6種常用低聚糖對嗜熱鏈球菌體外生長的影響

夏曉風(fēng)，王虎飛，吳曉玉*（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江西南昌330045）

6種常用低聚糖對嗜熱鏈球菌體外生長的影響

夏曉風(fēng)1，2，王虎飛1，2，吳曉玉*1，2
（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045；2.南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江西南昌330045）

為使低聚糖和嗜熱鏈球菌在生產(chǎn)中能合理配伍使用，并為益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，采用6種常用低聚糖分別替代M17培養(yǎng)基中部分或全部乳糖組分，以及添加不同濃度低聚糖到M17作為發(fā)酵培養(yǎng)基這兩種方法，研究6種低聚糖對嗜熱鏈球菌生長以及產(chǎn)酸性能的影響。結(jié)果表明，6種低聚糖替代乳糖可造成嗜熱鏈球菌生長能力下降甚至停止生長，而在乳糖存在的情況下，添加低聚糖有利于菌株的生長及產(chǎn)酸。

低聚糖；嗜熱鏈球菌；生長；乳酸；高效液相色譜

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌的一種，是僅次于乳酸乳球菌的第二大重要的商業(yè)菌種［1］。它屬于化能異養(yǎng)型微生物，不能合成多種有機化合物，必須從外界吸收多種小分子營養(yǎng)物質(zhì)才能較好實現(xiàn)自身的新陳代謝。S.thermophilus之所以成為重要的商業(yè)菌種在于其發(fā)酵產(chǎn)生大量的有機酸（如乳酸、甲酸、乙酸）、醇、醛、酮和氨基酸等代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)相互作用形成了發(fā)酵產(chǎn)品特有的風(fēng)味［2-5］，是主要的乳品發(fā)酵劑之一。S. thermophilus以單一或復(fù)合制劑用于青貯飼料時，可以提高畜禽對飼料的利用率，促進畜禽生長，降低畜禽死亡率［6-7］。該菌可大量產(chǎn)生乳酸等有機酸，降低腸道pH，抑制病原菌和腸內(nèi)腐敗菌的生長，激活宿主的巨噬細胞和免疫細胞，同時顯著降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量［8］。另外，嗜熱鏈球菌具有β-乳糖酶，能緩解乳糖不耐受性，具有部分抑制腫瘤的能力［3］。

研究表明，功能性低聚糖具有多種生理功能，可通過促進腸道益生菌的生長和抑制病原菌的生長來調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，降低血脂血壓和血清膽固醇，促進營養(yǎng)物質(zhì)（如礦物質(zhì)）的消化吸收，增強機體免疫功能等［9］。低聚糖同時具有用量小、增殖效果顯著等特性，故少許添加量就能達到良好的生理功能。目前廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品，以及飼料工業(yè)［10-11］。雖然低聚糖和嗜熱鏈球菌對人體和動物均具有明顯的益生作用，但至目前，就6種常用低聚糖對嗜熱鏈球菌生長影響的研究少有報道。因此，本文擬闡述6種常用低聚糖對嗜熱鏈球菌生長的影響，以期為低聚糖和嗜熱鏈球菌在生產(chǎn)中的配伍使用以及益生菌產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種Streptococcus thermophilus（嗜熱鏈球菌），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.26種低聚糖種類低聚異麥芽糖（質(zhì)量分數(shù)99%）、低聚果糖（質(zhì)量分數(shù)99%）、低聚乳糖（質(zhì)量分數(shù)95%）、低聚半乳糖（質(zhì)量分數(shù)99%）、低聚木糖（質(zhì)量分數(shù)99%）和乳酮糖（質(zhì)量分數(shù)99%），購自河南金源生物科技有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基M17培養(yǎng)基（改良培養(yǎng)基，g/L）：胰蛋白胨5，魚蛋白胨5，牛肉膏5，酵母浸膏2.5，抗壞血酸0.5，硫酸鎂0.25，甘油10，磷酸二氫鉀5，乳糖3；pH 7.0。詳見文獻［12］。

1.2方法

1.2.1菌種母液的制備取5支處于對數(shù)生長期的嗜熱鏈球菌斜面，用M17培養(yǎng)基洗下，調(diào)節(jié)A600= 1.000±0.050，待用。

1.2.2低聚糖替代M17培養(yǎng)基的乳糖對S. thermophilus生長影響的測定低聚糖分別按照25%、50%、100%的替換量部分或完全替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的乳糖，制成替代培養(yǎng)基A1。取菌種母液（A600=1.000±0.05）按體積分數(shù)1%的接種量接種于培養(yǎng)基A1，42℃靜置培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)4、12、24、36、48 h菌液，測定各菌液中嗜熱鏈球菌A600值和pH值，每個處理設(shè)3個重復(fù)，并以接種于M17培養(yǎng)基和接種于不含乳糖組分的M17培養(yǎng)基的菌液為對照組。

1.2.3M17培養(yǎng)基中添加低聚糖對S.thermophilus生長影響的測定低聚糖按照0.05、0.1、0.25 g/dL 和0.5 g/dL 4種不同質(zhì)量濃度添加到M17培養(yǎng)基中，制成添加培養(yǎng)基A2。取菌種母液（A600=1.000± 0.05）按體積分數(shù)1%的接種量接種于培養(yǎng)基A2，42℃靜置培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)4、12、24、36、48 h菌液，測定各菌液中嗜熱鏈球菌A600值和pH值，每個處理設(shè)3個重復(fù)，并以接種于M17培養(yǎng)基的為對照組。

1.2.4高效液相色譜法測定菌液中乳酸和乙酸含量菌液前處理：取由實驗1.2.2和1.2.3確定的對嗜熱鏈球菌生長促進作用較好的最適低聚糖添加量，42℃靜置培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)0、4、12、24、36、48 h的菌液，離心，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾兩次，稀釋2.5倍，待測。色譜條件：色譜柱Aminex Hpx-87H柱，流動相0.002 mol/L H2SO4，體積流量0.6 mL/min，柱溫35℃，檢測波長210 nm，進樣量15 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1低聚糖替代M17培養(yǎng)基的乳糖組分對S. thermophilus生長的影響

由圖2可知，路徑3，即深圳港-江門水上“巴士”，具有不可替代的優(yōu)勢.相比路徑1在運輸成本、時間和服務(wù)水平上均占有絕對優(yōu)勢，這主要因為江門新會與深圳港的水上距離更近，且深圳港可為貨主提供更好的服務(wù).雖然路徑3的運輸成本高于路徑2，但其規(guī)模運輸避免了多次往返，節(jié)約了運輸時間使得經(jīng)濟性較好.故深圳港-江門新會水上“巴士”的優(yōu)勢明顯，短時間內(nèi)不會貨源流失.

2.1.16種低聚糖對S.thermophilus生長量的影響按照1.2.2研究低聚糖替代M17培養(yǎng)基的乳糖對S. thermophilus生長的影響，結(jié)果如圖1所示：6種低聚糖部分或完全取代乳糖時，S.thermophiluss的生長量均有不同程度的降低，且均隨著低聚糖替代乳糖比例的增大，生長量降低的幅度越大。其中低聚乳糖完全替代乳糖（100%替代乳糖）時，該菌生長量在整個生長過程中（0～48 h）沒有變化，說明其生長被抑制，而低聚果糖、低聚半乳糖與低聚木糖完全替代乳糖時，生長量變化遲緩，菌株生長緩慢。無糖組嗜熱鏈球菌在整個培養(yǎng)過程中完全不生長。

圖1　6種低聚糖對嗜熱鏈球菌菌液A600值的影響（替代實驗）Fig.1　Effects of six oligosaccharides on growth of S. thermophiluss（replacement test）

2.1.2低聚糖替代M17培養(yǎng)基乳糖組分對S. thermophiluss發(fā)酵液pH值的影響按照1.2.2測定培養(yǎng)0、4、12、24、36、48 h菌液的pH值，設(shè)置M17培養(yǎng)基的發(fā)酵液為對照組，見圖2。結(jié)果表明，低聚糖替代乳糖的比例越大，隨培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液pH下降幅度越小；尤其低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚果糖以及低聚木糖在完全替代乳糖時，與初始pH值比較，培養(yǎng)48 h后pH下降幅度不明顯。圖2顯示，發(fā)酵液pH值均在培養(yǎng)12 h時有一個轉(zhuǎn)折點。培養(yǎng)0～12 h時，pH值下降幅度較大，12 h以后下降幅度減緩，pH值變化不明顯。與圖1相比較，發(fā)酵液pH值的變化規(guī)律與菌量的變化規(guī)律存在相關(guān)性，表明菌量大小影響發(fā)酵液產(chǎn)酸量，從而影響pH值的變化。無糖組嗜熱鏈球菌發(fā)酵液pH在整個培養(yǎng)過程中與初始pH相比幾乎無變化。

圖2　6種低聚糖對嗜熱鏈球菌菌液pH的影響（替代實驗）Fig.2　Effects of six oligosaccharides on solution pH of S. thermophiluss（replacement test）

2.2M17培養(yǎng)基中添加低聚糖對S.thermophilus生長的影響

2.2.1低聚糖不同添加量對S.thermophilus生長量的影響按照1.2.3，M17培養(yǎng)基中添加低聚糖對S.thermophilus生長的影響如圖3所示，結(jié)果表明，6種低聚糖作為添加因子按照不同質(zhì)量濃度添加到M17培養(yǎng)基時，S.thermophilus的生長量均有不同程度的增加。其中，與對照組相比，低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖和乳酮糖的添加量為0.5 g/dL時，S.thermophilus的生長量增加幅度最大。而低聚乳糖和低聚木糖則分別在0～0.1 g/dL和0～0.25 g/dL內(nèi)隨著添加量的增大，S.thermophilus的生長量增大，超過這個范圍則生長遲緩。低聚乳糖最佳添加量為0.1 g/dL，低聚木糖為0.25 g/dL。

圖3　6種低聚糖對嗜熱鏈球菌菌液A600值的影響（添加實驗）Fig.3　Effects of six oligosaccharides on growth of S. thermophiluss（adding test）

2.2.2低聚糖不同添加量對發(fā)酵液pH值的影響按照1.2.3測定培養(yǎng)0、4、12、24、36、48 h菌液的pH值，設(shè)置M17培養(yǎng)基的發(fā)酵液為對照組，見圖4。結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組隨著培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液pH下降幅度增大。當?shù)途郛慃溠刻?、低聚果糖、低聚半乳糖和乳酮糖的添加量?.5 g/dL時，S.thermophilus的發(fā)酵液pH與初始pH相比有較大幅度下降。而低聚乳糖和低聚木糖則分別在0～0.1 g/dL和0～0.25 g/dL范圍內(nèi)隨著添加量的增大，發(fā)酵液pH下降，這與圖3菌量的變化規(guī)律一致。由圖4可以看出，培養(yǎng)12 h以后pH變化不明顯。

圖4　6種低聚糖對嗜熱鏈球菌菌液pH的影響（添加實驗）Fig.4　Effects of six oligosaccharides on solution pH of S. thermophiluss（adding test）

2.3添加低聚異麥芽糖和乳酮糖對發(fā)酵液乳酸和乙酸生成量的影響

在M17培養(yǎng)基中添加低聚異麥芽糖和乳酮糖后，菌株產(chǎn)乳酸和乙酸的能力均較對照組有不同程度的提高。其中添加低聚異麥芽糖的發(fā)酵液乳酸和乙酸含量高于添加乳酮糖的。菌株產(chǎn)乳酸水平在0～12 h內(nèi)呈直線上升，培養(yǎng)12 h達最大值，以后趨于穩(wěn)定；而乙酸含量則在0～36 h時呈上升趨勢，36 h達最大值，之后，乙酸含量不斷下降；且3個處理組均顯示乙酸含量遠低于乳酸含量，說明菌株主要通過同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵液pH值下降。將圖5（a）與菌株生長量的增長及發(fā)酵液pH值變化趨勢（圖3（e）（f）；圖4（e）（f））相比較，其變化趨勢相似度極高，均在12 h達到最大值，以后趨于穩(wěn)定。推測菌株生長量的提高，造成發(fā)酵產(chǎn)乳酸總體能力增強，造成發(fā)酵液pH值下降。

圖5　不同培養(yǎng)時間發(fā)酵液中乳酸和乙酸產(chǎn)量變化Fig.5　Changes of lactic acid and acetic acid content in the fermented solution within different culture time

圖6　嗜熱鏈球菌培養(yǎng)12 h發(fā)酵液的乳酸和乙酸色譜圖Fig.6　Chromatogram of lactic acid and acetic acid from broth fermented for 12 h by S.thermophilus

3　討論

低聚糖又稱寡糖，是由2～10個相同的或不同的單糖單位通過糖苷鍵聚合而成的直鏈或分支的一類低度聚合糖，其相對分子質(zhì)量約為300～2 000，分為普通低聚糖和功能性低聚糖兩大類［14-16］。普通低聚糖（如蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖、乳糖等）可以被機體消化吸收［17-18］。功能性低聚糖［19］（如水蘇糖、棉子糖、異麥芽酮糖、乳酮糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚異麥芽糖和低聚異麥芽酮糖等）因在動物胃腸道沒有水解這些糖類（除異麥芽酮糖之外）的酶系統(tǒng)，不被消化吸收而直接為益生菌所利用，因此可以作為益生菌的增殖因子［9，18，20-21］。

本課題的替代實驗結(jié)果顯示，當M17培養(yǎng)基中不含乳糖成分時，嗜熱鏈球菌生長量及pH值變化趨于零，說明盡管培養(yǎng)基中存在其他可用碳源物質(zhì)，但該菌株在無乳糖條件下幾乎不生長。當6種低聚糖（低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚乳糖、低聚半乳糖、低聚木糖和乳酮糖）以不同比率替代乳糖作為碳源時，隨著替代量的增大，嗜熱鏈球菌的生長量降低、產(chǎn)酸能力減弱，且均低于乳糖為碳源時；當完全替代乳糖，替代糖為低聚乳糖、低聚半乳糖以及低聚木糖時，菌株幾乎不生長或生長極其緩慢。表明以上述6種低聚糖為碳源，不利于S. thermophilus的生長與產(chǎn)酸。由添加實驗可以看出，6種低聚糖中低乳酮糖作為促生因子，可以有效促進嗜熱鏈球菌的生長、增強產(chǎn)酸能力；其次為低聚異麥芽糖、低聚半乳糖及低聚果糖，而低聚木糖、低聚乳糖的促生長作用效果不明顯。通過高效液相色譜測定發(fā)酵液中乳酸和乙酸含量進一步證實：伴隨S. thermophilus生長量增加，其產(chǎn)乳酸能力提高，引起發(fā)酵液pH值下降，且發(fā)酵液乳酸含量在菌量達到最大值（發(fā)酵培養(yǎng)12 h）時也同時達到最大值并趨于穩(wěn)定。

據(jù)資料顯示，大部分S.thermophilus菌株沒有分解淀粉和大分子碳水化合物的酶系，不能利用大分子物質(zhì)作碳源，僅能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖等單糖和一些寡糖為碳源［4，22］。其中乳糖作為碳源生長率最高，其次為蔗糖，再次為葡萄糖與果糖，且菌株生長率低至易被代謝的乳糖、蔗糖的數(shù)分之一［23-24］。菌株在對糖類的吸收利用過程中，磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system，簡稱PTS）是乳酸菌及其他細菌的主要糖吸收系統(tǒng)。但對于S. thermophilus，蔗糖和果糖是唯一可以由PTS吸收利用的糖［25-26］。乳糖則通過專用滲透酶LacS（Lactose/ H+同向轉(zhuǎn)移或lactose/galactosetang交換）被吸收利用［27］。

4　結(jié)語

根據(jù)本課題的實驗結(jié)果，6種低聚糖替代乳糖作為碳源，不利于S.thermophilus的生長與產(chǎn)酸，而在培養(yǎng)基中添加少量低聚糖（0.05～0.5 g/dL），如乳酮糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖等，對其生長與產(chǎn)酸有明顯或少量促進作用，推測該特性與S. thermophilus吸收、轉(zhuǎn)化、利用低聚糖的能力有關(guān)，其受制于低聚糖的結(jié)構(gòu)特征。有關(guān)低聚糖結(jié)構(gòu)與S. thermophilus吸收利用的關(guān)系，有待進一步深入研究。

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Effects of Six Commonly Used Oligosaccharides on the Growth of Streptococcus thermophilus in vitro

XIA Xiaofeng1，2，WANG Hufei1，2，WU Xiaoyu*1，2
（1.School of Bioscience and Bioengineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Nanchang Key Laboratory of Fermentation Application Technology，Nanchang 330045，China）

The effect of six oligosaccharides on the growth of Streptococcus thermophilus and its capability of lactic acid production was investigated by two methods to provide a theoretical basis for the realization of the compatibility use of oligosaccharides and Streptococcus thermophilus for industry production and probiotic products development.One way is to partly or completely replace the lactose composition of M17 culture medium by six commonly used oligosaccharides.Another way is to add six oligosaccharides with various concentrations into M17 culture medium.Six oligosaccharides have been proved to cause a reduction in the growth of Streptococcus thermophilus or even cause growth stop if oligosaccharides completely replaced lactose，while the addition of oligosaccharides was conducive to the growth of Streptococcus thermophilus with the presence of lactose.

oligosaccharide，Streptococcus thermophilus，growth，lactic acid，HPLC

TS 24；TS 201

A

1673—1689（2016）03—0310—08

2014-11-25

農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室開放基金項目（粵農(nóng)科蠶加字【2012】9號）。

吳曉玉（1966—），女，江西南昌人，工學(xué)博士，教授，主要從事微生物開發(fā)利用研究。E-mail：xywu166@163.com