產(chǎn)堿性淀粉酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化

王靜麗，劉松，堵囯成*，2，陳堅(jiān)，2（.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫2422；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫2422）

產(chǎn)堿性淀粉酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建與發(fā)酵優(yōu)化

王靜麗1，劉松1，堵囯成*1，2，陳堅(jiān)1，2
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

堿性淀粉酶催化淀粉在堿性環(huán)境中高效降解，廣泛應(yīng)用于紡織退漿、洗滌、制藥等領(lǐng)域。通過信號(hào)肽篩選，將來源于嗜堿單胞菌Alkalimonas amylolytica的堿性淀粉酶基因于枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB600實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，并優(yōu)化了重組菌產(chǎn)酶的發(fā)酵條件。在最佳信號(hào)肽ywbN介導(dǎo)下，重組B.subtilis發(fā)酵51 h，胞外AmyK酶活最高達(dá)146.86 U/mL，且能在發(fā)酵上清液中檢測到與AmyK理論相對分子質(zhì)量（60 kDa）一致的蛋白質(zhì)條帶。通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基（糊精32 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，KH2PO42.32 g/L，K2HPO4·3H2O 16.43 g/L），并在發(fā)酵24 h后添加0.2 g/dL Na2CO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，發(fā)酵72 h胞外AmyK酶活達(dá)640.33 U/mL，較優(yōu)化前提高了336%，是目前已報(bào)道重組B.subtilis產(chǎn)堿性淀粉酶的最高水平。研究結(jié)果為AmyK發(fā)酵生產(chǎn)的工業(yè)化提供了數(shù)據(jù)支撐。

堿性淀粉酶；信號(hào)肽；重組枯草芽孢桿菌；發(fā)酵優(yōu)化；碳酸鈉

α-淀粉酶（EC3.2.1.1）催化淀粉、糖原等分子中α-1，4-糖苷鍵水解，生成糊精、麥芽寡糖、麥芽糖和葡萄糖等產(chǎn)物［1-2］。在堿性條件下，能高效完成上述催化反應(yīng)的α-淀粉酶即為堿性淀粉酶，一般產(chǎn)自嗜堿微生物，穩(wěn)定pH范圍為9.0～11.0［3-6］。堿性淀粉酶廣泛應(yīng)用于紡織退漿、洗滌劑添加、淀粉加工、醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域［7-8］。

通過發(fā)酵法高效生產(chǎn)堿性淀粉酶已成為國內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。日本學(xué)者Horikoshi［9］首次報(bào)道了產(chǎn)自嗜堿芽孢桿菌A-40-2的堿性淀粉酶，此后通過自然環(huán)境篩選、物理化學(xué)誘變獲得堿性淀粉酶生產(chǎn)菌株的研究陸續(xù)報(bào)道，但產(chǎn)酶水平有限。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建高產(chǎn)重組菌成為提高堿性淀粉酶產(chǎn)量的重要途徑。Murakami［10-11］等分別將來源于芽孢桿菌Bacillus halodurans 38C-2-1和MS-2-5的堿性淀粉酶基因在大腸桿菌Escherichia coli中表達(dá)，胞內(nèi)酶活達(dá)10 U/mL和52 U/mL，分別較野生菌提高45倍和104倍。Wang［1］等將來源于嗜堿單胞菌Alkalimonas amylolytica的堿性淀粉酶（AmyK）基因在E.coli表達(dá)，胞外酶活達(dá)116.75 U/mL。然而，重組菌產(chǎn)酶的總體水平并不高，有待進(jìn)一步提升。

與其他原核微生物表達(dá)系統(tǒng)相比，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢：僅有單層細(xì)胞外膜，分泌信號(hào)肽效率高，可將外源蛋白質(zhì)直接分泌至培養(yǎng)基，提高下游純化效率［12］；廣泛用于多種工業(yè)酶的生產(chǎn)，發(fā)酵技術(shù)成熟［13］；非致病性，被列為國際公認(rèn)的安全微生物（GRAS）；遺傳背景清楚，質(zhì)粒和噬菌體載體類型豐富［14］；密碼子偏好性不明顯［15］。

作者所在課題組前期研究中，將AmyK成功于畢赤酵母Pichia pastoris［16］表達(dá)，發(fā)酵120 h，酶活達(dá)600 U/mL，但生產(chǎn)強(qiáng)度較低，僅為5 U/（mL·h）。為進(jìn)一步縮短AmyK發(fā)酵生產(chǎn)的周期，通過篩選信號(hào)肽，將AmyK在B.subtilis中表達(dá)，并對重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

