兩種組織透明技術在免疫熒光染色觀察脊髓3D結構中的應用①

段紅梅，尚俊奎，郝　鵬，李千千，楊飛祥，楊朝陽，，李曉光，

兩種組織透明技術在免疫熒光染色觀察脊髓3D結構中的應用①

段紅梅1，尚俊奎2，郝鵬2，李千千1，楊飛祥2，楊朝陽1，2，李曉光1，2

目的觀察CUBIC和iDISCO兩種透明技術在脊髓免疫熒光染色中的效果。方法應用兩種組織透明技術處理1 mm厚脊髓冠狀切片，然后行神經(jīng)絲（NF）蛋白免疫熒光染色，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察染色效果。結果與CUBIC透明相比，iDISCO透明技術所需時間短，透明度高（F=6.64，P＜0.01），免疫熒光染色深（F=5117.55，P＜0.01）。結論應用iDISCO透明方法和免疫熒光染色相結合的方法可以完整觀察脊髓軸突，更加簡單快速，染色效果更好。

脊髓；透明；軸突再生；CUBIC；iDISCO；大鼠

［本文著錄格式］段紅梅，尚俊奎，郝鵬，等.兩種組織透明技術在免疫熒光染色觀察脊髓3D結構中的應用［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（4）：417-421.

CITED AS：Duan HM，Shang JK，Hao P，et al.Application of two kinds of tissue clearing method in observing 3D imaging of spinal cord with immunofluorescent staining［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：417-421.

傳統(tǒng)上對成年大鼠脊髓組織的形態(tài)研究，多采用組織切片后化學染色或免疫組織化學染色的方法進行觀察。組織切片限制了對整段脊髓中細胞分布和纖維聯(lián)系的完整觀察。例如，在脊髓軸突再生的研究中，損傷的軸突因為在組織切片制作過程中其連續(xù)性可能被破壞，導致在一個切片中僅能觀察到部分再生的軸突，不能很精準地對軸突再生的完整效果進行綜合評價［1］。另外，組織切片對再生軸突的走向和投射部位也不能詳細觀察。因此，理想的狀態(tài)應該是對整段脊髓進行染色觀察。

免疫熒光染色利用抗原與抗體相結合的原理可以對組織內(nèi)的目標蛋白進行可視化觀察。正常脊髓組織由灰質(zhì)和白質(zhì)組成，白質(zhì)主要包含由神經(jīng)元軸突聚集而成的上下傳導束，這些軸突纖維大部分由髓鞘包裹，脂質(zhì)含量豐富。故對整段脊髓染色時，抗體滲透能力有限。并且整段脊髓較厚，光學成像過程中，光在通過不同結構層時因神經(jīng)細胞和纖維束的折射率不同而出現(xiàn)散射，從而失去其激發(fā)和發(fā)射效率，導致獲得的圖像分辨率低、成像深度淺等問題［2-3］。

1　材料和方法

1.1實驗動物

成年雌性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量180～200 g，SPF級，首都醫(yī)科大學實驗動物部提供。

1.2取材

大鼠稱重，6%水合氯醛0.6 ml/100 g腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定，取出胸段脊髓，4%多聚甲醛4℃固定過夜。

1.3切片

應用振動切片機，選取T8脊髓節(jié)段行1 mm冠狀切片。

1.4染色及透明處理

1.4.1主要儀器、試劑及配制

CUBIC-1（試劑1）：25%尿素（SIGMA公司）+25%四乙二胺（SIGMA公司）+15%Triton X-100+35%蒸餾水。CUBIC-2（試劑2）：50%蔗糖+25%尿素+10%三乙醇胺（SIGMA公司）+0.1%Triton X-100+15%蒸餾水。四氫呋喃、二氯甲烷和芐醚：SIGMA公司。小鼠抗大鼠神經(jīng)絲（neurofilament，NF）單克隆抗體：中杉金橋；Alexa-Fluor594標記山羊抗小鼠熒光二抗：INVITROGEN公司。激光共聚焦掃描顯微鏡：LEICA。

1.4.2 CUBIC染色及透明方法

PBS洗30 min，共3次，20%蔗糖脫水，4℃至沉底；CUBIC-1中浸泡至透明（2 d）；PBS洗30 min，共3次，常溫；20%蔗糖脫水，4℃至沉底，OCT包埋，-80℃過夜；OCT解凍，PBS洗30 min，共3次；PBST（0.3%Triton，1×PBS）+10%山羊血清封閉，37℃過夜；NF一抗（1∶40）+PBST+3%山羊血清，37℃孵育3 d；PBS洗30 min，共3次，洗過夜；二抗（1∶200）+PBST+3%山羊血清，37℃孵育2 d；PBS洗30 min，共3次，洗1 d；20%蔗糖脫水，4℃至沉底；CUBIC-2中浸泡至透明。

1.4.3 iDISCO染色及透明方法

PBS洗30 min，共3次；室溫下20%、40%、60%、80%、100%甲醇/PBS溶液脫水，各30 min；100%甲醇1 h，共3次，4℃；5%H2O2/甲醇4℃12 h；80%甲醇/PBS 30 min室溫；80%、60%、40%、20%、0%甲醇/PBST各30 min室溫；PBST洗1 h，2次，室溫；PBST+10%DMSO+10%山羊血清封閉，37℃過夜；NF一抗+PTwH（0.2%Tween-20，1×PBS（含10 μg/ml肝素鈉））+3%山羊血清，37℃過60 h；PTwH洗10 min、15 min、30 min、1 h，洗過夜；二抗+PT-wH+3%山羊血清，37℃過48 h；PTwH洗10 min、15 min、30 min、1 h，洗1 d；50%、70%、80%四氫呋喃/H2O，各30 min，100%四氫呋喃30 min，共3次，二氯甲烷至沉底，約10 min，芐醚至透明10 min，儲存在芐醚中。

激光共聚焦掃描顯微鏡觀察染色效果。

1.5評價

對兩種方法的實驗所需時間、脊髓表面積變化、透明效果以及免疫熒光染色的深度進行比較。

應用傳統(tǒng)的數(shù)碼相機（關閉相機的自動白平衡功能）對透明前和透明后的冠狀脊髓切片進行照相。應用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計算透明前后脊髓切片的累積光密度值（IOD），并畫出透明前后脊髓的輪廓，然后計算其表面積（μm2）。

1.6統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料均采用（xˉ±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，獨立樣本t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1實驗所需時間、脊髓表面積變化和透明效果

CUBIC方法需要1 mm厚脊髓組織在試劑1中處理2 d，試劑2中處理1 d，整個透明過程為5 d，持續(xù)時間較長。iDISCO方法僅需要1 mm厚脊髓組織在四氫呋喃、二氯甲烷和芐醚中處理3～4 h即能完成透明過程，持續(xù)時間短。見圖1。

與透明前相比，CUBIC處理后的脊髓表面積增大約49.4%，iDISCO透明后脊髓表面積減少42.6%。

兩種方法對脊髓組織的透明效果顯示，CUBIC的透明效果未達肉眼透明，組織透明度為50%；iDISCO透明后脊髓能達到肉眼透明的效果，透明度達99.2%，兩種方法間存在顯著性差異（F=6.64，P＜0.01）。見圖2。

2.2免疫熒光染色深度

常規(guī)免疫熒光染色，即未經(jīng)透明處理的脊髓，只有表層可見NF陽性纖維，染色深度僅為30 μm（圖3A）。CUBIC處理后染色深度有所增加，為60 μm（圖3B）。iDISCO方法處理后染色深度進一步加深，脊髓深部也可見NF陽性信號，染色深度達150 μm，是常規(guī)染色的5倍，并且該方法的非特異性染色較弱（圖3C）。兩種方法染色深度有非常顯著性差異（F= 5117.55，P＜0.01）。

2.3提高染色效果

雖然iDISCO方法的染色效果更佳，但也存在一定的不足之處，如對組織深部的軸突不能很好染色，從而造成兩端的軸突能夠標記，但組織深部NF染色為陰性，導致軸突標記的不連續(xù)性（圖4A），限制了對軸突的完整追蹤觀察。進一步改善染色條件，在一抗孵育的第2天追加1/2初始量的抗體，染色深度增加，但脊髓深部的神經(jīng)纖維染色不均勻且不連續(xù)（圖4B），繼續(xù)增加抗體孵育時間，同時再次追加抗體，至第3天達到神經(jīng)纖維完整、連續(xù)的顯示（圖4C），有利于軸突染色的三維重建。

圖1　兩種方法染色和透明的具體流程

圖2　兩種透明方法的比較

圖3　三種條件下NF免疫熒光染色的深度

圖4　iDISCO下追加抗體后NF免疫熒光染色深度

3　討論

3.1透明效果

利用一定的方法使組織達到肉眼透明后，才能夠對完整組織進行3D觀察。兩種透明方法均能夠一定程度改善脊髓的透明效果。CUBIC透明的方法應用尿素等無毒的水溶性溶劑，需要脊髓組織在兩種溶劑中處理一定時間即可校正脊髓組織的折射率，提高透明度［13］。CUBIC的操作方法雖然簡單，但持續(xù)時間較長，而iDISCO透明方法在幾個小時內(nèi)就能使脊髓組織達到肉眼透明效果，透明時間短，但需要特殊的有機溶劑，這些有機溶劑多是有毒的，需要特殊的防護［14］。因此，兩種透明方法雖然都能改善脊髓組織的透明度，但各有優(yōu)缺點，可以根據(jù)自身的需要選擇相應的透明方法。

3.2染色深度

NF是細胞骨架蛋白，主要表達于神經(jīng)元的胞體和軸突，脊髓損傷后，軸突纖維斷裂，目前治療脊髓損傷的一個有效方法即促進長軸突的再生。本研究觀察兩種透明方法對脊髓NF免疫熒光染色的效果。應用免疫熒光染色方法進行完整組織觀察時，提高抗體的染色深度是對組織進行完整觀察的關鍵?？贵w因其滲透動力學的原因，有時不能達到組織內(nèi)部，從而僅能獲得淺表的組織染色，特別是組織中富含的蛋白染色，這樣不利于對深部組織進行觀察。iDISCO的方法中，Renier等提到此種方法在免疫熒光化學染色觀察中的優(yōu)勢。應用梯度甲醇對標本進行處理，有利于抗體的滲透，縮短抗體孵育時間，增加染色深度；同時，甲醇可能會對某些抗原表位有影響，不利于抗原與抗體的結合。因此，Renier等建議首先應用組織切片進行甲醇處理，了解甲醇是否影響抗原抗體的結合。另外，iDISCO的方法中，Renier等應用過氧化氫來減少組織的自發(fā)熒光，應用甘氨酸和肝素減輕背景著色［14］。CUBIC方法中，免疫熒光化學染色中，抗體也能夠滲透相當?shù)纳疃?，但不如iDISCO染色深度深。

3.3改善染色條件可以提高染色效果

研究報道，在iDISCO方法中，假設組織內(nèi)富含某種蛋白或者目標蛋白分布比較分散，如脊髓中的NF和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP），其抗體會在組織表面凝結成塊，不利于抗體滲透，難以對深部的組織進行染色觀察?？梢酝ㄟ^增加抗體孵育時間或者增加抗體濃度來提高染色效果［14］。我們發(fā)現(xiàn)，通過上述兩種方法能改善染色效果，但染色效果不能得到明顯改善。通過反復補充抗體的方法，能明顯提高染色效果。如NF染色中，在染色的第2天、第3天，在抗體孵育液中再次加入1/2第1天量的抗體，提高NF的染色效果。

有研究也指出，組織內(nèi)也富含細胞外基質(zhì)，細胞外基質(zhì)也一定程度阻止抗體的滲透［16］，兩種透明方法都不能去除細胞外基質(zhì)，從而也一定程度上影響了抗體的滲透。因此，有必要進一步改善染色的條件，進一步提高染色的深度和染色的效果。

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Application of Two Kinds of Tissue Clearing Method in Observing 3D Imaging of Spinal Cord with Immunofluorescent Staining

DUAN Hong-mei1，SHANG Jun-kui2，HAO Peng2，LI Qian-qian1，YANG Fei-xiang2，YANG Zhao-yang1，2，LI Xiao-guang1，2
1.Department of Biomedical Engineering，School of Biological Science and Medical Engineering，Beihang University，Beijing 100191，China；2.Department of Neurobiology，Capital Medical University，Beijing 100069，China
Correspondence to LI Xiao-guang.E-mail：lxgchina@sina.com

Objective To compare the application of CUBIC and iDISCO clearing methods in observing 3D imaging of spinal cord with immunofluorescent staining.Methods 1 mm thick spinal cord coronal sections were processed with CUBIC and iDISCO，respectively.The neurofilament（NF）protein was detected by immunofluorescent staining and then was observed by a laser confocal microscope.Results Compared with CUBIC，iDISCO had the advantages of shorter time，higher transparency（F=6.64，P＜0.01），and deeper penetration（F= 5117.55，P＜0.01）.Conclusion Immunofluorescent staining combined with iDISCO could completely observe the spinal axons with shorter time and better stain effect.

spinal cord；transparency；axon regeneration；CUBIC；iDISCO；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.010

R651.2

A

1006-9771（2016）04-0417-05

1.國家“863”計劃項目（No.2012AA020506）；2.國家自然科學基金面上項目（No.31271037）；3.國家自然科學基金國際合作與交流項目（No.31320103903）；4.“十二五”國家科技支撐計劃項目（No.2012BAI17B04）；5.高等學校全國優(yōu)秀博士學位論文作者專項資金資助項目（No.201356）；6.國家國際科技合作專項項目（No.2014DFA30640）；7.國家自然科學基金委員會資助項目（No.31130022）。

1.北京航空航天大學生物與醫(yī)學工程學院，北京市100191；2.首都醫(yī)科大學神經(jīng)生物學系，北京市100069。作者簡介：段紅梅（1983-），女，河南駐馬店市人，博士研究生，主要研究方向：生物材料在細胞誘導及脊髓損傷修復過程中的作用。通訊作者：李曉光（1959-），男，吉林長春市人，博士，教授，主要研究方向：應用組織工程學的方法修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。E-mail：lxgchina@sina.com。

有學者在一個世紀前首先發(fā)明了組織透明技術，該技術利用一定的方法可以使組織透明化，從而使完整組織的折射率一致，從而達到肉眼透明的效果。透明后的組織由于不同結構層的光折射率一致，光不會再出現(xiàn)散射，實現(xiàn)了對組織內(nèi)部結構的成像，有利于對組織進行三維成像觀察［4-7］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)因為結構的復雜性，使得組織透明技術對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、損傷修復和可塑性等的研究變得更加重要。最近出現(xiàn)的幾種組織透明技術，如ScaleA2［8］、3DISCO［2，9］、ClearT2［10］、SeeDB［11］和CLARITY［12］等都存在一定程度的缺陷。ScaleA2整個透明時間需要數(shù)月，ClearT2需要特殊的采集圖像條件，而CLARITY需要特殊的儀器和裝置。CUBIC［13］和iDISCO［14］兩種透明方法相對簡單，持續(xù)時間短，不需要特殊的裝置。所以本實驗選取并比較這兩種透明技術在應用免疫熒光染色觀察完整脊髓中的效果，以期為進一步研究脊髓損傷修復過程中軸突再生的完整觀察提供理論基礎和實驗依據(jù)。

（2016-03-15

2016-04-13）