郭姣

（1.廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東藥科大學，廣東廣州　510006；2.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，廣東廣州　510006）

基于代謝組學技術(shù)的田黃方配伍機制分析

羅朵生1，2，李坤平1，榮向路1，2，郭姣1，2

（1.廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東藥科大學，廣東廣州510006；2.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點實驗室，廣東廣州510006）

【目的】觀察田黃方不同組方對血脂及代謝產(chǎn)物的影響，揭示其治療高脂血癥的組方機制。【方法】取雄性SD大鼠30只，分為正常組、模型組、三七組、黃連組及田黃組。采用高脂乳劑灌胃法復制高脂血癥大鼠模型并給予相應藥物治療，采集治療4周后的血液，采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/Q-TOF MS）技術(shù)建立大鼠血清的代謝物指紋圖譜。應用主成分分析和偏最小二乘判別分析模型組和田黃組、三七組、黃連組之間的代謝物譜差異，并通過變量重要性投影（VIP）選取生物標志物，比較各組的標志物并找出差異?！窘Y(jié)果】田黃方對飲食性高脂血癥大鼠模型的干預作用主要體現(xiàn)在對脂肪代謝、氨基酸代謝、炎癥和氧化應激的調(diào)節(jié)作用，而三七、黃連雖能一定程度改善模型組大鼠的代謝紊亂狀態(tài)，但未能從根本上恢復?！窘Y(jié)論】田黃方對高脂血癥動物模型血脂及代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于三七、黃連單用，其中三七以調(diào)節(jié)氨基酸代謝、能量代謝為主，黃連以調(diào)節(jié)炎癥、氧化應激及能量代謝為主，田黃方對上述代謝紊亂均有調(diào)節(jié)作用。

田黃方；高脂血癥/中藥療法；代謝組學；疾病模型，動物；大鼠

代謝組學方法主要用于研究生物體內(nèi)所有代謝產(chǎn)物在疾病或外源性物質(zhì)等因素擾動下的動態(tài)變化，并以此來反映生物體的病理生理變化趨勢，進而揭示其變化的機制［1］。代謝組學的研究思想是將人與外界環(huán)境的相互影響加以綜合考慮，該思想與傳統(tǒng)中醫(yī)藥強調(diào)人與自然協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體觀及其診療模式吻合。利用代謝組學方法可以更好地闡釋中藥組方的合理性、中醫(yī)診斷的科學性等。

田黃方是廣東藥科大學郭姣教授臨床驗方，由三七、黃連組成，課題組前期研究表明：該方具有降低高脂血癥大鼠血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）作用，防治脂肪肝，還能減少apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊。方中三七、黃連是臨床常用藥物，具有多種藥理作用。如現(xiàn)代藥理學研究表明三七具有改善心肌缺血、抗血小板聚集、降壓、抗動脈粥樣硬化等作用。近年來三七常用于治療冠心病、糖尿病、抗血栓等［2］。黃連主要活性成分小檗堿不僅在抗菌消炎、抗腸道細菌感染等傳統(tǒng)藥效方面發(fā)揮作用，而且在心血管系統(tǒng)疾病治療、高脂血癥及癌癥等方面的治療也表現(xiàn)出較好的生物活性，具有潛在的廣泛應用價值［3］。但據(jù)文獻報道，其單用口服時兩者生物利用度均不高［4-5］。本課題組前期藥代動力學研究表明：三七配伍黃連后，可促進三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的吸收，提高其體內(nèi)生物利用度。據(jù)此，本研究擬在比較該方單用及合用降脂藥效的基礎上，進一步從代謝組學角度，探討該方單用和合用降低高脂血癥的作用機制，為其組方的合理性及進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1試驗藥物

黃連，為毛茛科植物黃連 Coptischinensis Franch的干燥根莖；三七，為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen的干燥根和根莖，購自廣州至信藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)批號分別為050101、050322），經(jīng)廣東藥學院何偉教授鑒定，符合《中華人民共和國藥典》（2015年版）項下標準。取黃連、三七一定量，精密稱定，置于圓底燒瓶中，第1次加8倍量70%（體積分數(shù)，下同）乙醇，第2次分別加6倍70%乙醇，沸騰后計時，每次1 h，合并2次醇提液，減壓回收乙醇濃縮，制成質(zhì)量比黃連∶三七為1∶0、黃連∶三七為0∶1和黃連∶三七為1∶1的3個配比溶液，終濃度以生藥含量計1 g/mL，放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2動物

SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量約120 g，SPF級，廣東省醫(yī)學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK（粵）2008-0002。大鼠飼養(yǎng)在SPF潔凈級別動物房，室溫為22℃～24℃，相對濕度在40%～60%，光照時間隨自然變化，自由飲食飲水。

1.3試劑

脫氧膽酸鈉和膽固醇（中國醫(yī)藥集團公司）；丙硫氧嘧啶（廣東華南藥業(yè)公司）；吐溫280、1，2-丙二醇均為國產(chǎn)分析純試劑；總膽固醇（CHO）試劑盒、甘油三酯（TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，均購自中生北控生物科技股份有限公司。乙腈、異丙醇、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純，主要包括：無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠）；正己烷（天津市大茂化學試劑廠）；丙酮（衡陽市凱信化工試劑有限公司）；水為自制超純水。

1.4儀器

超高效液相色譜—四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC/Q-TOF MS，美國Waters公司）；GT10-1型高速臺式冷凍離心機（美國Fisher公司）；AMS-18A全自動生化儀（北京北方奧普森科技發(fā)展有限公司）。

1.5高脂血癥大鼠模型的建立及動物分組

采用高脂乳劑灌胃法復制高脂血癥大鼠動物模型，高脂乳劑參考課題組文獻［6］方法配制：稱取25 g豬油置200 mL燒杯中，加熱到100℃左右使其溶解，緩慢加入10 g膽固醇，攪拌至完全溶解；再加入1 g丙硫氧嘧啶和25 mL吐溫280，充分攪勻。同時在另一燒杯中加入30 mL蒸餾水和1，2丙二醇20 mL，加熱至60℃，然后加入2 g脫氧膽酸鈉，充分攪拌直到完全溶解。然后將2種溶液充分混勻，制成脂肪乳劑。大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、田黃組、三七組和黃連組，每組6只。正常組給予生理鹽水，模型組灌胃給予高脂乳劑，連續(xù)給藥4周誘導高脂血癥模型后分別給予相應藥物干預4周，給藥劑量均為3 g/kg。

1.6檢測指標及方法

給藥4周，眼眶后靜脈叢取血，一部分加入肝素鈉抗凝管中，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆糜诖x組學分析；剩余部分離心（3 000 r/min，10 min），制備血清，采用生化分析儀檢測血脂4項（TC、TG、LDL-C以及HDL-C）。

1.7UPLC/Q-TOF MS測定

1.7.1樣品制備取出血清，常溫解凍，離心（8 000 r/min，10 min），取400 μL上清液，氮氣吹干，加入200 μL乙腈—水（體積比為10∶90）復溶，取上清液100 μL進樣。

1.7.2色譜條件采用Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫 40℃，樣品室溫度：4℃，流速 0.35 mL/min，進樣量5 μL；流動相體積分數(shù)為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，0～5%B；10～11 min，30% ～50%B；11～16.5 min，50% ～100%B；16.5～17.5 min，100%～5%B；17.5～19 min，95%B）。

1.7.3數(shù)據(jù)采集電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，在正、負離子模式下，掃描范圍質(zhì)荷比（m/z）100～1 000。毛細管電壓3.0 kV，錐孔電壓35 kV，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度為450℃，脫溶劑氣體流速900 L/h，錐孔氣流量50 L/h。

1.8統(tǒng)計方法

采用Mass Lynx V 4.1工作站對檢測所得的總離子流圖進行色譜峰識別、峰匹配，峰面積積分。將每個數(shù)據(jù)點轉(zhuǎn)換成精確質(zhì)量和保留時間數(shù)據(jù)對，并以二維矩陣的形式將結(jié)果列出。利用主成分分析法（PCA）對數(shù)據(jù)進行處理，之后采用偏最小二乘模式識別分析法（PLS-DA）進行組間數(shù)據(jù)分析，選取模型中對分型貢獻比較大的變量也即變量重要性因子（variable importance in projection，VIP）≥1.5，將這些變量作為候選標志物，得到其保留時間和質(zhì)荷比信息。

