電針對阿爾茨海默病大鼠海馬谷氨酸受體相互作用蛋白1、2表達的影響①

劉若蘭，沈　沉，沈曉燕，田　峻

電針對阿爾茨海默病大鼠海馬谷氨酸受體相互作用蛋白1、2表達的影響①

劉若蘭1，沈沉2，沈曉燕3，田峻1

目的探討電針對Aβ25-35所致的阿爾茨海默病（AD）模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸后膜α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙（AMPA）受體相關(guān)蛋白谷氨酸受體相互作用蛋白（GRIP）1、GRIP2表達的影響。方法40只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組，每組10只。采用海馬CA1區(qū)注射寡聚態(tài)Aβ25-35制備模型，假手術(shù)組在相同部位用同樣方法注射等量的生理鹽水。造模成功后第2天開始，電針組選取雙側(cè)腎俞、百會穴進行治療，每天1次，每周6次，共2周。治療結(jié)束后行免疫組化檢測GRIP1、GRIP2的表達量。結(jié)果正常組與假手術(shù)組GRIP1、GRIP2蛋白表達無顯著性差異（t＜1.7438，P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組、電針組GRIP1、GRIP2蛋白表達顯著下降（t＞9.5928，P＜0.001）。與模型組比較，電針組大鼠GRIP1、GRIP2蛋白表達升高（t＞9.5326，P＜0.05）。結(jié)論電針可能通過增加與AMPA受體定位插入相關(guān)的突觸后蛋白GRIP1、GRIP2的數(shù)量，使突觸后膜上的AMPA受體數(shù)量增多。

阿爾茨海默?。浑娽?；谷氨酸受體相互作用蛋白；大鼠

［本文著錄格式］劉若蘭，沈沉，沈曉燕，等.電針對阿爾茨海默病大鼠海馬谷氨酸受體相互作用蛋白1、2表達的影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（4）：413-416.

CITED AS：Liu RL，Shen C，Shen XY，et al.Effects of electroacupuncture on expression of glutamate receptor interacting proteins 1 and 2 in hippocampus of rats withAlzheimer's disease［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：413-416.

1　材料與方法

1.1實驗動物和分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（250±20）g，由湖北省實驗動物研究中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～25℃，濕度40%～60%，自由進食飲水。

實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，無不良反應(yīng)，飲食、飲水正常，即開始進行Y型水迷宮篩選［4］，淘汰反應(yīng)特別敏感或過于遲鈍的大鼠，將通過的40只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組和電針組，每組10只。實驗中被剔除或死亡者均在后續(xù)實驗中予以補齊。

1.2試劑及儀器

MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)：成都泰盟。Y型水迷宮：中國醫(yī)學科學院藥物所。89-00136顱腦立體定位儀：國營西北光學儀器廠。G6805-Ⅱ型電針治療儀：上海醫(yī)療器械廠。Aβ25-35：美國SIGMA公司。GRIP1、GRIP2試劑盒：湖北谷歌生物科技有限公司。

1.3實驗試劑制備

按試劑說明，將Aβ25-35單體0.1 mg用二甲基亞砜50 μl溶解后，再加入0.1 mol/L的PBS（磷酸鹽緩沖液）50 μl稀釋配制成1 mg/μl的溶液，37℃水浴箱孵育1周，使其變成寡聚狀態(tài)而具有神經(jīng)毒性，-20℃分裝保存。

1.4動物模型制備

10%水合氯醛0.4 ml/100 g腹腔注射大鼠麻醉后，固定于顱腦立體定位儀。手術(shù)區(qū)備皮，參照大鼠腦立體定位圖譜［5］，在前囟后3.3 mm、中線旁開1.5 mm定位。用牙科鉆鉆出進樣孔。將5μl微量注射器垂直插入顱骨表面進針3.0 mm至海馬CA1區(qū)，將Aβ25-35按1.0 μl/min速度緩慢注入雙側(cè)海馬，5 min內(nèi)注射完畢，留針5 min，緩慢出針，防止Aβ25-35溢出。義齒基托樹脂封閉進樣孔，最后縫合大鼠頭部切口。肌注青霉素G 10萬U防止感染，持續(xù)3 d。假手術(shù)組于顱內(nèi)注射等量生理鹽水，電針組同模型組。造模后再次行“Y”型水迷宮篩選，15次測試中正確次數(shù)較造模前下降1/3以上者為造模成功。

1.5方法

造模成功后第2天，根據(jù)大鼠穴位定位方法［6］，選用30號1寸華佗牌毫針，電針組在大鼠百會向后斜刺4 mm，雙側(cè)腎俞直刺5 mm，針刺后接G6805-Ⅱ型電針治療儀，百會連耳尖，雙側(cè)腎俞連一對電極，施以頻率2 Hz，電流強度1 mA連續(xù)波，持續(xù)20 min。每天1次，每周6 d，共治療2周。