B.subtilis WB600，E.coli JM109，pET-22b（+）-amyK［16］，E.coli-B.subtilis穿梭質(zhì)粒pMA0911-SPs，均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；克隆質(zhì)粒pMD18-T-simple，購于TaKaRa（大連）生物工程有限公司。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；pH 7.0。

TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，KH2PO42.32，K2HPO4·3H2O 16.43；pH 7.0。

1.3方法

1.3.1AmyK表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化以pET-22b （+）-amyK（含AmyK基因編碼序列）為模板，PCR擴(kuò)增得到AmyK基因，引物見表1。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增得到的AmyK基因片段與pMD18-T-simple連接，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109。涂布平板，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒。

表1　引物序列Table 1　Sequences of primers

用Sal I和BamH I分別雙酶切pMD18-T-simple/amyK和含有不同信號(hào)肽的E.coli-B.subtilis穿梭載體pMA0911-SPs，再用TaKaRa DNA Ligation Kit中的連接酶連接，連接過夜后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109，通過菌落PCR驗(yàn)證篩選陽性克隆。挑選陽性克隆于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證及測序鑒定。序列測定由上海生工有限公司完成。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法［17］轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至B.subtilis WB600。在含有50 μg/mL卡那霉素（Km）平板上挑選陽性克隆，菌落PCR并酶切驗(yàn)證。構(gòu)建成功的重組菌于-80℃甘油管保藏。

1.3.2重組質(zhì)粒穩(wěn)定性的測定

1）分離穩(wěn)定性：挑取重組菌株單菌落，接種至5 mL不含Km的LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)12 h作為種子液，再按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)種于另一LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，即得傳20代的菌液。將該菌液稀釋至10-5～10-6，取100 μL涂布于LB平板上，待長出菌落后，從中挑取100個(gè)單菌落分別點(diǎn)種在無Km的LB平板和含Km的LB平板上，置于37℃培養(yǎng)12 h后統(tǒng)計(jì)平板上的單菌落數(shù)，作為傳20代質(zhì)粒分離穩(wěn)定性的計(jì)算指標(biāo)。如此每隔24 h按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量重新接種培養(yǎng)，直至傳到100代，計(jì)算穩(wěn)定性。

2）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性：分別取20代、60代、100代的菌液，提取質(zhì)粒后用Sal I、BamH I雙酶切，驗(yàn)證目的條帶的存在。

詳見文獻(xiàn)［18］。

1.3.3AmyK的表達(dá)和檢測取甘油管保藏菌株在含Km的固體LB平板上劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取活化后的單菌落接種至LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h，以體積分?jǐn)?shù)4%接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，同樣條件下振蕩培養(yǎng)72 h。取一定量發(fā)酵液，于4℃，12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液（即粗酶液）測定AmyK酶活。

1.3.4淀粉酶活力測定堿性淀粉酶測定采用DNS法［19］。取0.5 mL可溶性淀粉，0.75 mL甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.5，20 mmol/L），50℃預(yù)熱5 min后，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的粗酶液，50℃反應(yīng)5 min。取1 mL反應(yīng)液加入到1 mL DNS中，混勻，沸水浴15 min，冰浴冷卻后定容至10 mL，540 nm下測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。酶活單位的定義：堿性淀粉酶每分鐘降解底物（可溶性淀粉）生成1 μmol還原糖（以葡萄糖計(jì)算）所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.3.5菌體生物量的測定利用分光光度計(jì)檢測經(jīng)適當(dāng)稀釋的菌液在600 nm波長處的吸光度值，即OD600。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)AmyK重組菌的構(gòu)建與表達(dá)

