過(guò)量表達(dá)枯草芽孢桿菌乙偶姻還原酶提高2,3-丁二醇產(chǎn)量

李秀鵬，楊套偉，徐美娟，張顯，饒志明（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫）

過(guò)量表達(dá)枯草芽孢桿菌乙偶姻還原酶提高2,3-丁二醇產(chǎn)量

李秀鵬1，楊套偉2，徐美娟3，張顯4，饒志明*
（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168是一株安全生產(chǎn)的菌株，但是在2，3-丁二醇（2，3-BD）的發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)積累較多的副產(chǎn)物乙偶姻（AC）。乙偶姻還原酶是催化AC合成2，3-BD的關(guān)鍵酶。為了提高2，3-BD合成效率，首先將乙偶姻還原酶基因acr克隆到B.subtilis 168，構(gòu)建了重組菌B.subtilis 168/pMA5-acr。對(duì)重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，相比出發(fā)菌，重組菌的2，3-BD產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高28.62%和22.87%，主要副產(chǎn)物AC積累量下降了20.01%。同時(shí)，分支路徑的副產(chǎn)物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸，也有不同程度的降低。

乙偶姻還原酶；2，3-丁二醇；乙偶姻；枯草芽孢桿菌

2，3-丁二醇（2，3-Butanediol，2，3-BD），化學(xué)式是CH3CHOHCHOHCH3，其結(jié)構(gòu)存在3種立體異構(gòu)體［1］，分別為L(zhǎng)-（+）-、D-（-）-和meso-構(gòu)型。作為一種重要的化工原料和液體燃料，2，3-BD被廣泛應(yīng)用于化工、能源、食品及航空航天等多個(gè)領(lǐng)域［2］。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的蓬勃發(fā)展和石油等不可再生資源的日益枯竭，2，3-BD逐漸受到世界的關(guān)注。由于2，3-BD結(jié)構(gòu)特殊［3］，利用化石原料生產(chǎn)2，3-BD成本高、條件苛刻、過(guò)程繁瑣，容易對(duì)環(huán)境造成污染，并且化石原料日益枯竭，因此化學(xué)合成法工業(yè)化生產(chǎn)較為困難。微生物轉(zhuǎn)化法是利用可再生資源生產(chǎn)2，3-BD，既克服了化學(xué)法生產(chǎn)的原料問(wèn)題，又符合綠色化工的要求，因此受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。通過(guò)代謝工程、合成生物學(xué)及其集成的方法改造微生物［4］，同時(shí)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件與分離純化工藝來(lái)降低環(huán)境污染與生產(chǎn)成本，對(duì)我國(guó)低碳經(jīng)濟(jì)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的建設(shè)，具有重要的促進(jìn)作用和潛在的經(jīng)濟(jì)效益［5］。早在1906年，Harden和Walpole［6］就研究了利用肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneμmoniae）發(fā)酵生產(chǎn)2，3-BD；1926年，Donker［7］提出了用多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）發(fā)酵生產(chǎn)2，3-BD；1933年，F(xiàn)ulmer等［8］提高了產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）生物合成2，3-BD的水平，并指出了其工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。2，3-BD高產(chǎn)菌株主要是克雷伯氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌［3，9-10］。然而，這些菌株都具有潛在致病性，不符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的要求。

作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168是一株安全生產(chǎn)2，3-BD的菌株，其代謝產(chǎn)生的2，3-BD主要以D-（-）-和meso-兩種構(gòu)型存在［1］?？莶菅挎邨U菌的2，3-BD合成途徑［1，11］如圖1所示，以糖類(lèi)為底物經(jīng)丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻（Acctoin，AC）并最終轉(zhuǎn)化為2，3-BD，此步反應(yīng)需要NADH的參與［5，9］，同時(shí)伴隨著有機(jī)酸的合成［12］。乙偶姻還原酶（Acctoin，reductase，ACR）作為一種雙功能酶可催化AC和2，3-BD之間的相互轉(zhuǎn)化［12］：在弱酸性的條件下，該酶以催化AC向2，3-BD轉(zhuǎn)化為主，過(guò)程中消耗NADH；弱堿性時(shí)，該酶則主要催化2，3-BD向AC逆向轉(zhuǎn)化，該過(guò)程生成NADH［13-14］。因此，有機(jī)酸副產(chǎn)物如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸的合成會(huì)與2，3-BD合成途徑競(jìng)爭(zhēng)碳源；另外，乳酸和琥珀酸的合成還會(huì)消耗NADH［1，11］，這可能會(huì)影響AC 向2，3-BD轉(zhuǎn)化的程度，從而造成AC的大量積累。

圖12　，3-丁二醇代謝路徑Fig.1　Metabolic pathway of 2，3-BD.E；acetoin reductase

以B.subtilis 168作為出發(fā)菌，克隆乙偶姻還原酶基因acr，構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/ pMA5-acr，并對(duì)其在弱酸性的條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，研究過(guò)量表達(dá)ACR對(duì)發(fā)酵過(guò)程中2，3-BD積累的影響，希望能達(dá)到2，3-BD提高、AC和相關(guān)有機(jī)酸減少的目標(biāo)，為工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種與質(zhì)粒

Bacillus subtilis 168由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏，表達(dá)載體pMA5亦由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2主要試劑與培養(yǎng)基

工具酶，購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、抗生素、咪唑，購(gòu)自上海Sangon公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺，購(gòu)自Ferments公司；NADH，NAD+，購(gòu)自Sigma Aldrich公司；PCR引物，由上海Sangon公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑。

活化培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；自然pH值。

種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖80，蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10；自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖140，酵母膏5，KH2PO46，K2HPO4·3H2O 14，尿素5，玉米漿20，檸檬酸鈉8；pH 6.5。

1.3主要試劑配制

A液（50 mmol/L磷酸氫二鈉溶液）：7.08 g Na2HPO4，加去離子水定容至1 L。

B液（50 mmol/L磷酸二氫鈉溶液）：5.99 g NaH2PO4，加去離子水定容至1 L。

磷酸鈉緩沖液（pH 6.5）：將A液和B液按照31.5∶68.5的體積比混勻。

PBS緩沖液（pH 7.0）：NaCl 8.0 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3.626 g/L，用濃鹽酸調(diào)至pH 7.0。

1.4乙偶姻還原酶基因acr克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI中枯草芽孢桿菌全基因組核酸序列acr的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，見(jiàn)表1，并在引物5′端分別加上BamH I和Mlu I酶切位點(diǎn)（下劃線）。

表1　文中所涉及的引物Table 1　Primers used in the study

提取B.subtilis 168的基因組作為模板，以Forawrd/Reverse引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因片段acr。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包含1 ng的質(zhì)粒模板，200 μmol/L dNTP，20 μmol/L引物和1 μL 的ExTaq DNA聚合酶。程序設(shè)定為95℃預(yù)變性5 min；循環(huán)擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性50 s，56℃退火90 s，72℃延伸90 s（根據(jù)實(shí)際情況，時(shí)間設(shè)定為1 kb/min），35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶經(jīng)分離后，用膠回收試劑盒（Takara）回收，回收的基因片段與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒命名為T(mén)-acr，DNA測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒T-acr，用BamH I和Mlu I雙酶切后連接到經(jīng)過(guò)相同酶切的pMA5上，構(gòu)建表達(dá)載體pMA5-acr。

1.5ACR在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

將構(gòu)建好的表達(dá)載體pMA5-acr轉(zhuǎn)化至B. subtilis 168中，在卡那霉素抗性平板上篩選陽(yáng)性重組子并進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組菌B. subtilis 168/pMA5-acr，接種至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h。發(fā)酵的菌液8 000 r/min離心10 min，用pH 7.0的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后離心后的細(xì)胞重懸浮于pH 7.0的PBS緩沖液中，用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞，10 000 r/min離心30 min沉淀細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液，置于-4℃保存，后續(xù)用于蛋白質(zhì)純化、SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)和ACR的酶活測(cè)定。

1.6酶的Ni-TNA純化

超聲破碎制得粗酶液后，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，采用Ni-NTA蛋白純化柱來(lái)純化目的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)兩次上樣，蛋白質(zhì)末端的6個(gè)His與Ni-NTA的金屬離子螯合。洗脫過(guò)程，首先用不含有咪唑的緩沖液洗柱，洗脫掉未與Ni-NTA結(jié)合的細(xì)胞體雜蛋白質(zhì)，然后用不同濃度的咪唑（20～300 mmol/L）緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，在一定的咪唑濃度條件下，可以得到較純的酶液。

1.7重組蛋白質(zhì)表達(dá)情況分析

利用SDS-PAGE分析重組菌的全細(xì)胞蛋白質(zhì)［15］，用5 g/dL的濃縮膠及12～15 g/dL分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，考馬斯亮蘭R-250染色；總蛋白質(zhì)濃度采用Brandford方法，以牛血清蛋白質(zhì)（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)［16］。

1.8ACR酶活力的測(cè)定

將20 μL粗酶液加入到酶活力測(cè)定緩沖體系，立即檢測(cè)340 nm處吸光值在3 min內(nèi)的變化。

乙偶姻還原酶活力測(cè)定緩沖體系：0.05 mol/L AC，5 mmol/L NAD+，磷酸鈉緩沖液pH 6.5。

總酶活力（U/mL）定義：每毫升粗酶液OD600 nm每分鐘消耗1 μmol/L NADH的酶量。

比酶活（U/g）定義：總酶活（U/mL）和粗酶液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（g/mL）的相除值。

1.9搖瓶發(fā)酵產(chǎn)2，3-BD實(shí)驗(yàn)

重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/pMA5-acr和出發(fā)菌株B.subtilis 168經(jīng)過(guò)LB液體培養(yǎng)基活化后，按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接至10 mL種子培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h后按照體積分?jǐn)?shù)4%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程跟蹤監(jiān)測(cè)菌體濃度、葡萄糖含量、相關(guān)有機(jī)酸含量、AC產(chǎn)量和2，3-BD產(chǎn)量。

1.10發(fā)酵參數(shù)分析方法

1）AC和2，3-BD含量測(cè)定：采用毛細(xì)管氣相色譜法檢測(cè)，儀器型號(hào)GC1600（JieDao TECH），色譜柱規(guī)格為柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.32 mm，液膜厚度0.50 μm；檢測(cè)條件為柱箱溫度160℃，進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣量0.2 μL，采用FID檢測(cè)器。

2）葡萄糖含量測(cè)定：采用SBA生物傳感器測(cè)定，發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取25 μL直接進(jìn)樣到生物傳感器中，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度、儀器讀數(shù)及發(fā)酵液稀釋倍數(shù)計(jì)算發(fā)酵液中葡萄糖的含量。

3）OD測(cè)定：取一定量的種子培養(yǎng)液或發(fā)酵液，以相應(yīng)的培養(yǎng)基作對(duì)照液，在600 nm處測(cè)定OD值。

4）有機(jī)酸產(chǎn)物含量測(cè)量：采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，流動(dòng)相為含有體積分?jǐn)?shù)5%甲醇的50 mmol/L的KH2PO4，體積流量為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，溫度為30℃。

2　結(jié)果與分析

2.1acr的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建

提取B.subtilis 168的基因組為模板，以Forawrd/Reverse引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到包含18 bp His編碼序列的基因片段，總長(zhǎng)1 041 bp，見(jiàn)圖2。

圖2　acr基因的PCR擴(kuò)增Fig.2　PCR amplification of acr gene

將目的基因片段，連接到經(jīng)BamH I和Mlu I酶切的pMA5上，構(gòu)建表達(dá)載體pMA5-acr，并且轉(zhuǎn)化至B.subtilis 168感受態(tài)中。獲得的重組表達(dá)載體pMA5-acr經(jīng)BamH I和Mlu I雙酶切驗(yàn)證（見(jiàn)圖3），得到約7 200 bp和1 040 bp大小的片段，剛好對(duì)應(yīng)線性化的pMA5和acr的大小，表明外源基因acr已經(jīng)正確連接到表達(dá)載體pMA5上。

2.2ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中的表達(dá)

將重組載體pMA5-acr轉(zhuǎn)化至B.subtilis 168，在卡那霉素抗性平板上篩選陽(yáng)性重組子，即得B. subtilis 168/pMA5-acr，將其接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集菌體并破碎，菌體用pH 7.0的PBS緩沖液懸浮，采用超聲波破碎細(xì)胞，將破碎上清液及其純化蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示，ACR的相對(duì)分子質(zhì)量約為39 kDa，與預(yù)期的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小相符，表明ACR在B. subtilis 168/pMA5-acr中成功獲得了表達(dá)。

圖3　重組質(zhì)粒pMA5-acr的酶切驗(yàn)證Fig.3　Identification of the recombinant plasmid pMA5-acr by enzyme digestion

圖4　ACR表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析Fig.4　SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ACR

2.3ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中的酶活力測(cè)定

分別測(cè)定重組菌和原始菌破碎上清液中ACR的酶活力，結(jié)果如表2所示，與原始菌株相比，重組菌中ACR的比酶活提高了3.48倍，表明ACR在B. subtilis 168里成功過(guò)量表達(dá)。

表2　B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr的ACR酶活Table 2　ACR enzyme activities of B.subtilis 168 and B. subtilis 168/pMA5-acr

2.4過(guò)量表達(dá)ACR對(duì)菌體生長(zhǎng)、糖耗和2，3-BD積累的影響

對(duì)B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，菌體量和葡萄糖變化曲線見(jiàn)圖5，AC和2，3-BD發(fā)酵曲線見(jiàn)圖6，發(fā)酵特征分析見(jiàn)表3。重組菌在前期的生長(zhǎng)速度較慢，發(fā)酵培養(yǎng)16 h后，菌體生長(zhǎng)速度加快，80 h達(dá)到最高菌體量?？赡艿脑蚴茿CR的過(guò)量表達(dá)，加重了菌體的負(fù)擔(dān)，前期生長(zhǎng)受到抑制。但是過(guò)量表達(dá)ACR后，對(duì)菌體生長(zhǎng)有害的分支路徑副產(chǎn)物有機(jī)酸等減少了，所以后半段的菌體長(zhǎng)勢(shì)較好，菌體量也比出發(fā)菌高，使得2，3-BD的合成具備良好的細(xì)胞基礎(chǔ)。

圖5　發(fā)酵過(guò)程中OD和糖耗曲線Fig.5　Curves of OD and Glucose during the fermentation

從圖5可以看到，重組菌的葡萄糖變化是一個(gè)前期下降平緩，中后期較為迅速的過(guò)程，而出發(fā)菌的糖耗曲線則較為均衡。這種現(xiàn)象表明，過(guò)量表達(dá)ACR，對(duì)菌體的生長(zhǎng)造成負(fù)擔(dān)。在前期，菌體生長(zhǎng)緩慢，對(duì)于碳源的消耗減少，葡萄糖質(zhì)量濃度下降較為平緩；而當(dāng)菌體進(jìn)入2，3-BD合成期后，對(duì)碳源的需求大大加強(qiáng)，發(fā)酵培養(yǎng)16 h，葡萄糖質(zhì)量濃度開(kāi)始較快減少。

圖6和表3顯示，發(fā)酵培養(yǎng)80 h，重組菌的2，3-BD的產(chǎn)量達(dá)到最大值33.08 g/L，比出發(fā)菌提高了28.62%；轉(zhuǎn)化率達(dá)37.56%，提高了22.87%；副產(chǎn)物AC 11.59 g/L，降低了20.01%；2，3-BD/AC比率為2.854，提高了60.79%。過(guò)量表達(dá)ACR，并且控制發(fā)酵條件在弱酸性，促進(jìn)了由AC到2，3-BD的轉(zhuǎn)化程度，成功地使主產(chǎn)物2，3-BD的產(chǎn)量提高，同時(shí)降低了副產(chǎn)物AC的積累。

圖6　發(fā)酵過(guò)程中AC和2，3-BD曲線Fig.6　Curves of AC and 2，3-BD during the fermentation

表3　發(fā)酵特征分析Table 3　Analysis of fermentation results

2.5過(guò)量表達(dá)ACR對(duì)有機(jī)酸積累的影響

對(duì)B.subtilis 168和B.subtilis 168/pMA5-acr兩株菌發(fā)酵液進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定分析，結(jié)果如表4所示，相比出發(fā)菌，重組菌株發(fā)酵液中副產(chǎn)物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸分別降低了15.21%、34.35%、35.39%、39.53%。ACR的活力和NADH的含量是2，3-BD合成的兩個(gè)重要因素，過(guò)量表達(dá)ACR，促進(jìn)了從AC到2，3-BD的合成效率。獲得了更多2，3-BD就意味著有更多的NADH參與了AC向2，3-BD的轉(zhuǎn)化，也就是說(shuō)該過(guò)程需要消耗更多的NADH，而用于需要NADH參與的其他有機(jī)酸副產(chǎn)物的NADH的量會(huì)相應(yīng)減少，這可能是相關(guān)支路的有機(jī)酸積累量減少的原因所在。

表4　ACR過(guò)量表達(dá)對(duì)發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸質(zhì)量濃度的影響Table 4　Effects of overexpressing ACR on organic acidsin fermentation

3　結(jié)語(yǔ)

以安全菌株B.subtilis 168為出發(fā)菌，克隆其乙偶姻還原酶基因acr，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-acr，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入B.subtilis 168，構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌B.subtilis 168/pMA5-acr。測(cè)定了重組菌ACR的酶活，并在弱酸性條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明，ACR在B.subtilis 168/pMA5-acr中實(shí)現(xiàn)了過(guò)量表達(dá)，主產(chǎn)物2，3-BD的產(chǎn)量得到提高，而副產(chǎn)物AC和相關(guān)有機(jī)酸的積累量則不同程度下降。2，3-BD高產(chǎn)菌株主要是克雷伯氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌［3，9-10］，然而這些菌株都具有潛在致病性，不符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的要求。而枯草芽孢桿菌有長(zhǎng)期制備發(fā)酵食品的歷史，不產(chǎn)內(nèi)毒素和致熱敏蛋白質(zhì)，是一種公認(rèn)安全的微生物，無(wú)論是作為出發(fā)菌還是宿主菌都具有很強(qiáng)可行性［17］。過(guò)量表達(dá)ACR和適當(dāng)控制發(fā)酵pH，增強(qiáng)了合成2，3-BD的碳源通量，消耗了更多的輔酶NADH。相應(yīng)地，AC和需要NADH參與的相關(guān)有機(jī)酸合成所需的碳源流量和NADH則會(huì)減少，因而成功地實(shí)現(xiàn)了主產(chǎn)物2，3-BD產(chǎn)量提高和相關(guān)副產(chǎn)物產(chǎn)量減少的目標(biāo)。雖然重組菌產(chǎn)2，3-BD的產(chǎn)量和國(guó)內(nèi)外最高產(chǎn)量還有一定的差距［1］，但是相信通過(guò)進(jìn)一步的分子改造和發(fā)酵條件優(yōu)化，一定能實(shí)現(xiàn)微生物法高效安全生產(chǎn)2，3-BD的目標(biāo)。

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Improved 2,3-Butanediol Production by Overexpressing Acetoin Reductase in Bacillus subtilis 168

LI Xiupeng1，YANG Taowei2，XU Meijuan3，ZHANG Xian4，RAO Zhiming*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Bacillus subtilis 168 is a safe strain for industrial-scale microbial production of 2，3-butanediol（2，3-BD）.However，a large quantity of by-product of acetoin（AC）is accumulated during 2，3-BD fermentation process.Acetoin reductase（ACR）is the key enzyme which catalyzes the conversion of acetoin to 2，3-BD.In this study，in order to improve 2，3-BD production，we firstly cloned the acr gene of acetoin reductase into B.subtilis 168，and then further constructed the recombinant strain B.subtilis 168/pMA5-acr.The results showed that the yield and conversion rate of the 2，3-BD were increased up to 28.62%and 22.87%by the recombinant strain，respectively. Whereas the accumulation of the main by-product of acetoin decreased by 20.01%.Furthermore，the molar yields of by-products of formic acid，acetic acid，lactic acid，and succinate were also decreased.

Acetoin reductase，2，3-Butanediol，Acetoin，B.subtilis 168

Q 78

A

1673—1689（2016）03—0252—06

2014-11-26

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB725202）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400082，21276110）；教育部重點(diǎn)科研項(xiàng)目（113033A）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助和111引智工程項(xiàng)目（111-2-06）。

饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物育種和發(fā)酵代謝方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn