β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖

李美玲，江波，張濤（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

β-半乳糖苷酶催化乳糖合成低聚半乳糖

李美玲，江波*，張濤
（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

通過對環(huán)狀芽孢桿菌B.circulans SK28.003的發(fā)酵獲得β-半乳糖苷酶酶液，經(jīng)過濃縮、鹽析沉淀和低溫冷凍干燥，制備酶粉。利用β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷功能催化乳糖合成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS），采用單因素和正交試驗優(yōu)化，通過高效液相色譜法檢測，以GOS產(chǎn)率為評價指標(biāo)，確定最佳合成條件為：乳糖起始質(zhì)量濃度為50 g/dL，加酶量為6 U/g，反應(yīng)溫度為60℃，pH 7.5。在此條件下反應(yīng)12 h，GOS產(chǎn)率可達45.5%。

β-半乳糖苷酶；低聚半乳糖；轉(zhuǎn)糖苷功能；條件優(yōu)化；正交試驗

益生元作為一種促進健康的食品成分，近年來受到越來越多的關(guān)注［1］。大部分益生元是非消化性的寡糖，其中低聚半乳糖（GOS）已被證實能夠發(fā)揮益生的作用［2］。GOS是母乳中天然含有的益生元，大量臨床試驗表明，它能夠改善腸道菌群，提高免疫系統(tǒng)，具有降低血脂，增強抗腫瘤、抗衰老的功能［3-4］。GOS具有輕微的甜味，約為蔗糖甜味的30%～60%，同時GOS不會被胰酶和胃液消化，從而具有更低的GI（血糖生成指數(shù)）值，熱量只有蔗糖的一半［5］。GOS因為其具有上述諸多健康益處而成為功能性食品領(lǐng)域的關(guān)注焦點［6］。

GOS含有2～10個半乳糖單元和一個終端葡萄糖單元，之間主要由β-（1→4）-或β-（1→6）鍵連接而成［7］，化學(xué)結(jié)構(gòu)為（Galactose）n-Glucose，n為1—10，如圖1所示。

圖1　低聚半乳糖結(jié)構(gòu)Fig.1　Structure of galactooligosaccharides

利用酶法合成GOS被認為是最有效的生產(chǎn)途徑之一，糖苷酶因其所需反應(yīng)條件簡單、酶來源廣泛、價格低廉等優(yōu)點，在酶法合成中被廣泛采用［8］。酶法合成中通常是利用其水解反應(yīng)的逆反應(yīng)即轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)獲得所需的產(chǎn)物［9］。

工業(yè)上β-半乳糖苷酶是一種重要的生物催化劑，具有催化乳糖水解和轉(zhuǎn)糖苷兩種功能。傳統(tǒng)意義上利用其水解活性來減少食物中的乳糖含量及處理廢水［10］。然而，近年來，β-半乳糖苷酶常用作轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的催化劑，進而合成低聚半乳糖、乳果糖和低聚乳果糖等。

β-半乳糖苷酶可以從多種微生物中得到，例如環(huán)狀枯草桿菌、米曲霉、黑曲霉、乳酸克魯維酵母和脆壁氏酵母等，不同來源的酶的轉(zhuǎn)糖基活性不同，生成的GOS產(chǎn)品類型和產(chǎn)量也有顯著差異［11］。

本研究中利用環(huán)狀芽孢桿菌B.circulans SK28.003發(fā)酵獲得β-半乳糖苷酶酶液，該酶為胞外酶，酶蛋白質(zhì)主要存在于發(fā)酵液，發(fā)酵液離心后去掉菌體即可得到酶液。然后利用超濾膜分離技術(shù)除去多余的水，不僅酶蛋白液起到濃縮作用，而且提高了單位體積發(fā)酵液的酶活力，便于β-半乳糖苷酶濃縮液進行硫酸銨沉淀，以及酶沉淀，進行低溫真空冷凍干燥制取酶粉。通過該流程制備得到粗酶粉，有利于β-半乳糖苷酶保藏和后續(xù)工藝生產(chǎn)。

文中重點探討以乳糖為底物，通過β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷作用制得GOS，確定了底物質(zhì)量濃度、加酶量、溫度、緩沖液pH值等關(guān)鍵條件對合成工藝的影響，為工業(yè)利用β-半乳糖苷酶合成GOS提供了科學(xué)依據(jù)［12］。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種環(huán)狀芽孢桿菌B.circulans SK28.003，江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室保藏。

1.1.2主要試劑乳糖、葡萄糖、NaCl、MnSO4·H2O、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、（NH4）2SO4（均為分析純），國藥集團產(chǎn)品或經(jīng)銷；蛋白胨（魚粉）、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，oNPG）、酵母膏（均為生化試劑），國藥集團產(chǎn)品或經(jīng)銷。

1.1.3培養(yǎng)基

1）種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5，MnSO4·H2O 0.005；pH 7.0。

2）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：乳糖10，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5，MnSO4·H2O 0.005；pH 7.0。

1.1.4主要儀器設(shè)備Sartorius stedim發(fā)酵罐，德國BIOSTATC Plus公司制造；GL-10MD大容量高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司制造；冷凍干燥機，美國LABCONCO公司制造；Pellicon超濾器，美國Millipore公司制造；恒溫水浴鍋，江蘇億通儀器設(shè)備公司制造；1200型高效液相色譜儀器，美國Agilent公司制造；RI101型示差折光檢測器，日本Shodexgo公司制造；DEL320 pH儀器，梅特勒-托利多實驗儀器有限公司制造；Alpha-1系列紫外可見光分光光度計，上海譜元儀器有限公司制造。

1.2實驗方法

1.2.1酶粉的制備

1）種子培養(yǎng)條件：配制500 mL種子培養(yǎng)基，高溫滅菌（121℃，20 min），接種環(huán)狀芽孢桿菌B. circulans SK28.003，30℃培養(yǎng)24 h，作為種子液。

2）發(fā)酵產(chǎn)酶條件：發(fā)酵培養(yǎng)基20 L，裝入30 L的發(fā)酵罐，經(jīng)高溫滅菌（121℃，20 min），冷卻至30℃，將種子液接入，在30℃、pH 7.0、0.1 mPa、200 r/min及通氣量1 L/（L·min）的條件下發(fā)酵80 h。

3）發(fā)酵后處理：將發(fā)酵液20 L離心（4℃，8 000 r/min，20 min），除去菌體，上清液即為β-半乳糖苷酶。

4）超濾濃縮：將離心后所獲上清液超濾濃縮，超濾的發(fā)酵液體積為18 L；進口壓力為20～25 Psi，循環(huán)口壓力為5～10 Psi，壓力差控制在10 Psi，1 Psi=6.895 kPa；料液溫度為25℃。

5）鹽析沉淀：采用硫酸銨分級沉淀的方法沉淀超濾濃縮后的酶液，即先在硫酸銨飽和度40%時沉淀除去一部分雜蛋白質(zhì)，然后繼續(xù)緩慢添加硫酸銨使體系最終硫酸銨飽和度為60%，充分攪拌均勻，使硫酸銨完全溶解后，在0～4℃條件下靜置4 h；收集所得沉淀物，用少量50 mmol/L、pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液溶解沉淀，并在相同的緩沖液中透析脫鹽。

6）冷凍干燥：除鹽后的濃縮酶液在-20℃冰箱內(nèi)預(yù)凍4 h后轉(zhuǎn)移至低溫冷凍干燥機的物料盤內(nèi)，冷阱溫度-80℃，冷凍干燥24 h制得酶粉，可于4℃冰箱中長期保存。

1.2.2β-半乳糖苷酶酶活力的測定準(zhǔn)確稱取一定量的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside，oNPG）粉末和自制酶粉，分別用0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液配制成1 mg/mL的oNPG溶液和1 mg/mL的酶液，取2.0 mL oNPG溶液在60℃保溫10 min，然后加入0.5 mL酶液，振蕩混勻后在60℃下計時反應(yīng)15 min，加入2.5 mL濃度0.15 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)?？瞻讓嶒瀸φ障燃覰a2CO3溶液再加酶液，測定420 nm下的吸光度，計算酶活力［13］。酶活力單位定義：在上述檢測條件下，每分鐘催化oNPG生成1 μmol鄰硝基苯酚（o-nitrophenol，oNP）所需要的酶量定義為1個單位酶活（即1 U）。

1.2.3GOS的合成依次改變GOS合成條件中的乳糖起始質(zhì)量濃度、加酶量、反應(yīng)溫度和pH值，將10 g不同質(zhì)量濃度的乳糖溶液置于50 mL酶反應(yīng)器中，加入一定量的β-半乳糖苷酶，置于一定溫度的恒溫體系中攪拌反應(yīng)，定時取樣分析產(chǎn)物中糖類物質(zhì)的組成。

1.2.4GOS產(chǎn)率的測定測定方法采用高效液相色譜法（HPLC）。色譜測定條件：Agilent 1260型高效液相色譜-示差折光檢測器，色譜柱為Asahipak NH2P-504E，柱溫30℃，流動相為V（乙腈）∶V（水）＝65∶35，體積流量1.0 mL/min，進樣量10 μL。在不同的工藝參數(shù)下反應(yīng)，然后根據(jù)各糖類物質(zhì)在HPLC上的峰面積，用歸一化法計算GOS產(chǎn)率（GOS占總糖的面積分數(shù)）［14］。

2　結(jié)果與討論

2.1乳糖起始質(zhì)量濃度對GOS合成的影響

在60℃和加酶量6 U/g的條件下以0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解不同質(zhì)量濃度的乳糖，考察不同乳糖起始質(zhì)量濃度對GOS產(chǎn)率的影響。乳糖起始質(zhì)量濃度是影響GOS合成的重要因素，但在該反應(yīng)溫度下，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度大于60 g/dL時，乳糖溶液會有結(jié)晶析出，故實驗選用20～60 g/dL的起始質(zhì)量濃度進行研究。

在24 h內(nèi)每隔一定時間取樣測定GOS產(chǎn)率，以GOS產(chǎn)率對時間作圖得到圖2。β-半乳糖苷酶合成GOS的產(chǎn)率與乳糖起始質(zhì)量濃度有很大的相關(guān)性。當(dāng)乳糖起始質(zhì)量濃度為20 g/dL時，反應(yīng)12 h 后GOS產(chǎn)率達到最大值42.1%。隨著乳糖質(zhì)量濃度的增加，GOS的產(chǎn)率也隨之增加，并且達到GOS最高產(chǎn)率所需的時間也延長。當(dāng)乳糖起始質(zhì)量濃度提高至50 g/dL時，GOS最高產(chǎn)率提高了8.6%，反應(yīng)16 h后產(chǎn)率達到45.7%。而當(dāng)乳糖起始質(zhì)量濃度增至60 g/dL時，GOS的最高產(chǎn)率明顯下降到35.9%，同時反應(yīng)速率減小。以上現(xiàn)象是因為，當(dāng)乳糖溶液質(zhì)量濃度水平較低時，反應(yīng)體系中水分含量較高，更多的水分子有機會與β-半乳糖苷酶受體結(jié)合，從而發(fā)生水解反應(yīng)，影響了GOS的合成；而隨著乳糖起始質(zhì)量濃度的提高，乳糖分子作為β-半乳糖苷酶受體的機會增多，則更容易與酶-半乳糖基復(fù)合物結(jié)合，發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，生成GOS［15］。然而，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度由50 g/dL繼續(xù)增加至60 g/dL時，GOS的產(chǎn)率反而減小，這可能是因為在高乳糖質(zhì)量濃度下酶的活性受到抑制，反應(yīng)體系的黏度增加，不利于傳質(zhì)，同時乳糖有少量析出。綜合考慮原料的充分利用以及高質(zhì)量濃度下乳糖不易溶解和黏度大等因素，選取50 g/dL的乳糖起始質(zhì)量濃度進行后續(xù)的實驗。

2.2加酶量對GOS合成的影響

在60℃，以0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解50 g/dL的乳糖，探究不同的β-半乳糖苷酶添加量對GOS合成產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖3所示。

當(dāng)加酶量為4 U/g時，反應(yīng)18 h后GOS產(chǎn)率接近42.2%，并繼續(xù)呈增加趨勢；當(dāng)加酶量為6 U/g時，反應(yīng)12 h后GOS產(chǎn)率即達到45.5%；當(dāng)加酶量提高到8 U/g和10 U/g時，反應(yīng)10 h達到最高產(chǎn)率，分別為45.1%和45.6%，但隨著反應(yīng)時間的延長，GOS的產(chǎn)率小幅下降，這可能是因為生成的GOS部分又被水解所致。總體來講，隨著β-半乳糖苷酶添加量的增多，GOS的產(chǎn)率也隨之提高，并且達到GOS最高產(chǎn)率時所需的時間縮短。因此，加酶量的提高可以促進在更短的時間內(nèi)生成更多的GOS，但當(dāng)加酶量超過6 U/g后，GOS的最高產(chǎn)率并沒有明顯增加。這是因為在反應(yīng)體系中酶以酶與底物絡(luò)合物的形式存在，當(dāng)加酶量較低時，這時酶與底物絡(luò)合物的質(zhì)量濃度不高，因此合成GOS的速率較慢，產(chǎn)率較小。隨著加酶量的增加，酶與底物絡(luò)合物的質(zhì)量濃度增加，合成GOS的產(chǎn)率也增加。而加酶量過高時，由于過剩的酶沒有被充分利用，會導(dǎo)致酶浪費，從而在實際生產(chǎn)中造成成本增加。綜合考慮時間效益、酶的利用效率以及GOS產(chǎn)率，選用加酶量6 U/g進行后續(xù)試驗。

圖2　乳糖起始質(zhì)量濃度對GOS合成的影響Fig.2　Effects of the initial lactose concentrations on GOS synthesis

圖3　加酶量對GOS合成的影響Fig.3　Effects of the loading amount of β-galactosidase on GOS synthesis

2.3反應(yīng)溫度對GOS合成的影響

在加酶量為6 U/g的條件下以0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解50 g/dL的乳糖，探究不同溫度對GOS合成產(chǎn)率的影響，在24 h內(nèi)每隔一定時間取樣測定GOS產(chǎn)率，以GOS產(chǎn)率對時間作圖4。

圖4　反應(yīng)溫度對GOS合成的影響Fig.4　Effects of temperatures on GOS synthesis

由圖4可知，不同溫度下達到GOS最高產(chǎn)率所需的時間也不同。溫度越高，達到最大值所需的時間越短。當(dāng)反應(yīng)溫度低于50℃時，反應(yīng)24 h GOS產(chǎn)率仍未達到最高。在70℃下反應(yīng)8 h GOS產(chǎn)率達到43.9%，之后不再增加，這是因高溫下酶蛋白質(zhì)變性所致。在60℃，前8 h內(nèi)，酶反應(yīng)速率較快，GOS的產(chǎn)率快速增加；8～12 h內(nèi)，GOS的產(chǎn)率緩慢增加，到第12小時GOS產(chǎn)率達到最大值45.49%，這一過程反應(yīng)速率開始下降，這與β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性有關(guān)。在60℃，一開始酶的催化活性較高，但經(jīng)長時間反應(yīng)，酶活力會有下降的趨勢。因此，在酶不快速失活的前提下，提高反應(yīng)溫度，可以促進反應(yīng)體系中分子間的相互作用，提高反應(yīng)速率，從而促進GOS的生成；而且提高溫度還能增加底物乳糖的溶解度。綜合上述，選取最適溫度為60℃。

2.4pH值對GOS合成的影響

在60℃和加酶量6 U/g條件下以0.1 mol/L、不同pH的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解50 g/dL的乳糖，探究不同pH對GOS合成產(chǎn)率的影響。在24 h內(nèi)每隔一定時間取樣測定GOS產(chǎn)率，以GOS產(chǎn)率對pH作圖得到圖5。

圖5　pH對GOS合成的影響Fig.5　Effects of pH values on GOS synthesis

由圖5可知，當(dāng)pH為4.5.和5.5時，反應(yīng)速率緩慢，且所得GOS產(chǎn)率較低，這是因為在酸性條件下，酶的催化活性降低。在pH 6.5～8.5的范圍，反應(yīng)速率明顯加快，最大GOS產(chǎn)率相差不大，可知在此pH區(qū)間，β-半乳糖苷酶的活性比較穩(wěn)定。其中，當(dāng)pH為7.5時，GOS產(chǎn)率最大。這比之前Song等人［16］報道的最適pH 7.0高0.5個單位，比Hua等人［17］報導(dǎo)的最適pH 8.0低0.5個單位，這可能是因為酶的來源不同，但最適pH區(qū)間結(jié)論一致。綜上所述，確定該反應(yīng)體系最適pH為7.5。

2.5正交試驗

利用正交試驗綜合考察不同因素和水平對GOS合成的交互影響，選取乳糖起始質(zhì)量濃度、加酶量、反應(yīng)溫度、pH值，進行四因素三水平的正交試驗，以GOS產(chǎn)率為評價指標(biāo)，結(jié)果見表1。

表1　酶反應(yīng)正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 1　Orthogonal experiment design of β-galactosidase reaction and results

正交試驗數(shù)據(jù)極差R分析結(jié)果表明，對GOS產(chǎn)率影響的主次順序為：加酶量＞溫度＞pH＞乳糖起始質(zhì)量濃度。得到最佳條件：加酶量為8 U/g，反應(yīng)溫度為60℃，pH 6.5，乳糖起始質(zhì)量濃度為50 g/dL。此時GOS最高產(chǎn)率達45.9%。

比較初步優(yōu)化和正交優(yōu)化的結(jié)果可以看出，兩者的最高GOS產(chǎn)率僅相差0.4%，乳糖起始質(zhì)量濃度和溫度相同，但加酶量和pH不同，原因可能在于4個主要因素的交互作用。從加酶量上初步優(yōu)化條件優(yōu)于正交優(yōu)化條件，更有利于節(jié)約成本。

3　結(jié)語

以作者所在實驗室儲藏的環(huán)狀芽孢桿菌B. circulans SK28.003為酶源菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，并經(jīng)過濃縮、鹽析沉淀和冷凍干燥制得酶粉。探究起始乳糖質(zhì)量濃度、加酶量、反應(yīng)溫度、pH值等因素對β-半乳糖苷酶催化乳糖合成GOS的影響，并通過正交實驗確定最佳工藝條件：乳糖起始質(zhì)量濃度為50 g/dL，加酶量為6 U/g，反應(yīng)溫度為60℃，以0.1 mol/L、pH7.5的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液溶解乳糖。在此條件下，GOS產(chǎn)率可達45.5%。

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Synthesis of Galactooligosaccharides from Lactose by β-Galactosidase

LI Meiling，JIANG Bo*，ZHANG Tao
（Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Beta-galactosidase solution was obtained through the fermentation of Bacillus circulans SK28.003，and its powder was prepared from the concentration of its solution，salting and precipitation，and freeze drying.To increase the efficiency of transgalatosylation and GOS yields，the optimal reaction conditions，such as initial lactose concentrations，loading amount of the enzyme，temperatures and pH values of the buffer，were determined through single factor and orthogonal experiments.Using the yields of GOS as the evaluation index，the maximum GOS yield was achieved up to 45.5%after 12 h synthesis when the reaction conditions were at 60℃，50 g/dL initial lactose concentration，6 U/g lactose in 0.1 M，and sodium phosphate buffer at pH 7.5.

β-galactosidase，galactooligosaccharides，transgalactosylation，optimization，orthogonal experiment

Q 814.9

A

1673—1689（2016）03—0234—06

2014-12-04

國家863計劃項目（2013AA102102）；國家自然科學(xué)基金重點項目（31230057）。

江波（1962—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶學(xué)研究。E-mail：bjiang@jiangnan.edu.cn