黃酒釀造過程中真菌群落組成及揮發(fā)性風(fēng)味分析

牟穰，毛健*，3，孟祥勇，3，劉蕓雅（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000）

黃酒釀造過程中真菌群落組成及揮發(fā)性風(fēng)味分析

牟穰1，2，毛健*1，2，3，孟祥勇1，2，3，劉蕓雅1，2
（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；3.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興312000）

利用宏基因組學(xué)技術(shù)對不同發(fā)酵時(shí)期黃酒醪液中的真菌進(jìn)行鑒定，并利用GC-MS分析黃酒中的主要高級醇、醛類和酯類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。結(jié)果表明：黃酒前酵階段真菌有著較高的群落多樣性，在發(fā)酵排料當(dāng)天鑒定出22種真核屬類；其中曲霉屬（Aspergillus）在整個(gè)發(fā)酵過程相對豐度均達(dá)到90%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它真菌，是黃酒發(fā)酵過程中的特征微生物；隨著黃酒發(fā)酵的進(jìn)行，優(yōu)勢真菌呈現(xiàn)先降低后增加趨勢。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的生成受發(fā)酵液性質(zhì)影響較大，大部分在第4天有著較高的含量，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液的較高酸度和酒精度以及低pH降低了微生物的多樣性，使得揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量有所降低。關(guān)鍵詞：麥曲；發(fā)酵醪液；真菌；多樣性；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

黃酒是我國特有的民族特產(chǎn)，在中國已有數(shù)千年的歷史，它主要以谷物（稻米、小米、黍米、玉米等）為原料，加入麥曲、酵母等進(jìn)行發(fā)酵而成。由于原料、地理環(huán)境和釀造工藝的不同，不同區(qū)域的黃酒均呈現(xiàn)出獨(dú)特的風(fēng)味和口感，按照黃酒風(fēng)格分為傳統(tǒng)型黃酒、清爽型黃酒和特型黃酒［1］。黃酒發(fā)酵過程中存在著復(fù)雜的微生物群落，包括細(xì)菌以及霉菌、酵母菌等真菌。它們不僅能夠產(chǎn)各種酶類，降解大分子物質(zhì)，還能夠促進(jìn)黃酒風(fēng)味物質(zhì)的代謝合成，包括有機(jī)酸、游離氨基酸、酯類等，賦予了黃酒豐富的營養(yǎng)成分和獨(dú)特的風(fēng)味特征［2-3］。

微生物是黃酒釀造過程中必不可少的組成成分，對微生物群落的解析有助于了解黃酒發(fā)酵機(jī)理。目前對黃酒微生物的分析大多采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但這種方法存在弊端，如采用分離、純化、分子鑒定步驟，需經(jīng)過一系列繁雜的形態(tài)特征和生理生化試驗(yàn)［4-5］。同時(shí)利用培養(yǎng)基方法僅能夠篩選出少量微生物，大部分微生物因不能培養(yǎng)而遺漏，造成檢測的微生物群落結(jié)構(gòu)不準(zhǔn)確。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員使用非純培養(yǎng)的方法和手段對環(huán)境微生物進(jìn)行全面分析，如16SrRNA克隆建庫［6］、條形碼測序［7］以及基因芯片［8］等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性的研究。高通量測序（High throughput sequencing，HTS）是一種全新的測序技術(shù)，它能一次進(jìn)行多個(gè)樣品測定，還能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，給研究提供了方便［9］。通量高、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)，使得該方法一經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于各種生態(tài)系統(tǒng)中，比如土壤［10］、草魚腸道［11］、海洋沉積物［12］等生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性的檢測和研究中。近年來，HTS也逐漸應(yīng)用到傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性研究，如泡菜［13］、干酪［14］、白酒［15］、豆瓣醬［16］等發(fā)酵食品，而應(yīng)用于黃酒中的真菌研究還未見報(bào)道。