1.9生物標記物的鑒定

根據(jù)化合物的精確分子量查詢以下3個在線數(shù)據(jù)庫：KEGG（http：//www.keg.com）、METLIN（http：//www.metlin.scipps.edu）、HMDB（http：//www.Hmdb. ca），解析化合物質(zhì)譜，對化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。因目前UPLC-TOF MS尚無公認的統(tǒng)一代謝組學數(shù)據(jù)庫，本研究中對數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果進行質(zhì)荷比（m/z）和保留時間（retention time，tR）的匹配對照，對于質(zhì)荷比在±0.5的，質(zhì)譜保留時間波動范圍為±0.5 min，在線性增加容許范圍內(nèi)的波動視為同一種物質(zhì)。因部分內(nèi)源性標志物質(zhì)荷比和保留時間相近或者是質(zhì)量數(shù)呈規(guī)律性變化（如+H、+Na、-H等），視為同一物質(zhì)的不同碎片，基于Metlab進行了各峰的相關(guān)性檢驗，相關(guān)系數(shù)≥0.95的峰視為同一物質(zhì)，能更好地對這些質(zhì)荷比和保留時間相近的內(nèi)源性標志物進行解釋。代謝途徑的查找將潛在代謝標記物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫，進一步發(fā)現(xiàn)代謝物涉及的代謝途徑。

2　結(jié)果

2.1田黃方配伍對高脂血癥大鼠血脂的影響

表1結(jié)果表明：模型組TC、TG、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低，與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；三七組、黃連組和田黃組均可顯著降低TC、TG、LDL-C含量，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中田黃組作用更明顯。

表1　各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比較Table 1　Comparison of rat serum TC，TG，LDL-C and HDL-C contents in various groups［±s，c/（mmol·L-1）］

表1　各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量比較Table 1　Comparison of rat serum TC，TG，LDL-C and HDL-C contents in various groups［±s，c/（mmol·L-1）］

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.01；與模型組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與田黃組比較

組別正常組模型組三七組黃連組田黃組N 6 6 6 6 6 TC 2.55±0.34 10.02±0.84①3.69±0.63②④2.74±0.65②2.58±0.22②TG 0.71±0.18 2.48±0.12①1.28±0.26②③1.35±0.21②③0.91±0.17②LDL-C 6.45±1.02 10.39±1.55①7.19±0.83②7.07±0.79②6.42±0.58②HDL-C 1.47±0.22 0.45±0.07①0.54±0.24 0.52±0.09 0.57±0.17

2.2田黃配伍降低高脂血癥大鼠血脂機制的探討

2.2.1大鼠血清UPLC/Q-TOF MS代謝物譜分析良好的色譜分析效果是保證信號不損失的關(guān)鍵，也是保證后期數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信性的基礎。圖1結(jié)果顯示：在優(yōu)化后的分析條件下，應用此條件正離子模式下取得了良好的分析效果。

圖1　大鼠血清正離子模式下的UPLC/Q-TOF MS輪廓譜Figure 1　UPLC/Q-TOF MS results for various groups

2.2.2各給藥組所致高脂血癥大鼠代謝表型的變化先運用 PCA法分析，觀察模型組與正常組、各給藥組與模型組的血清代謝物的差異。從圖2中可以看出，正常組與模型組完全分開，說明在造模過程中，大鼠機體生理及物質(zhì)代謝狀況發(fā)生了明顯變化，而各給藥組與模型組可以明顯的區(qū)分開來，說明在給藥治療過程中，能調(diào)節(jié)大鼠的機體病理及物質(zhì)代謝狀況。從PLS-DA軌跡圖（圖3）可以看出，轉(zhuǎn)歸趨勢為模型組→三七組→黃連組→田黃組→正常組，其中田黃組與正常組在PCI維接近，說明田黃方通過干預高脂血癥模型大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，使之代謝紊亂恢復至接近正常組。PCA loading圖可以找出對樣本的分類具有重要貢獻的代謝物的信息，離原點越遠的成分對分類貢獻越大，這些成分可分別被認為是干擾正常生理代謝（圖4）及發(fā)揮藥效作用機制（圖5）的潛在生物標記物。

圖2　大鼠正常組、模型組血清樣品Scores plots Figure 2 Scores plots of serum samples in the normal group and the model group

圖3　各組PCA軌跡圖Figure 3　PCA trace of various groups

圖4　大鼠正常組、模型組血清樣品loadingFigure 4　Loading chart of serum samples in the normal group and the model group

圖5　高脂血癥大鼠不同給藥組loadingFigure 5　Loading chart of hyperlipidemia rats in various medication groups

2.2.3田黃方配伍作用機制的探討根據(jù)PLSDA分析中VIP值和PCA分析中的重要性，篩選各組中具有明顯差異的化合物，結(jié)果在各組中找到了21個具有顯著差異的化合物。然后，根據(jù)所得到的分子式進行數(shù)據(jù)庫檢索。檢索策略如下：首先通過一級質(zhì)譜測得其準確的質(zhì)荷比，提取其總離子流圖，確定該質(zhì)荷比離子最大響應的保留時間，提取該保留時間的質(zhì)譜圖。根據(jù)一級質(zhì)譜圖的同位素峰信息，使用軟件中Formula Finder功能計算元素組成，結(jié)果顯示由質(zhì)量偏差最小的元素組成。利用軟件中的IDA explore功能，獲得該質(zhì)量數(shù)的二級質(zhì)譜，根據(jù)化合物元素組成和二級碎片離子，利用Chemspider Service對HMDB、METLIN、KEGG數(shù)據(jù)庫進行搜索，結(jié)合化合物化學鍵斷裂規(guī)律對化合物結(jié)構(gòu)進行判斷，最終鑒定化合物，對于質(zhì)荷比在±0.5的，質(zhì)譜保留時間波動范圍為±0.5 min，在線性增加容許范圍內(nèi)的波動視為同一種物質(zhì)。鑒定結(jié)果見表2、表3。

表2、表3結(jié)果提示：三七、黃連、田黃方各實驗組對生物標志物干預的數(shù)量分別為13、16、21個。從對生物標示物干預的數(shù)量來評價，田黃方＞黃連＞三七，以對生物標志物的干預作用來排序，藥理作用從強到弱依次為田黃方、黃連、三七，與藥效結(jié)果及得分圖的結(jié)果基本一致。

表2　高脂血癥動物模型表達上調(diào)趨勢的生物標志物及各實驗組對其干預作用的對比分析Table 2　Comparison of up-regulated biomarkers of rats in various groups

3　討論

整體綜合調(diào)節(jié)是中藥復方作用的主要方式。本研究采用代謝組學的全局觀方法，通過比較田黃方組合及拆方調(diào)節(jié)高脂血癥動物模型血脂的藥效作用，并進一步分析所有代謝產(chǎn)物的整體變化，綜合評價田黃方及其拆方的作用效果及配伍規(guī)律，結(jié)果顯示：田黃方對TC、TG、LDL-C的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于黃連組、三七組。以各實驗組對高脂血癥動物模型的整體代謝和內(nèi)源性生物標志物的干預變化為評價指標，田黃全方作用最好，黃連、三七次之。

表3　高脂血癥動物模型表達下調(diào)趨勢的生物標志物及各實驗組對其干預作用的對比分析Table 3　Comparison of down-regulated biomarkers of rats in various groups

通過比較分析正常組與模型組潛在生物標志物發(fā)現(xiàn)，高脂血癥大鼠不僅出現(xiàn)了脂質(zhì)代謝紊亂，而且還伴隨著糖代謝、氨基酸代謝的紊亂以及炎癥和氧化應激的出現(xiàn)。而通過比較各給藥組與模型組發(fā)現(xiàn)，不同給藥組調(diào)節(jié)代謝紊亂作用特點和機制不同，其中三七主要通過調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠氨基酸、能量代謝紊亂而發(fā)揮作用，表現(xiàn)在影響3-羥基丁酸、甲硫氨酸，賴氨酸、甘氨酸、纈氨酸等，這些小分子代謝物與能量代謝、氨基酸代謝密切相關(guān)，如3-羥基丁酸水平的升高表明脂肪酸氧化的增強［7］，檸檬酸、烏頭酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物［8］。黃連主要通過調(diào)節(jié)炎癥、氧化應激及能量代謝發(fā)揮作用，表現(xiàn)在主要影響谷氨酸、谷氨酰胺、?；撬?、N-乙酰糖蛋白等。如谷氨酸和谷氨酰胺是體內(nèi)重要抗氧化劑谷胱甘肽和?；撬岬那绑w，是代謝疾病發(fā)生過程中的重要氨基酸，其含量的下降表明高脂血癥中氧化應激的發(fā)生［9］。N-乙酰糖蛋白是炎癥標記物和急性期反應物蛋白，其水平的增高提示在高脂血癥發(fā)展過程中炎癥的發(fā)生［10］；田黃方組合對上述代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用強于單方組，進一步說明了該組方的合理性。

［1］黃曉晨，宿樹蘭，郭建明，等.代謝組學在中醫(yī)藥若干科學問題研究中的應用與思考［J］.中草藥，2014，45（2）：147.