參照方法1.3.1構(gòu)建了分別含有信號(hào)肽ywbN、yncM、estA、yweA、amyX、nprE、vpr、yvgO的重組表達(dá)載體pMA0911M1、pMA0911J1、pMA0911V1、pMA 0911N1、pMA0911A1、pMA0911E1、pMA0911G1、pMA 0911L4。測序結(jié)果顯示，AmyK基因序列完全正確。將重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化B.subtilis WB600，構(gòu)建重組菌株WB11M1、WB11J1、WB11V1、WB11N1、WB11A1、WB11E1、WB11G1、WB11L4，以不帶有AmyK基因的空質(zhì)粒pMA0911轉(zhuǎn)化B. subtilis WB600，構(gòu)成重組菌WB11作為空白對照菌株。不同重組菌于TB培養(yǎng)基37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)72 h，結(jié)果見圖1。由圖1（a）可知，在信號(hào)肽ywbN的介導(dǎo)下，胞外胞內(nèi)酶活最高，分別為146.86 U/mL、7.69 U/mL，分泌效率達(dá)95%，因此ywbN為AmyK分泌表達(dá)的最佳信號(hào)肽。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組菌的發(fā)酵結(jié)果，對8株重組菌WB11M1、WB11J1、WB11V1、WB11N1、WB11A1、WB11E1、WB11G1、WB11L4和對照菌WB11的胞外上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖1（b），只有WB11M1在60 kDa處有一條清晰的蛋白質(zhì)條帶，大小與AmyK相對分子質(zhì)量相符合，與前面酶活測定結(jié)果一致。

圖1　不同菌株胞內(nèi)外酶活比較及胞外上清液SDS-PAGE分析Fig.1　AmyK production in recombinant strains and the SDS-PAGEanalysisofAmyKdistributionin culture supernatants

質(zhì)粒穩(wěn)定性分析顯示，重組菌WB11M1連續(xù)傳100代后，仍有80%細(xì)胞帶有質(zhì)粒，此外，酶切20代、60代、100代重組菌的質(zhì)粒，目的條帶均存在，說明pMA0911M1在重組菌中可穩(wěn)定存在。

2.2重組菌WB11M1發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1碳源對重組菌生長和AmyK產(chǎn)量的影響按照碳源質(zhì)量濃度相等的原則，將初始TB培養(yǎng)基中的甘油分別替換為1.2 g/dL的9種碳源（圖2（a）），研究碳源種類對重組菌發(fā)酵的影響。以麥芽糖、木糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、糊精為碳源時(shí)，菌體生長較好，OD600為20左右，發(fā)酵結(jié)束pH均為8以上。其他碳源條件下，重組菌OD600僅為10左右，發(fā)酵結(jié)束pH約為6，幾乎不產(chǎn)AmyK。因此，堿性條件可能有利于重組菌產(chǎn)AmyK。糊精為最適產(chǎn)酶碳源，發(fā)酵72 h胞外酶活達(dá)295.52 U/mL，比初始培養(yǎng)基提高了101%。

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化糊精質(zhì)量濃度提高AmyK產(chǎn)量（圖2（b））。糊精質(zhì)量濃度低于40 g/L時(shí)，菌體量和AmyK胞外酶活隨糊精質(zhì)量濃度的提高而增加。糊精初始質(zhì)量濃度分別為40 g/L和32 g/ L時(shí)，OD600和AmyK胞外酶活達(dá)到最大值，分別為34.41，417.36 U/mL。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基糊精的最佳質(zhì)量濃度為32 g/L。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，糊精初始質(zhì)量濃度低于40 g/L的發(fā)酵液均呈明顯堿性，而糊精初始質(zhì)量濃度為44 g/L時(shí)，發(fā)酵液pH較接近7。糊精質(zhì)量濃度過高引起發(fā)酵液pH的下降，可能是導(dǎo)致AmyK產(chǎn)量大幅下降的重要原因。

圖2　碳源對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effect of carbon source on biomass，pH，and AmyK production

2.2.2氮源對重組菌生長和AmyK產(chǎn)量的影響以32 g/L的糊精為碳源，按照含氮質(zhì)量濃度相等的原則，優(yōu)化TB培養(yǎng)基中的氮源（圖3（a））。重組菌對安琪酵母的利用效果最好，OD600達(dá)到52，蛋白胨、酵母粉其次，OD600為28.08。除以安琪酵母、玉米漿為氮源外，發(fā)酵結(jié)束pH為8左右。以蛋白胨、酵母粉為氮源，胞外AmyK酶活最高達(dá)390 U/mL。安琪酵母雖然適于菌體生長，但不能同時(shí)促進(jìn)菌體產(chǎn)酶。以尿素、玉米漿為氮源時(shí)，菌體生長很差，酶活也很低。因此，蛋白胨、酵母粉為產(chǎn)AmyK最適氮源。保證蛋白胨、酵母粉質(zhì)量的比例為1∶2，優(yōu)化蛋白胨、酵母粉的質(zhì)量濃度提高AmyK產(chǎn)量（圖3 （b））。菌體量和AmyK酶活均隨蛋白胨、酵母粉質(zhì)量濃度的增加先增加后減小，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度20 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度40 g/L時(shí)，OD600最大達(dá)35.58；當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度12 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度24 g/L時(shí)，胞外酶活最高達(dá)400 U/mL。發(fā)酵結(jié)束pH也隨蛋白胨、酵母粉質(zhì)量濃度的增加先升高后降低，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度8 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度16 g/ L時(shí)，pH最高8.6。因此，最適產(chǎn)酶氮源為蛋白胨質(zhì)量濃度12 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度24 g/L。

圖3　氮源對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effect of nitrogen source on biomass，pH，and AmyK production

2.2.3碳酸鈉對重組菌生長和AmyK產(chǎn)量的影響碳源種類優(yōu)化結(jié)果表明，偏堿性的環(huán)境可能促進(jìn)AmyK表達(dá)。因此，發(fā)酵過程中調(diào)控pH有望進(jìn)一步提高AmyK的產(chǎn)量。目前，Na2CO3作為一種重要的pH調(diào)節(jié)劑已被廣泛用于pH的調(diào)節(jié)［20-22］。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明Na2CO3質(zhì)量濃度高于0.6 g/dL時(shí)，發(fā)酵液pH高于9.3，因B.subtilis耐受堿能力差，生物量急劇下降而使AmyK產(chǎn)量很低（結(jié)果未顯示）。因此，Na2CO3質(zhì)量濃度選擇0.1～0.6 g/dL，分別于發(fā)酵開始后12、18、24、30 h添加，結(jié)果見圖4。于12 h添加Na2CO3，隨著Na2CO3質(zhì)量濃度增加，發(fā)酵結(jié)束pH先下降后緩慢上升，OD600無明顯規(guī)律，添加Na2CO3未能提高AmyK產(chǎn)量。18 h添加效果同12 h。于24 h添加Na2CO3，隨著Na2CO3質(zhì)量濃度增加，發(fā)酵結(jié)束pH緩慢上升，OD600總體逐漸降低，Na2CO3質(zhì)量濃度為0.6 g/dL時(shí)，OD600只有20左右；胞外AmyK酶活先增加后減小，Na2CO3質(zhì)量濃度為0.2 g/dL時(shí)，胞外酶活最高達(dá)481.98 U/mL，較優(yōu)化前提高15%。30 h添加效果同24 h，Na2CO3質(zhì)量濃度為0.1 g/dL時(shí)，酶活最高達(dá)460.54 U/mL。根據(jù)發(fā)酵過程及結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇在菌體生長非?？斓膶?shù)時(shí)期（12 h，18 h）添加Na2CO3、提高外部pH并不能提高AmyK的產(chǎn)量，而選擇在菌體生長基本穩(wěn)定的穩(wěn)定期（24 h，30 h）添加Na2CO3卻能有效提高AmyK的產(chǎn)量。

Manabe［21］等的研究也表明，外部pH上移可提高B.subtilis產(chǎn)淀粉酶。一般認(rèn)為，其原因如下：在淀粉酶釋放到培養(yǎng)基之前直接提高其折疊效率和/或穩(wěn)定性；通過去質(zhì)子及細(xì)胞壁丙氨酸缺失，增加細(xì)胞壁的負(fù)電性，間接穩(wěn)定淀粉酶；膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶HtrA、HtrB活力下降；外部pH上移激活或抑制了相關(guān)基因簇，由此引起的次級(jí)效應(yīng)導(dǎo)致淀粉酶產(chǎn)量提高。

圖4　碳酸鈉濃度及添加時(shí)間對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effect of Na2CO3concentration and adding time on biomass，pH，and AmyK production

2.2.4接種量對重組菌生長和AmyK產(chǎn)量的影響

接種量直接決定接入發(fā)酵培養(yǎng)基的菌體量，因此對菌體生長有一定影響，進(jìn)而會(huì)影響重組菌株的產(chǎn)酶量。研究中針對不同接種量對菌體生長和產(chǎn)酶的影響進(jìn)行了探索，分析了接種量為體積分?jǐn)?shù)2%、4%、8%、12%、16%時(shí)重組菌的發(fā)酵情況，結(jié)果見圖5。隨著接種量的增加，酶活先增加后減小，接種量為體積分?jǐn)?shù)12%時(shí)，酶活最高達(dá)640.33 U/mL。

圖5　接種量對菌體生長和產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of inoculum size on biomass，and AmyK production

3　結(jié)語

堿性淀粉酶在堿性環(huán)境中可以保持穩(wěn)定并高效催化降解淀粉，廣泛應(yīng)用于紡織退漿、洗滌劑添加、淀粉加工、醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域。不同的酶都有其分泌表達(dá)的最適信號(hào)肽，因此產(chǎn)酶重組枯草芽胞桿菌構(gòu)建中對信號(hào)肽的選擇應(yīng)引起高度重視。此外，本課題組前期研究中將AmyK分別于E.coli和P. pastoris進(jìn)行表達(dá)，前者酶活只有60 U/mL，后者發(fā)酵周期長達(dá)120 h［16］。因此，進(jìn)行酶的異源表達(dá)時(shí)，宿主的選擇對于達(dá)到高發(fā)酵水平和高生產(chǎn)強(qiáng)度尤為重要。研究中通過信號(hào)肽篩選，將來源于A. amylolytica的堿性淀粉酶基因在B.subtilis中成功實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá)，并優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵液的pH。優(yōu)化后堿性淀粉酶酶活最高達(dá)640.33 U/ mL，比優(yōu)化前提高了336%，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到8.9 U/ （mL·h），比其在P.pastoris中提高了78%［16］。上述結(jié)果表明，B.subtilis是AmyK的理想表達(dá)宿主。此外，發(fā)酵過程中添加Na2CO3提高AmyK產(chǎn)量的策略，不僅為重組B.subtilis發(fā)酵罐上選擇優(yōu)化控制策略提供了有效依據(jù)，而且為其他酶類的發(fā)酵過程優(yōu)化提供了重要參考。

［1］Wang N，Zhang Y H，Wang Q H，et al.Gene cloning and characterization of a novel alpha-amylase from alkaliphilic Alkalimonas amylolytica［J］.Biotechnol J，2006，1（11）：1258-1265.

［2］吳襟，彭平，沈文，等.嗜堿性芽胞桿菌堿性α淀粉酶的純化和性質(zhì)［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2005，21（6）：852-856. WU Jin，PENG Ping，SHEN Wen，et al.Purification and characterization of α-amylase from an alkaliphilic Bacillus sp.strain BG-CSN［J］.Chin J Biochem Mol Biol，2005，21（6）：852-856.（in Chinese）

［3］Burhan A，Nisa U，Gokhan C，et al.Enzymatic properties of a novel thermostable，thermophilic，alkaline and chelator resistantamylase from an alkaliphilic Bacillus sp.isolate ANT-6［J］.Process Biochem，2003，38（10）：1397-1403.

［4］Hagihara H，Igarashi K，Hayashi Y，et al.Novel alpha-amylase that is highly resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the alkaliphilic Bacillus isolate KSM-K38［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67（4）：1744-1750.

［5］Kuilderd H，Wu G.Applied technology-simultaneous desizing and scouring with enzymes-simultaneous fabric desizing and scouring，using alkaline alpha-amylase and an alkaline scouring enzyme，reduces water［J］.AATCC Rev-Am Assoc Text Chem Color，2008，8（6）：33-36.

［6］楊海泉，劉龍，李江華，等.堿性淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2012，28（4）：432-439. YANG Haiquan，LIU Long，LI Jianghua，et al.Advances of alkaline amylase production and applications［J］.Chin J Biotech，2012，28（4）：432-439.（in Chinese）

［7］Hashim S O，Delgado O，Hatti-Kaul R，et al.Starch hydrolysing Bacillus halodurans isolates from a Kenyan soda lake［J］. Biotechnol Lett，2004，26（10）：823-828.

［8］Malhotra R，Noorwez S M，Satyanarayana T.Production and partial characterization of thermostable and calcium-independent alpha-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP54［J］.Lett Appl Microbiol，2000，31（5）：378-384.

［9］Horikoshi K.Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms［J］.Agri Biol Chem，1971，35（11）：1783-1791.

［10］Murakami S，Nishimoto H，Toyama Y，et al.Purification and characterization of two alkaline，thermotolerant α-Amylases from Bacillus halodurans 38C-2-1 and expression of the cloned gene in Escherichia coli［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2007，71 （10）：2393-2401.

［11］Murakami S，Nagasaki K，NishimotoH，etal.Purificationandcharacterizationof fivealkaline，thermotolerant，and maltotetraose-producing α-amylases from Bacillus halodurans MS-2-5，and production of recombinant enzymes in Escherichia coli［J］.Enzyme Microb Technol，2008，43（4-5）：321-328.

［12］Fu L L，Xu Z R，Li W F，et al.Protein secretion pathways in Bacillus subtilis：Implication for optimization of heterologous protein secretion［J］.Biotechnol Adv，2007，25（1）：1-12.

［13］Palva I.Molecular cloning of alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens and its expression in B.subtilis［J］.Gene，1982，19（1）：81-87.

［14］Rey M W，Ramaiya P，Nelson B A，et al.Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species［J］.Genome Biol，2004，5（10）：r77-12.

［15］Wong S L.Advances in the use of Bacillus Subtilis for the expression and secretion of heterologous proteins［J］.Curr Opin Biotechnol，1995，6（5）：517-522.

［16］Yang H Q，Liu L，Shin Hyun-dong，et al.Comparative analysis of heterologous expression，biochemical characterization optimal production of an alkaline α-amylase from alkaliphilic Alkalimonas amylolytica in Escherichia coli and Pichia pastoris［J］. Biotechnol Prog，2013，29（1）：39-47.

［17］Reilly B E，Spizizen J.Bacteriophage deoxyribonucleate infection of competent Bacillus subtilis［J］.J Bacteriol，1965，89：782-790.

［18］蔣嵐，楊永華，龔毅，等.稀有密碼子對proUK基因在大腸桿菌中高表達(dá)的影響［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1999，15（1）：64-67. JIANG Lan，YANG Yonghua，GONG Yi，et al.The rare coden effects the overexpression of Human proUK Gene in Escherichia coli［J］.Chin J Biotech，1999，15（1）：64-67.（in Chinese）

［19］Fuwa H.A new method for microdetermination of amylase activity by the use of amylose as the substrate［J］.J Biochem，1954，41：583-603.

［20］Galyuk E N，Lando D Y，Egorova V P，et al.Na2CO3influence on DNA double helix stability：Strong anion destabilizing effect［J］. J Biomol Struct Dyn，2003，20（6）：801-809.

［21］Manabe K，Kageyama Y，Tohata M，et al.High external pH enables more efficient secretion of alkaline alpha-amylase AmyK38 by Bacillus subtilis［J］.Microb Cell Fact，2012（11）：74.

［22］Whang L M，Yang K H，Yang Y F，et al.Microbial ecology and performance of ammonia oxidizing bacteria（AOB）in biological processes treating petrochemical wastewater with high strength of ammonia：effect of Na2CO3addition［J］.Water Sci Technol，2009，59（2）：223-231.

Construction and Fermentation Optimization of a Recombinant Bacillus subtilis Producing Alkaline Amylase

WANG Jingli1，LIU Song1，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Alkaline amylase，which could efficiently hydrolyze starch under alkaline conditions，has been widely used in textile desizing field，detergent industry，and pharmaceutical production.In this study，alkaline amylase from Alkalimonas amylolytica（AmyK）was screened through signal peptide and expressed in Bacillus subtilis WB600.The fermentation condition of the recombinant strain was then optimized.The extracellular AmyK activity of the recombinant B.subtilis could reach a maximal level of 146.86 U/mL with 51 h fermentation mediated by ywbN signal peptide.There was a protein band observed in the culture supernatant which was consistent for the theoretical molecular weight of 60 kDa for AmyK.The fermentation medium was optimize via a single factor test and determined as dextrin of 32 g/L，tryptone of 12 g/L，yeast extract of 24 g/L，KH2PO4of 2.32 g/L，andK2HPO4·3H2O of 16.43 g/L with pH regulated by 0.2%w/v Na2CO3after 24 h fermentation.The AmyK activity reached to 640.33 U/mL after 72 h，increasing by 336%when compared with the initial medium，which was the highest yield of alkaline amylase for the reported recombinant B. subtilis strains.This study provided a experimental support for the commercial production of AmyK from fermentation.

alkalineamylase，signalpeptide，recombinantBacillus subtilis，fermentationoptimization，sodium carbonate

Q 813

A

1673—1689（2016）03—0296—07

2014-11-21

國家863計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA022202，2011AA100905）；教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IRT1135）。

堵國成（1965—），男，江蘇常州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵過程優(yōu)化與控制、酶工程與技術(shù)、代謝工程技術(shù)的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn