丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響①

賈玉鳳，吳慶文，程月發(fā)，陳　娟，孟　奇

丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響①

賈玉鳳1，吳慶文1，程月發(fā)2，陳娟1，孟奇3

目的研究丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬相關(guān)因子的影響，探討丁苯酞對帕金森病細(xì)胞模型的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法將SH-SY5Y細(xì)胞分為空白對照組（A組）、MPP+組（B組）、雷帕霉素預(yù)處理+MPP+組（C組）和丁苯酞預(yù)處理+MPP+組（D組）。采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法測定細(xì)胞相對存活率，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，Western blotting檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表達(dá)。結(jié)果B組SH-SY5Y細(xì)胞存活率顯著低于A組（t=20.270，P＜0.001），C組和D組顯著高于B組（t＞8.770，P＜0.001），且C組和D組間無顯著性差異（t=2.270，P=0.064）。與A組相比，B組LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加（t＞6.647，P＜0.01）；C組和D組明顯高于B組（t＞3.630，P＜0.01），C組與D組間無顯著性差異（t＜2.238，P≥0.05）。結(jié)論丁苯酞可以提高M(jìn)PP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y損傷細(xì)胞存活率，其可能通過誘導(dǎo)帕金森病模型細(xì)胞自噬，發(fā)揮治療作用。

丁苯酞；帕金森病；SH-SY5Y細(xì)胞；自噬；大鼠

［本文著錄格式］賈玉鳳，吳慶文，程月發(fā)，等.丁苯酞對1-甲基-4-苯基吡啶離子誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（4）：422-427.

CITED AS：Jia YF，Wu QW，Cheng YF，et al.Effect of butylphthalide on autophagy of SH-SY5Y cells induced by l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：422-427.

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株

SH-SY5Y細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2藥物與試劑

丁苯酞：中國食品藥品檢定研究院。MPP+、噻唑藍(lán)（MTT）：SIGMA公司。DMEM/F12=1∶1培養(yǎng)基、胰酶（trypsin）、胎牛血清（FBS）：GIBICO公司。磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH）抗體：華安生物技術(shù)有限公司。LC3抗體：MBL公司。Beclin 1抗體：北京博奧森生物工程有限公司。引物由INVITROGEN公司設(shè)計(jì)合成。

1.3儀器

CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma）、酶標(biāo)儀、PCR儀、Gel DocTM EZ Imager：意大利BIO-RAD公司。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡：OLYMPUS公司。超凈工作臺(tái)：中國蘇州凈化設(shè)備廠。低溫離心機(jī)：日本日立公司。凝膠成像系統(tǒng)：意大利BIO-RAD公司。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將SH-SY5Y細(xì)胞株置于DMEM/F12=1∶1培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml），37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，2～3 d換一次培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待達(dá)到80%～90%細(xì)胞匯合后，按1∶2對細(xì)胞進(jìn)行傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分4組，分別是空白對照組（A組）、MPP+組（B組）、雷帕霉素預(yù)處理+ MPP+組（C組）和丁苯酞預(yù)處理+MPP+組（D組）。

A組：細(xì)胞正常含血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

B組：待達(dá)到70%～80%細(xì)胞匯合后的3 h之后向培養(yǎng)基中加入1 mmol/L的MPP+繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

C組：待達(dá)到70%～80%細(xì)胞匯合后向培養(yǎng)基中加入200 nmol/L的雷帕霉素培養(yǎng)3 h后再加入1 mmol/L的MPP+繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

D組：待達(dá)到70%～80%細(xì)胞匯合后向培養(yǎng)基中加入10 μmol/L丁苯酞培養(yǎng)3 h后再加入1 mmol/L的MPP+繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.4.2 MTT比色法

采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率。以每孔（1～5）× 104個(gè)/ml的活細(xì)胞懸液100 μl接種于96孔板中，細(xì)胞干預(yù)情況同上，分別加入50 mg/ml的MTT 15 μl繼續(xù)孵育3 h，吸去培養(yǎng)基，加入150 μl的DMSO，搖床15 min，酶標(biāo)儀490 nm波長檢測吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。計(jì)算公式：

1.4.3 Western blotting

采用Western blotting檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。細(xì)胞干預(yù)情況同上，每孔加入100 μl裂解液，用細(xì)胞刮刮掉細(xì)胞，放入EP管中，超聲打碎，離心，取上清。用BCA試劑盒檢測樣品濃度進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性，SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，5%牛奶封閉1 h，LC3單克隆抗體（1∶1000），Beclin 1（1∶500）、GAPDH（1∶1000）一抗4℃搖床過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL顯色，用Image J軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，條帶灰度值表示蛋白表達(dá)含量，用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行校準(zhǔn)，計(jì)算各組蛋白相對表達(dá)含量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4.4 RT-PCR

細(xì)胞干預(yù)情況同上，按Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA；用Q3000型微量分光光度計(jì)測RNA濃度，根據(jù)所測濃度，計(jì)算出各組所需RNA的體積；按反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成；配置引物（引物序列見表1）；根據(jù)這4個(gè)基因序列的不同特點(diǎn)，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min，4℃保存。其中退火溫度依次為LC3-Ⅰ，58.5℃；LC3-Ⅱ，57℃；Beclin 1，60℃；β-actin，57℃。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，Gel DocTMEZ Imager掃描成像，用Image J軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，條帶灰度值表示基因表達(dá)含量，用內(nèi)參β-actin進(jìn)行校準(zhǔn)，計(jì)算出各組mRNA相對表達(dá)含量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

表1　引物序列

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞存活率

與A組比較，B組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.001）。與B組比較，C組和D組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.001）。C組和D組間無顯著性差異（P＞0.05）。見表2。

2.2 LC-3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白的表達(dá)

B組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達(dá)量明顯高于A組（P＜0.01），C組和D組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達(dá)量明顯高于B組（P＜0.01），C組和D組間無顯著性差異（P≥0.05）。見表3、圖1。

2.3 LC-3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1 mRNA的表達(dá)

B組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表達(dá)量明顯高于A組（P＜0.01），C組和D組LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表達(dá)量明顯高于B組（P＜0.01），C組和D組間無顯著性差異（P＞0.05）。見表4、圖2。

2.4細(xì)胞形態(tài)

B組的細(xì)胞大部分胞體腫脹變圓，突起結(jié)構(gòu)減少，貼壁細(xì)胞數(shù)目減少；C組和D組與B組相比，貼壁細(xì)胞增多，胞體和軸突完整，細(xì)胞間的突起聯(lián)系增多且細(xì)胞形態(tài)逐漸接近A組。見圖3。

表2　各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率比較（%）

圖1　Western blotting檢測各組細(xì)胞LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表達(dá)水平

圖2　RT-PCR檢測各組細(xì)胞LC3、Beclin 1 mRNA表達(dá)水平

圖3　各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化（光鏡，100×）

表3　各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1蛋白相對表達(dá)量

表4　各組細(xì)胞LC3-Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1的mRNA相對表達(dá)量

3　討論

研究表明，丁苯酞具有抗氧化應(yīng)激、保護(hù)線粒體，減少活性氧等功效［10-11］。Huang通過研究丁苯酞對細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，丁苯酞可降低由MPP+誘導(dǎo)對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，抑制線粒體的膜電位發(fā)生變化，減少細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用，增加細(xì)胞中谷胱甘肽的含量，同時(shí)也可降低α-突觸核蛋白的累積，進(jìn)而減少路易小體的形成［12］?；A(chǔ)研究及臨床研究均表明，丁苯酞對帕金森病有確切療效［13］。

自噬是細(xì)胞自我保護(hù)、自我更新的一種重要機(jī)制［14］。氧化應(yīng)激導(dǎo)致受損線粒體的降解及因泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）障礙而無法降解的異常蛋白的降解均需要自噬的參與［15-17］，及時(shí)降解多余的、受損的及衰老的蛋白與細(xì)胞器，可以防止氧化應(yīng)激的級聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)也為細(xì)胞重建、再生和修復(fù)提供必需原料，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

自噬受各種信號因子的調(diào)節(jié)影響，其中mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是雷帕霉素的靶分子，能抑制自噬的發(fā)生，而使用雷帕霉素抑制mTOR的活性能激活自噬。Beclin 1是酵母自噬相關(guān)基因Atg6/ Vps30的哺乳動(dòng)物同源基因，參與自噬體形成的初始步驟［18］。其通過與Bcl-2、UVRAG、mVps34、Barkor、死亡相關(guān)蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬［19-20］。有研究將表達(dá)Beclin 1的慢病毒轉(zhuǎn)染至α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦內(nèi)，α-突觸核蛋白在邊緣系統(tǒng)的積聚減少，神經(jīng)元突觸和樹突的病理改變在一定程度上得以改善［21-22］；而Beclin 1水平的下調(diào)可能導(dǎo)致自噬不足，從而加劇神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程［23］。當(dāng)自噬程序啟動(dòng)時(shí)，新合成的LC3前體經(jīng)加工形成其胞質(zhì)形式LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ被Atg7激活轉(zhuǎn)變成Atg3，并在其羧基端剪切22個(gè)氨基酸殘基形成LC3-Ⅱ，最終與磷脂（磷脂酰乙醇胺）結(jié)合形成膜連接的LC3-Ⅱ［24］。因此LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變是自噬體形成的標(biāo)志。

本研究結(jié)果顯示，4組中LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的蛋白表達(dá)及mRNA的表達(dá)依次增多，提示自噬途徑被激活，但由于MPP+組自噬的防御功能得不到充分發(fā)揮，過量的活性氧、異常聚集的α-synuclein及受損的細(xì)胞器將誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［25］。當(dāng)給予細(xì)胞丁苯酞或雷帕霉素預(yù)處理后，LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的蛋白表達(dá)及mRNA的表達(dá)均較MPP+組明顯升高，說明丁苯酞起上調(diào)自噬的作用。同時(shí)，兩預(yù)處理組細(xì)胞存活率也有所改善，說明適度提高自噬水平有助于保護(hù)受損的神經(jīng)元細(xì)胞，這與Crews等的研究結(jié)果［26］一致。

由上述研究結(jié)果可推測，丁苯酞可能通過上調(diào)自噬水平，防止受損細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性損傷來發(fā)揮保護(hù)作用，進(jìn)而控制帕金森病的發(fā)生發(fā)展，提高帕金森病患者生存質(zhì)量。

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Effect of Butylphthalide onAutophagy of SH-SY5Y Cells Induced by l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion

JIA Yu-feng1，WU Qing-wen1，CHENG Yue-fa2，CHEN Juan1，MENG Qi4
1.College of Nursing and Rehabilitation of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；2.Jitang College of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；3.West China School of Public Health，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041，China
Correspondence to WU Qing-wen，CHENG Yue-fa.E-mail：wxywqw@163.com（WU Qing-wen）；arthurcyf@163. com（CHENG Yue-fa）

Objective To observe the effects of butylphthalide on the expression of autophagy-related protein and mRNA in l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion（MPP+）-induced SH-SY5Y cells，and to explore the protective effect and possible mechanism of butylphthalide to the cell model of Parkinson's disease.Methods The SH-SY5Y cells were divided into control group（A），MPP+group（B），rapamycin pretreated+MPP+group（C）and Butylphthalide pretreated+MPP+group（D）.The relative viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+was measured with MTT assay，the morphology of SH-SY5Y cells was observed.The expression of microtubule associated protein 1 light chain 3（LC3）-II/I and Beclin 1 protein was detected by Western blotting.And the expression of LC3-II/I and Beclin 1 mRNA were assayed by real-time quantitative reverse transcription-PCR（RT-PCR）.Results The viability rates of cells were significantly lower in group B than in group A（t=20.270，P＜0.001），and were significantly higher in groups C and D than in group B（t＞8.770，P＜0.001），however，there was no significantly difference between groups C and D（t=2.270，P=0.064）.The expression of LC3-II/I and Beclin 1 was higher in group B than in group A（t＞6.647，P＜0.01），and was higher in groups C and D than in group B（t＞3.630，P＜0.01），however，there was no significantly difference between groups C and D（t＜2.238，P≥0.05）.Conclusion Butylphthalide could prevent the injury of SH-SY5Y cells induced by MPP+，which may affect Parkinson's disease by inducing autophagy.

butylphthalide；Parkinson's disease；SH-SY5Y cells；autophagy；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.011

R742.5

A

1006-9771（2016）04-0422-06

河北聯(lián)合大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（No.35647699）。

1.華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院，河北唐山市063000；2.華北理工大學(xué)冀唐學(xué)院，河北唐山市063000；3.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院，四川成都市610041。作者簡介：賈玉鳳（1988-），女，漢族，河北唐山市人，碩士研究生，主要研究方向：神經(jīng)康復(fù)。通訊作者：吳慶文（1966-），女，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：康復(fù)醫(yī)學(xué)、神經(jīng)康復(fù)。程月發(fā)（1967-），男，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：藥理學(xué)。E-mail：wxywqw@163.com（吳慶文）、E-mail：arthurcyf@163.com（程月發(fā)）。

帕金森病（Parkinson's disease）是一種以黑質(zhì)紋狀體致密部的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失、α-突觸核蛋白大量沉積為主要病理特征的神經(jīng)退行性疾病［1］，其病因及確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確。近年研究證實(shí)自噬途徑異常調(diào)控在帕金森病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用［2-3］。

自噬是細(xì)胞對外源性刺激的重要適應(yīng)性反應(yīng)［4］，其作為真核細(xì)胞中普遍存在的一種溶酶體依賴型途徑，對應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞存活、清除神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器或錯(cuò)誤折疊與聚集的蛋白質(zhì)具有重要作用。適度調(diào)節(jié)自噬水平已經(jīng)成為預(yù)防或治療神經(jīng)退行性病變的一條重要途徑［5-6］。

丁苯酞為脂溶性的藥物，可以直接通過血腦屏障發(fā)揮作用，具有改善線粒體功能、抗氧化應(yīng)激、抑制凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元再生、穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞等多種作用［7］，現(xiàn)已應(yīng)用于帕金森病的臨床治療［8］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是衰老和衰老相關(guān)疾病的一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）可通過抑制mTOR通路，誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬［9］。

1-甲基-4-苯基吡啶離子（l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion，MPP+）是神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）在腦內(nèi)的代謝產(chǎn)物，它能夠特異抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡，而人體神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞具有多巴胺能神經(jīng)元特性，因此，MPP+刺激神經(jīng)細(xì)胞能夠構(gòu)建帕金森病的細(xì)胞模型，這也是國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的帕金森病細(xì)胞模型。

本研究采用MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞建立帕金森病細(xì)胞模型，以自噬促進(jìn)劑雷帕霉素為對照，觀察丁苯酞預(yù)處理后，細(xì)胞存活率、形態(tài)變化和自噬相關(guān)因子Beclin 1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（microtubule associated protein 1 light chain 3β，LC3β）的表達(dá)及變化，探討丁苯酞治療帕金森病的作用機(jī)制。

（2015-11-16

2015-12-28）