［2］王瑩，禇揚，李偉，等.三七中皂苷成分及其藥理作用的研究進展［J］.中草藥，2015，46（9）：1381.

［3］王利紅，唐文照，辛義周.黃連中生物堿成分及藥理作用研究進展［J］.山東中醫(yī)藥大學學報，2015，39（4）：389.

［4］Li X Y，Hao H P，Wang G J，et al.Integrated pharmacokinetic study of multiple effective components contained in total Panax notoginsenoside［J］.Chin Nat Med，2008，6（5）：377．

［5］盛美萍，孫淇，王宏.鹽酸小檗堿在Beagle狗靜脈注射和口服藥動學研究［J］.中國藥理學通報，1993，9（1）：64

［6］郭姣，貝偉劍，唐春萍.復方貞術(shù)調(diào)脂方對飲食性高脂血癥大鼠肝脂酶的作用［J］.中藥材，2009，32（4）：582.

［7］Jiang C Y，Yang K M，Yang L，et al.A 1H NMR-based metabonomic investigation of time-related metabolic trajectories of the plasma，urine and liver extracts of hyperlipidemic hamsters ［J］.PLoS One，2013，8（6）：e66786.

［8］Zhao X，F(xiàn)ritsche J，Wang J，et al.Metabonomic fingerprints of fasting plasma and spot urine reveal human pre-diabetic metabolic traits［J］.Metabolomics，2010，6（3）：362.

［9］Brocker C，Thompson D C，Vasiliou V.The role of hyperosmotic stress in inflammation and disease［J］.Biomol Concepts，2012，3（4）：345.

［10］Oakes N D，Kjellstedt A，Thalén P，et al.Roles of fatty acid oversupply and impaired oxidation in lipid accumulationin tissues of obese rats［J］.J Lipids， 2013，2013：420754.

【責任編輯：黃玲】

Analysis of Compatibility Mechanism of Tianhuang Fang Based on
Metabonomics

LUO Duosheng1，2，LI Kunping1，RONG Xianglu1，2，GUO Jiao1，2

（1.Guangdong Metabolic Diseases Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Guangdong TCM Key Laboratory for Metabolic Diseases，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the effects of Tianhuang Fang，a prescription composed of Radix Notoginseng （Sanqi）and Rhizoma Coptidis（Huanglian），and its separated prescriptions on blood lipids and metabolic products，and to explore the compatibility rule of Tianhuang Fang in treating hyperlipidemia.Methods Thirty male SD rats were randomly divided into 5 groups，namely normal group，model group，Sanqi group，Huanglian group，and Tianhuang Fang group.Rat model of hyperlipidemia was established by intragastric administration of high-fat emulsion， and then the modeled rats were given corresponding medication respectively.After treatment for 4 weeks，serum samples were collected for the establishment of metabolism fingerprint by ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC/QTOF MS）.The differences of metabolism fingerprint in the above groups were studied by principal component analysis（PCA）and partial least squares-discriminant analysis（PLS-DA），and then biomarkers were screened by variable importance in the projection（VIP）and compared in various groups.Results Tianhuang Fang had an effect on regulating the fat metabolism，amino acid metabolism，inflammation，andoxidative stress of dietinduced hyperlipidemia rats，while Tianqi and Huanglian only improved some aspects of metabolic disorders to a certain degree.Conclusion Tianhuang Fang has better effect on the regulation of blood lipids and metabolites than Sanqi and Huanglian.Sanqi mainly regulates amino acid and energy metabolism，Huanglian plays a role in regulating inflammation，oxidative stress and energy metabolism，while Tianhuang Fang has an overall effect on the above metabolic disorders.

Tianhuang Fang；hyperlipidemia/TCD therapy；metabonomics；disease models，animal；rats

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0525-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.020

2016-02-29

羅朵生（1983-），女，助理研究員；E-mail：lds0901@163.com

郭姣，女，教授；E-mail：gyguoyz@163.com

國家自然科學基金青年項目（編號：81503313）；廣州市科技計劃項目（編號：1563000412）