已發(fā)表的有關(guān)黃酒微生物的研究主要針對細(xì)菌，對于發(fā)酵液中的真菌研究較少。然而，真菌在黃酒釀造過程中能產(chǎn)生大量酶類，對黃酒發(fā)酵起到十分重要的作用。為探明發(fā)酵過程中發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)及理化指標(biāo)的代謝規(guī)律，解析黃酒麥曲及發(fā)酵醪液中真菌的群落結(jié)構(gòu)，采用宏基因組學(xué)對海派清爽型黃酒（上海金楓黃酒）釀造用麥曲和發(fā)酵過程中的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，同時(shí)對發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)及理化指標(biāo)進(jìn)行測定，旨在為解析黃酒釀造過程提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)樣品

黃酒發(fā)酵醪液，取自上海金楓酒業(yè)股份有限公司，樣品發(fā)酵天數(shù)分別為0、2、4、6、9、12、18 d和24 d，0 d表示投料當(dāng)天；黃酒生麥曲，取自企業(yè)麥曲倉庫，為2014年生產(chǎn)。所有樣品當(dāng)天采集完后放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2樣品宏基因組DNA提取

稱取不同天數(shù)發(fā)酵醪液和麥曲樣各1 g，采用玻璃珠破碎法對樣品進(jìn)行破碎處理，用Soil DNA kit試劑盒（OMEGA，Bio-Tek，USA）對樣品進(jìn)行宏基因組DNA提取，提取方法按說明書進(jìn)行。

1.3目的區(qū)段擴(kuò)增及高通量測序

擴(kuò)增選取真菌18S rRNA基因中的ITS1F-ITS2區(qū)段作為擴(kuò)增對象，采用引物ITS1F：CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA和2043R：GCTGCGTTCTTCATC GATGC進(jìn)行擴(kuò)增［17-18］。此外，用于PCR擴(kuò)增的正向引物前加入一段由7個(gè)堿基構(gòu)成的barcode序列，所有樣品分別用不同barcode序列進(jìn)行區(qū)分，具體擴(kuò)增體系及程序如下。

1.3.1PCR反應(yīng)體系PCR試驗(yàn)采用Trans Gen AP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase （Trans Gen Biotech，China）；共20 μL的反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物各（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，模板DNA 10 ng，剩余的用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

1.3.2PCR擴(kuò)增程序PCR儀采用ABI Gene Amp○R 9700（Applied Biosystems，USA），其反應(yīng)參數(shù)為：1）1×（95℃3 min）；2）30×（95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s）；3）72℃延伸10 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)2 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina雙末端測序分析。

1.4黃酒發(fā)酵醪液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

采用頂空固相微萃取技術(shù)（HS-SPME）與GCMS相結(jié)合測定黃酒發(fā)酵醪液中的揮發(fā)性物質(zhì)。

1.4.1HS-SPME條件取4 mL稀釋后的黃酒發(fā)酵液，加入到20 mL的頂空瓶中，加1.0 g NaCl和20 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，質(zhì)量濃度為8 800 μg/L），使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，50℃預(yù)熱15 min，萃取吸附40 min，250℃解吸7 min，用于GC-MS分析。

1.4.2 GC條件色譜柱TG-WAXMS（30 m×0.25 μm× 0.25 mm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），不分流，體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫，起始溫度40℃，保持3 min，以6℃/min的速率升溫至100℃，然后以10℃/min升溫至230℃，保持7 min。

1.4.3MS條件離子化方式EI；發(fā)射電流50 μA；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；傳輸線溫度250℃；掃描質(zhì)量范圍33～400 u。

1.4.4物質(zhì)的定性分析未知化合物的質(zhì)譜通過與NIST05a.L Database（Agilent Technologies Inc）進(jìn)行比對，并通過計(jì)算保留指數(shù)（RI）和查閱已經(jīng)報(bào)道文獻(xiàn)中相應(yīng)物質(zhì)RI確認(rèn)。物質(zhì)的定量分析采用半定量分析。

1.5黃酒醪液理化指標(biāo)測定

黃酒醪液中氨基酸態(tài)氮、總酸及pH測定方法參照與黃酒相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)［1］。

1.6數(shù)據(jù)分析

用Mothur軟件包以97%為劃定閾值對序列劃分操作分類單元（OTU）；利用得出的OTU結(jié)果計(jì)算樣品中微生物的α-多樣性，包括Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等。此外，為盡量減少錯(cuò)誤測序，確保測序質(zhì)量，在測序前需要將各序列的引物和barcode去掉，并對序列長度進(jìn)行篩選［12］。刪掉長度小于50 bp的序列，以及含有其他不明確的堿基（如N）和含有同聚體的區(qū)段（重復(fù)次數(shù)大于6）。試驗(yàn)結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式。

2　結(jié)果與分析

2.1宏基因組DNA提取

采用玻璃珠破碎法對樣品進(jìn)行破碎處理后，提取樣品中微生物的宏基因組，用1 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。

圖1　黃酒發(fā)酵醪液及麥曲微生物宏基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1　Agarose gel electrophoresis of metagenomic DNA extracted from ferment mash and wheat koji

從圖1可以看出，玻璃珠破碎細(xì)胞提取宏基因組DNA時(shí)產(chǎn)生了很多不同大小的片段，造成電泳時(shí)的彌散拖尾現(xiàn)象。但在靠近圖譜上方有著較為清晰的目的條帶，幾乎能保持在同一水平，說明樣品中目的DNA被提取出，可以進(jìn)行下一步的切膠回收實(shí)驗(yàn)。從圖譜中還可以看出，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，亮度有所降低，這說明微生物多樣性隨著發(fā)酵的進(jìn)行而降低。

2.2序列及α-多樣性分析

對不同發(fā)酵期的麥曲（9個(gè)樣品）進(jìn)行測序后共獲得179 330條序列，平均每個(gè)樣品獲得19 926條序列。樣品的多樣性指數(shù)結(jié)果見表1。

從表1可以看出，麥曲的Shannon指數(shù)最高，達(dá)到1.42，是發(fā)酵投料當(dāng)時(shí)的4.5倍，是發(fā)酵第24天時(shí)的35.5倍；從Simpson指數(shù)來看，發(fā)酵液樣品均達(dá)到0.9以上，而麥曲僅為0.4，表明麥曲中的微生物多樣性要高于發(fā)酵期間醪液中的微生物多樣性。同時(shí)從Coverage指數(shù)來看，每個(gè)樣品的數(shù)值均達(dá)到0.999以上，說明利用HTS技術(shù)對麥曲及發(fā)酵液進(jìn)行高通量測序得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

從表1中OTU數(shù)量可以看出，黃酒麥曲及投料當(dāng)天的發(fā)酵液中真菌多樣性較為復(fù)雜，分別達(dá)到39種和33種，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵醪液中微生物種類呈遞減趨勢，微生物多樣性越來越低，發(fā)酵醪液中真核群落變得更加簡單。這是由于真菌大部分都是好氧菌，貯存期間麥曲與空氣充分接觸，同時(shí)麥曲中含有充足的營養(yǎng)物質(zhì)，使麥曲中的微生物能夠充分生長，因此顯示出較高的微生物多樣性。

表1　樣品多樣性指數(shù)Table 1　Alpha-diversity of samples

在黃酒發(fā)酵啟動后，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，以及發(fā)酵產(chǎn)生的CO2使得微生物處于缺氧的環(huán)境，同時(shí)發(fā)酵液中微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物改變了發(fā)酵醪液的理化特性，如pH降低、酒精度升高等，這些都對真菌生長產(chǎn)生抑制作用，從而降低了真菌的多樣性。

2.3發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)

對黃酒麥曲、前酵開始階段（0、2 d）和后酵開始階段（6 d）發(fā)酵液中的真菌群落組成進(jìn)行鑒定分析（表2）。結(jié)果表明，在黃酒麥曲中一共鑒定出16種不同的真核屬類，其中相對豐度大于1.00%的有5種，分別為曲霉屬（Aspergillus，72.55%），鏈格孢屬（Alternaria，6.00%），嗜熱真菌屬（Thermomyces，2.37%），鐮刀菌屬（Fusarium，1.69%）和附球菌屬（Epicoccum，1.43%）。而前酵開始階段鑒定出22種不同的真菌屬類，數(shù)量上相對于麥曲增加了6種。這是由于黃酒投料時(shí)真菌不僅由麥曲帶入，加入的米漿水、酒母和釀造器具等也會帶入其他微生物，同時(shí)由于發(fā)酵初期氧含量比較充足，微生物所處的環(huán)境較為適宜，醪液的理化特性還沒有發(fā)生很大改變，對真菌生長的抑制作用并不明顯，此時(shí)發(fā)酵醪液中的微生物多樣性相對復(fù)雜。

2.4優(yōu)勢真菌屬變化情況分析

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，優(yōu)勢真菌呈現(xiàn)先減少后稍有上升的變化趨勢，特別是第2天的真核群落多樣性在整個(gè)發(fā)酵階段是最低的，真核數(shù)量急劇下降到4種（圖2所示）。當(dāng)黃酒發(fā)酵啟動后，微生物開始發(fā)酵并釋放代謝產(chǎn)物，其中有些物質(zhì)是對微生物生長有害的，如酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的酒精對自身和其他真菌有著很大的毒害作用，抑制了真菌的生長［19］；同時(shí)一些微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸也使得發(fā)酵液酸度增大，像曲霉菌代謝出檸檬酸，細(xì)菌中醋酸菌及乳酸菌分別產(chǎn)生的醋酸、乳酸等［20］。微生物在較高酸和酒精度環(huán)境中生長受到抑制，使其群落多樣性降低。

表2　黃酒發(fā)酵過程中真菌群落組成分布Table2Distributionofeukaryoticmicroorganism communities during rice wine brewing

圖2　不同發(fā)酵時(shí)期真菌在屬水平上的數(shù)目變化情況Fig.2　Changes of the eukaryotic microorganism in different fermentation periods at genus level

到了發(fā)酵后期真核種類稍有上升，在第12天時(shí)優(yōu)勢微生物從6種上升到10種；發(fā)酵液中特征微生物曲霉屬相對豐度增大，從第9天的98.54%上升到第12天時(shí)的99.27%。其他一些糖化真菌也在后酵階段出現(xiàn)，如根霉屬、毛霉屬等。這是由于到了后酵時(shí)期整個(gè)發(fā)酵液溫度下降，酵母和一些細(xì)菌代謝活動變緩，而此時(shí)的氧氣量相對前酵階段比較充足，一些霉菌能夠在低溫和低酸下存活而不受抑制［21］。像根霉、毛霉等，它們能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等物質(zhì)，降解發(fā)酵液中殘余物質(zhì)產(chǎn)生可供代謝的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、蛋白質(zhì)等，微生物利用這些營養(yǎng)物質(zhì)而生長，重新使得發(fā)酵醪液的真菌多樣性增大［22-23］。

2.5發(fā)酵液揮發(fā)性物質(zhì)變化情況

利用GC-MS對黃酒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，一共得到60種化合物，其中高級醇類12種，酯類化合物34種，醛類化合物7種，其他類如呋喃、吡嗪等共7種，其中主要揮發(fā)性物質(zhì)變化情況如圖3所示。

圖3　發(fā)酵液主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化情況Fig.3　Changes of the main volatile flavor compounds in ferment mash

從圖3可以看出，主要高級醇變化趨勢較為一致，在前酵階段均隨著發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行，含量不斷增加；到了后酵階段，3種高級醇增長變緩，都在第12天時(shí)達(dá)到最大值，隨后含量稍有降低并保持穩(wěn)定。主要醛類物質(zhì)中，苯甲醛含量在整個(gè)發(fā)酵過程中一直呈現(xiàn)增長趨勢，苯乙醛和壬醛呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，其中苯乙醛在第2天達(dá)到最大值，壬醛含量在第9天達(dá)到最大值，隨后隨著發(fā)酵的進(jìn)行，化合物含量維持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)。主要揮發(fā)性酯類中，己酸乙酯和乙酸乙酯呈現(xiàn)出先增加后穩(wěn)定的趨勢，而乙酸異戊酯含量在前4 d上升到最大值，在第6天下降后又上升，之后其含量呈降低趨勢。

高級醇是黃酒發(fā)酵過程中酵母合成細(xì)胞蛋白質(zhì)的副產(chǎn)物，主要由酵母產(chǎn)生［24］。在黃酒的前酵階段，由于發(fā)酵醪液中具有較多的營養(yǎng)物質(zhì)，適宜的環(huán)境使得酵母產(chǎn)生酒精和大量的高級醇；醇被氧化成醛，使得醛類物質(zhì)相應(yīng)增加；有機(jī)酸和高級醇發(fā)生酯化脫水產(chǎn)生酯，使得發(fā)酵液中酯類含量增加。到了后期，由于溫度降低，微生物產(chǎn)酸也使得發(fā)酵液變成了較高酸度、高酒精度環(huán)境，大量微生物生長受到抑制，酵母產(chǎn)酒精能力也受到影響，因此在后酵時(shí)產(chǎn)高級醇能力降低，相應(yīng)的醛類和酯類化合物生成量也就降低了。

2.6發(fā)酵液理化指標(biāo)變化情況

從圖4可以看出，在前酵階段，總酸增加明顯，第4天達(dá)到最大值，隨后保持不變；氨基酸態(tài)氮呈現(xiàn)出緩慢的增長趨勢；發(fā)酵液pH在第4天最低，總體上呈現(xiàn)先降低后穩(wěn)定的變化趨勢。

圖4　發(fā)酵液理化指標(biāo)變化情況Fig.4　Changes of the physical and chemicalproperties in ferment mash

黃酒中的有機(jī)酸主要是乳酸、醋酸和琥珀酸，其中非揮發(fā)性的乳酸和琥珀酸是導(dǎo)致黃酒回味的主要物質(zhì)［25］。由于在發(fā)酵前期，充足的養(yǎng)分和空氣，使得產(chǎn)酸微生物大量生長，微生物代謝出大量有機(jī)酸，使得發(fā)酵液總酸增大，這時(shí)候的pH也隨之降低；到了發(fā)酵后期，由于發(fā)酵液不適合微生物生長，一些產(chǎn)酸微生物生長受到抑制，因而總酸和pH能夠保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)。氨基酸主要是由生物合成和轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生，這個(gè)過程需要利用微生物產(chǎn)生的酶來合成或轉(zhuǎn)化。由于大部分合成酶及轉(zhuǎn)氨酶都是從麥曲中帶入，并且在發(fā)酵過程中含量保持較為穩(wěn)定，因而酶催化產(chǎn)生的氨氮能夠穩(wěn)定增長。

3　結(jié)語

采用宏基因組學(xué)的方法分析了清爽型黃酒發(fā)酵過程中真菌群落組成，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)黃酒發(fā)酵過程中曲霉屬具有較高的相對豐度，并一直以優(yōu)勢真菌存在于整個(gè)黃酒發(fā)酵過程中。采用GC-MS對發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，結(jié)果表明高級醇呈現(xiàn)出先升高后保持穩(wěn)定的趨勢，醛類和酯類物質(zhì)大多呈現(xiàn)出先增加后降低的變化規(guī)律。在發(fā)酵前期，發(fā)酵液中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，此時(shí)的環(huán)境適合微生物的繁殖，因而發(fā)酵液中微生物不斷生長并保持較高的多樣性和活性，微生物代謝合成的風(fēng)味物質(zhì)含量也隨著升高。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，由于一些產(chǎn)酸微生物產(chǎn)生大量有機(jī)酸，同時(shí)酵母發(fā)酵產(chǎn)生了酒精，使得發(fā)酵醪液變成高酸、高酒精度環(huán)境，造成大量的微生物不適應(yīng)環(huán)境而消失或豐度降低。利用宏基因組學(xué)技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地解析黃酒發(fā)酵過程中微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)跟蹤主要微生物的變化情況，這對于解析黃酒發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化以及指導(dǎo)黃酒生產(chǎn)，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

本文主要從屬水平對各種微生物種類及相對豐度進(jìn)行了研討，主要是對黃酒發(fā)酵醪液中的真菌進(jìn)行鑒定。后續(xù)研究中，可對發(fā)酵液的理化性質(zhì)進(jìn)一步研究，如營養(yǎng)物質(zhì)分布、溶氧等，為解釋微生物群落結(jié)構(gòu)變化奠定理論基礎(chǔ)。

［1］GB/T 13662-2008黃酒［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［2］羅濤，范文來，徐巖.中國黃酒中揮發(fā)性和不揮發(fā)性物質(zhì)的研究現(xiàn)狀與展望［J］.釀酒，2007（1）：44-48. LUO Tao，F(xiàn)AN Wenlai，XU Yan.The review of volatile and non-volatile compounds in Chinese Rice Wine［J］.Liquor Making，2007（1）：44-48.（in Chinese）

［3］壽虹志，凌志勇，楊旭，等.淺析黃酒麥曲中的微生物與黃酒風(fēng)味的關(guān)系［J］.中國釀造，2007（8）：55-57. SHOU Hongzhi，LING Zhiyong，YANG Xu，et al.Relationship between metabolites of wheat Qu microorganisms and flavor of rice wine［J］.China Brewing，2007（8）：55-57.（in Chinese）

［4］曹鈺，陸健，方華，等.紹興黃酒麥曲中真菌多樣性的研究［J］.食品科學(xué)，2008（3）：277-282. CAO Yu，LU Jian，F(xiàn)ANG Hua，et al.Fungal diversity of wheat Qu of Shaoxing Rice Wine［J］.Food Science，2008（3）：277-282.（in Chinese）

［5］Shang Y，Chen L，Zhang Z，et al.A comparative study on the fungal communities of wheat Qu for Qingshuang-type Chinese Rice Wine［J］.Journal of the Institute of Brewing，2012，118（2）：243-248.

［6］Han Y，Li L，Liu J.Characterization of the airborne bacteria community at different distances from the rotating brushes in a wastewater treatment plant by 16S rRNA gene clone libraries［J］.Journal of Environmental Sciences，2013，25（1）：5-15.

［7］Cheng C，Zaichao Z，Aizhong D，et al.Bar-Coded pyrosequencing reveals the bacterial community during microcystis water bloom in guanting reservoir，Beijing［J］.Procedia Engineering，2011，18：341-346.

［8］Hazen T C.The super chip for microbial community structure，and function from all environments［J］.Microbial Biotechnology，2013，6（5）：450-452.

［9］Metzger J，Tonda R，Beltran S，et al.Next generation sequencing gives an insight into the characteristics of highly selected breeds versus non-breed horses in the course of domestication［J］.Bmcgenomics，2014，15（1）：1-13.

［10］Zhao J，Zhang R，Xue C，et al.Pyrosequencing reveals contrasting soil bacterial diversity and community structure of two main winter wheat cropping systems in China［J］.Microbial Ecology，2014，67（2）：443-453.

［11］Wu S，Tian J，Gatesoupe F，et al.Intestinal microbiota of gibel carp（Carassius auratus gibelio）and its origin as revealed by 454 pyrosequencing［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology，2013，29（9）：1585-1595.

［12］Zhu D，Tanabe S，Yang C，et al.Bacterial community composition of South China Sea sediments through Pyrosequencing-Based analysis of 16S rRNA genes［J］.PLoS ONE，2013，8（10）：1-9.

［13］Park E，Chun J，Cha C，et al.Bacterial community analysis during fermentation of ten representative kinds of kimchi with barcoded pyrosequencing.［J］.Food Microbiology，2012，30（1）：197-204.

［14］Aldrete-Tapia A，Escobar-Ramírez M C，Tamplin M L，et al.High-throughput sequencing of microbial communities in Poro cheese，an artisanal Mexican cheese［J］.Food Microbiology，2014，44：136-141.

［15］Wu Q，Chen L，Xu Y.Yeast community associated with the solid state fermentation of traditional Chinese Maotai-flavor liquor［J］. International Journal of Food Microbiology，2013，166（2）：323-330.

［16］Nam Y，Lee S，Lim S.Microbial community analysis of Korean soybean pastes by next-generation sequencing［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，155（1-2）：36-42.

［17］Orgiazzi A，Lumini E，Nilsson R H，et al.Unravelling soil fungal communities from different mediterranean Land-Use backgrounds［J］.PLoS ONE，2012，7（4）：1-9.

［18］Bruns T D，Gardes M.ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts［J］.Molecular Ecology，1993，2（2）：113-118.

［19］楊魯君.優(yōu)良黃酒酵母菌株的篩選、鑒定和發(fā)酵特性研究［D］.杭州.浙江工商大學(xué)，2013.

［20］趙佳，雷振河，呂利華，等.汾酒產(chǎn)酸細(xì)菌的分離鑒定及其產(chǎn)酸條件研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009（12）：43-46. ZHAO Jia，LEI Zhenghe，LV Lihua，et al.Identify acidogenic bacterium and study on the acidogenic condition of the fen liquor ［J］.Food and Fermentation Industries，2009（12）：43-46.（in Chinese）

［21］毛青鐘，魯瑞剛，陳寶良，等.黃酒發(fā)酵醪抑制霉菌生長的初步探討［J］.中國釀造，2006（9）：56-59. MAO Qingzhong，LU Ruigang，CHEN Baoliang，et al.Study on fermented mash of rice wine on inhibition to mold［J］.China Brewing，2006（9）：56-59.（in Chinese）

［22］劉芳，曹新志，任曉華.甜酒曲華根霉淀粉酶菌株紫外線誘變育種［J］.中國釀造，2009（7）：78-80. LIU Fang，CAO Xinzhi，REN Xiaohua.Brewing of rhizopus chinensis amylase strain from sweet-liqueur Daqu by ultraviolet radiation［J］.China Brewing，2009（7）：78-80.（in Chinese）

［23］李理，羅澤民，盧向陽.毛霉產(chǎn)蛋白酶的特性及其應(yīng)用研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).1999（3）：216-219. LI Li，LUO Zemin，LU Xiangyang.Studies on the properties of mucor producing proteinase and mucor protease application［J］. Journal of Hunan Agricultural University，1999（3）：216-219.（in Chinese）

［24］譚檑華.黃酒固定化發(fā)酵及其高級醇含量的控制研究［D］.杭州：浙江工商大學(xué)，2013.

［25］馮德明，張洋，趙惠明，等.反相高效液相色譜法測定黃酒中的有機(jī)酸［J］.中國釀造，2009（3）：157-161. FENG Deming，ZHANG Yang，ZHAO Huiming，et al.Determination of organic acids in rice wine by reverse phase high performance liquid chromatography［J］.China Brewing，2009（3）：157-161.（in Chinese）

Analysis of Fungi Diversity and Volatile Flavor Compounds in Chinese Rice Wine Fermentation Process

MOU Rang1，2，MAO Jian*1，2，3，MENG Xiangyong1，2，3，LIU Yunya1，2
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.National Engineering Research Center of Chinese Rice Wine，Shaoxing 312000，China）

As the Chinese national specialty，Chinese rice wine has a long history and unique production and fermentation technology，the microbial community and metabolites contribute to the unique flavor during the rice wine brewing.In this study，the metagenome technology was applied to explore the fungi diversity and the GC-MS was used to analyze the volatile flavor compounds in ferment mash of different fermentation periods.The results showed that the ferment mash had higher fungi diversity at the initial stage，22 genera were identified in 0 day.The relative abundance of Aspergillus were all above 90%，which was much higher as compared with other eukaryotic microorganisms during the fermentation process.The advantageous fungi changed obviously，the genera number decreased at first four days and increased later.The analyzed of volatile flavor compounds showed that the generation of volatile substances were greatly influenced by physical and chemical properties of fermented mash.High acidity，alcohol and low pH reduced the fungidiversity，and lowered the contents of volatile flavor compounds.

wheat koji，ferment mash，fungi，diversity，volatile flavor compounds

TS 262.4

A

1673—1689（2016）03—0303—07

2014-11-25

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102203-06）。

毛?。?970—），男，安徽宿州人，工學(xué)博士，教授，主要從事食品生物技術(shù)研究。E-mail：biaomao@263.net