糟醅堆積過(guò)程中微生物種群的變化規(guī)律

山其木格，梁慧珍，張長(zhǎng)霞，張林奇，譚旭，梁麗泉，李長(zhǎng)文（天津市天士力控股集團(tuán)健保食品研究所，天津300402）

糟醅堆積過(guò)程中微生物種群的變化規(guī)律

山其木格，梁慧珍*，張長(zhǎng)霞，張林奇，譚旭，梁麗泉，李長(zhǎng)文
（天津市天士力控股集團(tuán)健保食品研究所，天津300402）

糟醅堆積發(fā)酵是醬香型白酒生產(chǎn)工藝中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，對(duì)白酒品質(zhì)、產(chǎn)量有很大的影響。采用PCR-DGGE生物技術(shù)研究醬香型白酒釀造中所有的糟醅堆積過(guò)程，對(duì)堆積糟醅中的微生物種群變化進(jìn)行跟蹤，揭示微生物種群在各個(gè)輪次糟醅堆積過(guò)程的變換規(guī)律。從整體看，堆積發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌種類(lèi)多于真菌種類(lèi)，下沙期間堆積糟醅的微生物種類(lèi)很少，糙沙階段微生物種類(lèi)開(kāi)始逐漸增多，二輪次堆積時(shí)微生物種類(lèi)最豐富，且在整個(gè)釀酒年度的末期，堆積糟醅微生物多樣性有減少現(xiàn)象。

堆積發(fā)酵；微生物種群變化；糟醅

醬香型白酒是我國(guó)主要的白酒香型之一，屬大曲酒類(lèi)。典型的醬香白酒特點(diǎn)為醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味悠長(zhǎng)、空杯留香持久。醬香型白酒的生產(chǎn)以一年為一個(gè)生產(chǎn)周期，經(jīng)過(guò)2次投料，9次蒸煮，8輪發(fā)酵，7次取酒。醬香型白酒“四高兩長(zhǎng)”的生產(chǎn)工藝是其品質(zhì)風(fēng)格特點(diǎn)的源泉，其中之一即高溫堆積，某種程度上可說(shuō)沒(méi)有堆積就沒(méi)有醬香酒［1-2］。

在醬香白酒生產(chǎn)中，由于采用的是高溫制曲，導(dǎo)致在大曲制作過(guò)程中幾乎所有的酵母菌都被殺死。經(jīng)過(guò)后來(lái)的堆積過(guò)程，糟醅網(wǎng)羅空氣中微生物尤其是酵母菌。堆積也是微生物發(fā)酵產(chǎn)生各種酶類(lèi)，并在多種微生物及其酶類(lèi)共同作用下生成酒體中的香味物質(zhì)及其前體物質(zhì)的過(guò)程。因此堆積也稱(chēng)為“二次制曲”。在堆積過(guò)程中溫度由內(nèi)向外不斷升高，最終堆積糟醅頂溫升至50℃左右，糟醅表面產(chǎn)生一層白色斑點(diǎn)，并產(chǎn)生明顯的酒香味，略有醬香時(shí)即可入池發(fā)酵。此外，經(jīng)過(guò)高溫堆積也抑制或淘汰了一部分雜菌，馴化了耐高溫酵母，更有利于耐高溫細(xì)菌的繁殖與作用，有利于糖化發(fā)酵，促進(jìn)醬香風(fēng)味的形成，為窖內(nèi)發(fā)酵創(chuàng)造了條件［3］?？梢?jiàn)，堆積發(fā)酵對(duì)出酒率和產(chǎn)酒品質(zhì)都有很大的影響。從圖1的醬香型白酒工藝流程可以看出，在整個(gè)釀酒年度中有8次糟醅堆積過(guò)程，分別在下沙、糙沙、一輪次、二輪次、三輪次、四輪次、五輪次及六輪次期間進(jìn)行，待七輪次酒蒸餾之后丟糟。醬香白酒釀造過(guò)程中，各輪次堆積時(shí)的氣候、溫濕度及原料狀態(tài)等條件不同，各個(gè)輪次基酒的特點(diǎn)也各不相同，因此針對(duì)各輪次堆積過(guò)程的菌種多樣性進(jìn)行分析具有重要的意義。

圖1　醬香型白酒工藝流程Fig.1　Moutai-flavor liquor production process

近10年來(lái)，關(guān)于醬香型白酒微生物的研究一直未曾間斷，主要集中于從酒曲、糟醅、窖泥中分離特殊功能微生物，并研究其生理生化特性及對(duì)白酒品質(zhì)的改良功能。這些研究主要以傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)、采用劃線分離及形態(tài)鑒定，采用分子生物學(xué)鑒定的報(bào)道較為少見(jiàn)［4］。黃永光等人在“醬香白酒堆積發(fā)酵過(guò)程酒醅中的酵母菌的分析研究”一文中對(duì)堆積發(fā)酵過(guò)程酒醅中的酵母菌進(jìn)行分離、形態(tài)學(xué)初篩和PCR產(chǎn)物擴(kuò)增及26S rDNA定性鑒定分析，并對(duì)其中所獲取的部分優(yōu)選菌株的發(fā)酵性能及其發(fā)酵代謝風(fēng)味成分貢獻(xiàn)進(jìn)行了研究［5］。利用PCRDGGE技術(shù)研究糟醅堆積過(guò)程中的微生物多樣性，克服了常規(guī)平板培養(yǎng)方法的一些缺點(diǎn)，在分析復(fù)雜微生態(tài)演替規(guī)律的研究中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

本課題研究中主要采用PCR-DGGE生物技術(shù)，針對(duì)醬香型白酒釀造中所有的糟醅堆積過(guò)程，對(duì)堆積糟醅中的微生物種群變化進(jìn)行跟蹤，從而揭示微生物種群在各個(gè)輪次糟醅堆積過(guò)程的變換規(guī)律。

1　材料與方法

1.1樣品

糟醅樣品取自貴州國(guó)臺(tái)酒業(yè)有限公司釀酒車(chē)間。首先對(duì)堆積糟醅各個(gè)部位進(jìn)行溫度測(cè)量，挑選出溫度上升較明顯、微生物活動(dòng)較活躍的位點(diǎn)，即100 cm高40 cm深處作為取樣檢測(cè)的固定位點(diǎn)，并在糟醅堆積的各個(gè)階段進(jìn)行取樣分析。

1.2試劑和儀器

TaqDNA聚合酶、dNTP，購(gòu)自TaKaRa公司；土壤總DNA提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；PCR儀MyCyclerTMThermal Cycler，DGGE圖譜DCodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)，Discovery Series凝膠成像系統(tǒng)，Quantity One分析軟件，均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-6C瓊脂糖電泳裝置，購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1總DNA的提取糟醅樣品取樣后，冷凍密封保存于冰箱-20℃，盡快提取樣品總DNA。將糟醅樣品加入PBS緩沖液（pH 7.4）中，搖床振蕩，分步離心，收集菌體。使用土壤總DNA提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的指示，進(jìn)行各輪次堆積糟醅樣品中微生物總DNA的提取。

1.3.2PCR擴(kuò)增以糟醅樣品總DNA為模板，利用巢式PCR技術(shù)，擴(kuò)增出16S rDNA V3可變區(qū)，供糟醅樣品細(xì)菌群落分析［6］。應(yīng)用通用引物16S1（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和16S2（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），進(jìn)行第一步擴(kuò)增，得到16S PCR產(chǎn)物；再以16S PCR產(chǎn)物為模板，利用第二步擴(kuò)增引物R518（5′-ATTACCGCGGCT GCTGG-3′）和338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3′），擴(kuò)增得到細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)片段。與此同時(shí)，以糟醅總DNA為模板，利用巢式PCR技術(shù)，擴(kuò)增出真菌FR1/FF390區(qū)，供糟醅樣品真菌群落分析。應(yīng)用通用引物Geo11（5′-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3′）和GeoA2（5′-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）進(jìn)行第一步擴(kuò)增，得到18S PCR產(chǎn)物；再以18S PCR產(chǎn)物為模板，利用第二步擴(kuò)增引物FR1（5′-AICCATTCAATCG GTAIT-3′）和FF390（5′-CGATAAC GAACGAGAC CT-3′）擴(kuò)增得到真菌FR1/FF390區(qū)。在引物338F和FR1中分別引入GC發(fā)夾，以便在DGGE中有效分離。PCR反應(yīng)條件為：94℃，4 min；94℃變性30 s，50～55℃退火30 s；72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3變性梯度凝膠電泳及圖像分析堆積糟醅樣品的細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)和真菌FR1/ FF390區(qū)通過(guò)DGGE分析研究微生物群落的構(gòu)成［7］。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)細(xì)菌和真菌分析采用不同濃度、不同梯度的DGGE方法。對(duì)于細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)，丙烯酰胺凝膠濃度為10 g/dL，變性梯度范圍為30%～60%（100%變性梯度包含體積分?jǐn)?shù)40%甲酰胺和7 mol/L尿素）；對(duì)于真菌FR1/FF390區(qū)，丙烯酰胺凝膠濃度為8 g/dL，變性梯度范圍為20%～50%。PCR產(chǎn)物電泳上樣量均為50 μL，電泳采用DCodeTM通用突變檢測(cè)系統(tǒng)。首先在20 V電壓預(yù)電泳20 min，隨后調(diào)整至100 V，電泳10 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行SYBR Green I染色液染色，通過(guò)紫外凝膠成像儀捕獲圖像。利用分析軟件Quantity One，讀取圖譜上條帶的光密度值，完成匹配比對(duì)后，采用UPGAMA算法進(jìn)行聚類(lèi)分析，并生成DGGE圖譜相似性分析圖［8］。

1.3.4序列分析DGGE結(jié)束后，對(duì)其主要優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠回收。用R518/338F和FR1/FF390引物分別進(jìn)行再擴(kuò)增后純化，參考pUCm-T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、克隆。挑取陽(yáng)性克隆子交由BGI公司進(jìn)行序列測(cè)定。將所測(cè)得的序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)頁(yè)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）通過(guò)BLAST進(jìn)行比對(duì)，尋找與目的序列同源性最高的菌種的序列，從而確定優(yōu)勢(shì)菌種。

2　結(jié)果與分析

2.1糟醅細(xì)菌DGGE分析

在巢式PCR中，應(yīng)用16S1/16S2引物進(jìn)行第一步擴(kuò)增，得到大小約為1 500 bp的產(chǎn)物（見(jiàn)圖2 （a）），應(yīng)用R518/338F-GC引物進(jìn)行第二步擴(kuò)增，得到大小約為240 bp的產(chǎn)物（見(jiàn)圖2（b）），結(jié)果均與期望一致。

圖2　堆積糟醅細(xì)菌16S rDNA和16S V3可變區(qū)鑒定圖Fig.2　16SrDNA and highly variable V3 region of 16S rDNA of bacteria in stacked fermentation

經(jīng)過(guò)對(duì)糟醅堆積的各個(gè)階段即下沙、糙沙、一輪次、二輪次、三輪次、四輪次、五輪次及六輪次糟醅堆積過(guò)程中細(xì)菌多樣性的跟蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)下沙期間糟醅堆積中細(xì)菌種類(lèi)較少，糙沙期間細(xì)菌種類(lèi)開(kāi)始增多，二輪次期間細(xì)菌多樣性最豐富，三輪次至四輪次堆積糟醅樣品的細(xì)菌多樣性大致相同，五輪次至六輪次細(xì)菌種類(lèi)稍有減少，細(xì)菌鑒定詳細(xì)情況見(jiàn)圖3及采用UPGAMA算法進(jìn)行的聚類(lèi)分析圖4。

圖3　堆積糟醅細(xì)菌16S V3可變區(qū)DGGE圖及識(shí)別圖Fig.3　DGGE fingerprints of 16S V3 region of bacteria in stacked fermentation and its identification chart

圖4　堆積糟醅細(xì)菌16S V3可變區(qū)樣品相似性分析圖Fig.4　UPGAMAanalysisshowingthephylogenic relationshipofthebacteriainstacked fermentation

2.2糟醅真菌DGGE分析

在巢式PCR中，應(yīng)用Geo11/GeoA2引物進(jìn)行第一步擴(kuò)增，得到大小約為1 800 bp的產(chǎn)物（見(jiàn)圖5），應(yīng)用FF390/FR1-GC引物進(jìn)行第二步擴(kuò)增，得到大小約為390 bp的產(chǎn)物（見(jiàn)圖6），結(jié)果均與期望一致。

圖5　堆積糟醅真菌18S rDNA鑒定圖Fig.5　18S rDNA of fungi in stacked fermentation

圖6　糟醅真菌FR1/FF390區(qū)鑒定圖Fig.6　FR1/FF390 region of fungi in stacked fermentation

經(jīng)過(guò)對(duì)各個(gè)階段糟醅堆積過(guò)程中真菌多樣性的跟蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)堆積糟醅真菌多樣性較少，沒(méi)有細(xì)菌種類(lèi)豐富。下沙期間糟醅堆積中真菌種類(lèi)很少，之后逐漸增多；二輪次期間真菌多樣性較豐富，并在二輪次至六輪次期間，堆積糟醅的真菌多樣性幾乎沒(méi)有變化。真菌鑒定詳細(xì)情況見(jiàn)圖7及采用UPGAMA算法進(jìn)行的聚類(lèi)分析圖8。

圖7　堆積糟醅真菌FR1/FF390區(qū)DGGE圖及識(shí)別圖Fig.7　DGGE fingerprints of FR1/FF390 region of fungi in stacked fermentation and its identification chart

圖8　堆積糟醅真菌FR1/FF390區(qū)樣品相似性分析圖Fig.8　UPGAMAanalysisshowingthephylogenic relationship of the fungi in stacked fermentation

3　討論

對(duì)醬香型白酒生產(chǎn)中各個(gè)輪次堆積發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)微生物變換情況作了比較詳細(xì)的分析，為今后白酒生產(chǎn)的生物優(yōu)化技術(shù)、發(fā)酵控制技術(shù)等提供了理論依據(jù)和參考。醬香型白酒釀造中，在下沙、糙沙、一輪次、二輪次、三輪次、四輪次、五輪次及六輪次等階段均有糟醅堆積的過(guò)程。各輪次堆積時(shí)的氣候、溫濕度及原料狀態(tài)等條件不同，各個(gè)輪次基酒的特點(diǎn)也各不相同。因此本課題研究中針對(duì)各輪次堆積過(guò)程的菌種多樣性進(jìn)行跟蹤，觀察在各輪次堆積糟醅中微生物多樣性的交替變換情況。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，下沙期間糟醅的細(xì)菌種類(lèi)很少，只有耐酸乳桿菌、乳酸片球菌和巴氏醋桿菌。糙沙堆積期間，細(xì)菌多樣性明顯增加，多增了面包乳桿菌、芽孢桿菌屬及Virgibacillus屬的細(xì)菌。一輪次堆積時(shí)多增Tsukamurella spumae、Acetobacter nitrogenifigens、Thermoactinomyces sanguinis等細(xì)菌。二輪次堆積時(shí)細(xì)菌多樣性最為豐富，多增苜蓿中華根瘤菌和直桿糖多孢菌。三輪次至四輪次堆積過(guò)程中細(xì)菌多樣性幾乎類(lèi)似；五輪次至六輪次堆積期間細(xì)菌多樣性稍有減少。細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)DGGE圖譜識(shí)別圖顯示了各個(gè)輪次堆積糟醅細(xì)菌種類(lèi)與細(xì)菌多樣性最為豐富的二輪次堆積糟醅細(xì)菌種類(lèi)的對(duì)比結(jié)果。從圖3和圖4中，可以發(fā)現(xiàn)下沙期間細(xì)菌種類(lèi)最少，其同源性少于8%；糙沙期間細(xì)菌種類(lèi)開(kāi)始增多，同源性在50%左右。一輪次堆積開(kāi)始細(xì)菌種類(lèi)同源性普遍達(dá)到70%以上。堆積過(guò)程中的真菌，其多樣性不及細(xì)菌豐富。下沙堆積期間真菌種類(lèi)最少，只有白地霉和Pichia fermentans；糙沙堆積期間真菌種類(lèi)稍有增加，多增嗜酒假絲酵母、亞硝酸對(duì)粟酒裂殖酵母菌和釀酒酵母等；二輪次開(kāi)始堆積糟醅的真菌種類(lèi)趨于穩(wěn)定，大致包含嗜酒假絲酵母、Pichia fermentans、亞硝酸對(duì)粟酒裂殖酵母菌和釀酒酵母等。真菌FR1/FF390區(qū)DGGE圖譜識(shí)別圖顯示了各個(gè)輪次堆積糟醅真菌種類(lèi)與真菌多樣性最為豐富的二輪次堆積糟醅真菌種類(lèi)的對(duì)比結(jié)果。從圖7和圖8中，可以發(fā)現(xiàn)下沙期間真菌種類(lèi)最少，其同源性在15%以下；糙沙期間真菌種類(lèi)開(kāi)始增加，同源性可達(dá)70%；二輪次至六輪次真菌種類(lèi)較穩(wěn)定，同源性大致可保持在80%以上。釀酒年度的初期糟醅堆積中，細(xì)菌及真菌多樣性均少，加之底物是生糧，因此一輪次基酒具有生沙香突出、有生糧味的特點(diǎn)。隨著微生物多樣性的逐步增多，可發(fā)酵出更多更豐富的呈味物質(zhì)，使得三、四、五輪次的基酒變得醬香較為突出、醇和，成為醬香型白酒勾調(diào)中的大宗酒，可見(jiàn)微生物在醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中承擔(dān)著重要的角色。

4　結(jié)語(yǔ)

白酒釀造過(guò)程是微生物發(fā)酵的過(guò)程，也是呈味物質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程。醬香型白酒釀造過(guò)程中微生物主要來(lái)自大曲和堆積過(guò)程網(wǎng)羅空氣和環(huán)境中的微生物。其中，糟醅堆積不僅是擴(kuò)大微生物數(shù)量為入窖發(fā)酵創(chuàng)造條件，也是醬香型白酒的香味成分或香味前體物質(zhì)產(chǎn)生的過(guò)程。掌握堆積過(guò)程中微生物的種群變化，對(duì)于控制白酒發(fā)酵有著很重要的意義。今后要進(jìn)一步探索醬香型白酒發(fā)酵機(jī)理，弄清楚各個(gè)呈味物質(zhì)的生成過(guò)程，這有待白酒研究人員做更深入、更精細(xì)的微生物代謝研究。

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谷氨酸生產(chǎn)過(guò)程資源高效利用及降污技術(shù)

谷氨酸是生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)品，我國(guó)的總產(chǎn)量占全球75%以上，其生產(chǎn)技術(shù)對(duì)我國(guó)氨基酸發(fā)酵技術(shù)產(chǎn)生重大的影響。然而谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中多環(huán)節(jié)產(chǎn)污問(wèn)題一直制約著行業(yè)的發(fā)展，其生產(chǎn)廢水表現(xiàn)為高COD、高NH3-N、高鹽、低pH“三高一低”的特征，一度成為我國(guó)高重污染行業(yè)的象征。

江南大學(xué)、菱花集團(tuán)有限公司等的科研人員通過(guò)系統(tǒng)科學(xué)的理論研究、中試、產(chǎn)業(yè)化和推廣應(yīng)用，解決了谷氨酸生產(chǎn)鏈中因產(chǎn)污較重而長(zhǎng)期困擾發(fā)酵行業(yè)發(fā)展的重大技術(shù)難題。如：

CN200810023516.2涉及一種低物耗少?gòu)U水的谷氨酸提取新工藝，特征是谷氨酸發(fā)酵液進(jìn)入等電結(jié)晶罐等電結(jié)晶，等電結(jié)晶后經(jīng)離心分離得到谷氨酸結(jié)晶和等電母液，將等電母液通過(guò)菌體分離得到菌體蛋白質(zhì)和等電清母液，再將等電清母液一部分蒸發(fā)得到濃縮清母液，另一部分留存為二次結(jié)晶谷氨酸溶解用，濃縮清母液經(jīng)二次結(jié)晶，得到二次結(jié)晶谷氨酸晶體，用水、等電清母液和硫酸使二次結(jié)晶谷氨酸晶體溶解，經(jīng)溶解得到的含有谷氨酸的稀硫酸溶液送回等電結(jié)晶罐，調(diào)節(jié)下一批發(fā)酵液等電結(jié)晶。該發(fā)明能降低硫酸和液氨的消耗；由于采用二次結(jié)晶工藝，可提高谷氨酸提取收率；谷氨酸結(jié)晶質(zhì)量最好，無(wú)需“變晶”。CN200810244726.4涉及一種高質(zhì)量低物耗少?gòu)U水的谷氨酸提取方法，特征是將谷氨酸發(fā)酵液通過(guò)菌體分離得到副產(chǎn)物菌體蛋白質(zhì)和清發(fā)酵液；清發(fā)酵液進(jìn)入等電結(jié)晶罐等電結(jié)晶使谷氨酸結(jié)晶析出；等電結(jié)晶后經(jīng)離心分離得到產(chǎn)品谷氨酸結(jié)晶和等電母液；將上述等電母液分成兩部分，一部分等電母液進(jìn)入蒸發(fā)器蒸發(fā)得到濃縮清母液，另一部分作為溶解二次結(jié)晶谷氨酸用；濃縮清母液二次結(jié)晶；二次結(jié)晶的谷氨酸晶體進(jìn)入溶解罐，使谷氨酸結(jié)晶溶解；經(jīng)溶解得到含有谷氨酸的稀硫酸溶液送回等電結(jié)晶罐，調(diào)節(jié)下一批發(fā)酵液等電結(jié)晶。CN200910162051.3公開(kāi)了一種利用發(fā)酵谷氨酸提取廢液生產(chǎn)復(fù)合肥的方法，包括如下步驟：在40～150℃的溫度條件下，對(duì)發(fā)酵谷氨酸提取廢液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮處理，使所得濃縮漿料中固形物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%～99%；對(duì)所述濃縮漿料進(jìn)行冷卻處理，使其溫度達(dá)到20～120℃；對(duì)步驟b所得物料中依次進(jìn)行造粒處理和冷卻固化成型處理，得到所述復(fù)合肥。該發(fā)明所述方法，可以克服現(xiàn)有技術(shù)中環(huán)保性差和回收資源利用率低等缺陷，以實(shí)現(xiàn)環(huán)保性好、產(chǎn)品性能好、適用面廣和回收資源利用率高的優(yōu)點(diǎn)。CN200810156676.4涉及一種從高濃高雜溶液中回收谷氨酸的生產(chǎn)工藝，特征是先將谷氨酸等電母液通過(guò)絮凝或膜分離的方法，分離得到副產(chǎn)物菌體蛋白質(zhì)和等電清母液；將分離得到的等電清母液部分或全部送入蒸發(fā)器蒸發(fā)濃縮為濃縮液，向蒸發(fā)濃縮液中添加晶形為α-形的谷氨酸晶種育晶；濃縮液育晶后繼續(xù)濃縮，同時(shí)將剩余的等電清母液流加到蒸發(fā)器中，蒸發(fā)濃縮后的濃縮液再次育晶分離得到谷氨酸；二次育晶分離得到的育晶母液可繼續(xù)結(jié)晶硫酸銨，或噴霧干燥生產(chǎn)復(fù)合肥。CN201010286887.7公開(kāi)了一種谷氨酸連續(xù)等電結(jié)晶的方法，包括如下步驟：將等電液和發(fā)酵液按照一定比例混合，同時(shí)加入硫酸或離交高流分或酸性水解液，維持混合液的pH值在3.0～3.2之間；步驟a所得混合液連續(xù)回流到連續(xù)結(jié)晶罐中，使過(guò)飽和的谷氨酸分子在已有的谷氨酸晶體表面結(jié)晶析出；步驟b所述谷氨酸結(jié)晶析出后的等電液，部分回到步驟a，部分?jǐn)y帶大顆粒谷氨酸結(jié)晶從連續(xù)等電罐中排出，再經(jīng)過(guò)冷卻、沉降、分離后得到優(yōu)質(zhì)谷氨酸結(jié)晶產(chǎn)品。該發(fā)明可以克服現(xiàn)有技術(shù)中操作困難、結(jié)晶質(zhì)量差和提取收率低等缺陷，以實(shí)現(xiàn)操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)品質(zhì)量好、提取收率高和處理能力大等優(yōu)點(diǎn)。CN201010598953.4公開(kāi)了一種將玉米浸泡水用于溫敏型發(fā)酵工藝生產(chǎn)谷氨酸的方法，是用玉米浸泡水代替溫敏型發(fā)酵工藝中的玉米漿制備發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。該工藝技術(shù)操作方便，節(jié)水節(jié)能，有利于降低谷氨酸的發(fā)酵成本，適于在生產(chǎn)中全面推廣。該發(fā)明不僅可節(jié)省配料用的一次水，也大大節(jié)省玉米浸泡水進(jìn)一步蒸發(fā)濃縮所消耗的能源，解決了利用玉米浸泡水生產(chǎn)玉米漿（粉）所造成的壞境污染和能源消耗問(wèn)題，同時(shí)其產(chǎn)酸率和糖酸轉(zhuǎn)化率也有所提高。CN201310660707.0提供了一種氨取代氫氧化鈉調(diào)節(jié)谷氨酸提取配料的pH的方法及裝置。與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是：氨代替氫氧化鈉后，大幅降低了生產(chǎn)成本；料液中的銨根離子在被帶式分離排出后與谷氨酸上游生產(chǎn)中產(chǎn)生的硫酸根離子結(jié)合生產(chǎn)硫酸銨，有效提高了硫酸銨的產(chǎn)量，增加了效益。

對(duì)大宗微生物發(fā)酵產(chǎn)品谷氨酸而言，分析廢水產(chǎn)生的環(huán)節(jié)、原因及廢水的水質(zhì)特點(diǎn)，研發(fā)以“無(wú)廢低耗工藝”為核心的清潔生產(chǎn)技術(shù)和資源高效利用技術(shù)，將是行業(yè)研究人員的努力方向。

（江南大學(xué)圖書(shū)館張群）

Changes of Microbial Diversity in Stacked Fermentation for the Production of Moutai Flavor Liquor

SHAN Qimuge，LIANG Huizhen*，ZHANG Changxia，ZHANG Linqi，
TAN Xu，LIANG Liquan，LI Changwen
（Tianjin Tasly Holding Group Division of Nutraceutical Products，Tianjin 300402，China）

Stacked fermentation is an important part in the production of Moutai flavor liquor and has a great impact on the yield and quality of liquor.The study used PCR-DGGE to reveal the change of microbial population in eight rounds of stacked fermentation during the production of Moutai flavor liquor.It was concluded that there was a certain rule in the change of microbial diversity：the bacterial species in stacked fermentation were more than fungal species during all rounds of stacked fermentation；for the first round，there were only a few microbial species；in the second round，the microbial diversity began to increase；when the fermentation came to the fourth round，the microbial diversity was most abundant；in the final round，the microbial diversity tended to decrease.

stacked fermentation，changes of microbial diversity，fermented grains

Q 815

A

1673—1689（2016）03—0330—06

2014-12-12

山其木格（1979—），女，新疆烏魯木齊人，蒙古族，工學(xué)碩士，工程師，主要從事微生物發(fā)酵研究。E-mail：sqmg790309@163.com

梁慧珍（1968—），女，山東煙臺(tái)人，工學(xué)碩士，高級(jí)工程師，主要從事微生物發(fā)酵研究。E-mail：misslianghuizhen@sina.com