正常組、假手術(shù)組和模型組僅在對電針組大鼠行電刺激時給予同樣的抓取和固定動作。

1.6標本處理與指標檢測

電針治療結(jié)束后第2天，大鼠用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉成功后，4%多聚甲醛心臟灌注固定取樣，放入4%多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋、切片，片厚4 μm，免疫組織化學法檢測GRIP1、GRIP2的表達。步驟如下：切片脫蠟后PBS清洗，加入0.3%過氧化氫甲醇溶液室溫孵育30 min；加入0.3%Triton X100溶液室溫孵育30 min；加入100倍PBS溶液稀釋一抗，4℃孵育過夜；吸去抗體；加入二抗，室溫孵育2 h。加入ABC復(fù)合物（A.DAB；B. H2O2；3.磷酸緩沖液），室溫孵育2 h；蒸餾水沖洗；加入顯色液，脫水、透明、封片。

應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD）。

1.7統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。每組10張照片，實驗數(shù)據(jù)以（xˉ±s）表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

正常組與假手術(shù)組GRIP1、GRIP2蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組、電針組GRIP1、GRIP2蛋白表達顯著下降（P＜0.001）。與模型組比較，電針組大鼠GRIP1、GRIP2蛋白表達升高（P＜0.05）。見表1、圖1、圖2。

表1　各組大鼠海馬區(qū)GRIP1、GRIP2表達（IOD）

3　討論

中醫(yī)學認為癡呆的發(fā)生與五臟虛衰相關(guān)，其病變在腦，而腎不藏精是本病的發(fā)病基礎(chǔ)。腦為髓海，腎藏精、主骨、生髓。因此腦髓是否充盈受腎之精氣的盛衰的影響，腎精充足則腦髓充盈，大腦思維、認知正常發(fā)揮。反之腎中精氣不足，則腦失所養(yǎng)，大腦智力減退，出現(xiàn)癡呆。故治療以補腎填髓，健腦益智為主。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，在針灸治療AD的實驗動物選穴中，百會與腎俞是最為常用的穴位［7］。百會穴位于督脈與補腦髓密切相關(guān)，具有醒腦開竅，益智調(diào)督的作用。經(jīng)臨床和實驗證實，本穴具有保護大腦組織，改善腦血液供應(yīng)，增強記憶力等方面的功效，對于精神意志障礙等癥狀均有一定的療效［8］。腎俞穴，特定穴之背俞穴，屬于膀胱足太陽之經(jīng)，腎中精氣匯集并轉(zhuǎn)輸于背腰部的腧穴，通達全身陽氣。本穴能補腎填精，強腰健腦。通過電針刺激百會穴和腎俞穴而達到標本同治AD的目的。

突觸是神經(jīng)元之間信息傳遞的關(guān)鍵部位，是神經(jīng)元可塑性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，興奮性突觸傳遞的長時程增強（long-term potentiation，LTP）和長時程抑制（long-term depression，LTD）反映突觸傳遞效能的持久變化，是研究學習記憶機制的重要模型。AMPA受體是存在于突觸后膜上由GluR1～4組成的異聚體，腦內(nèi)AMPA受體的常見組合形式是GluR1/ GluR2和GluR2/GluR3。作為興奮性離子型谷氨酸受體，AMPA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的快速興奮性突觸傳遞起重要作用，影響學習與記憶功能［9-10］。AMPA受體的表達和分布異?？赡苁雇挥|可塑性受損，引發(fā)認知障礙［11］。

圖1　各組大鼠海馬CA1區(qū)GRIP1表達（200×）

圖2　各組大鼠海馬CA1區(qū)GRIP2表達（200×）

AMPA受體并不是穩(wěn)定地存在于突觸后膜上，而是隨著神經(jīng)活動不斷地在細胞膜與細胞質(zhì)間進行循環(huán)，即不斷地移入（插膜）或移出（內(nèi)化）突觸后膜使其在突觸后膜的數(shù)量和密度不斷變化［12］。而突觸后膜上AMPA受體的數(shù)量決定了突觸后神經(jīng)元興奮的程度，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響突觸可塑性的主要決定因素［13］。

AMPA受體的插膜過程需要幾個受體反應(yīng)蛋白來完成，GRIP在其中起重要作用。它是Dong等研究發(fā)現(xiàn)的一類含有7個PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，包括GRIP1和GRIP2，通過與AMPA受體亞基GluR2及GluR3的C末端相互作用，調(diào)節(jié)AMPA受體亞基在細胞膜與突觸后膜上的分布，從而穩(wěn)定AMPA受體在突觸后膜的聚集分布，調(diào)節(jié)突觸的可塑性［14-15］。研究表明GRIP1的分布與GluR2/3在大腦中的分布狀態(tài)相似［16］，在大腦及海馬有GRIP1與AMPA受體的共存。GRIP1與GluR2免疫雙標顯示，二者在胞體及大部分的樹突有廣泛的交疊現(xiàn)象，證明GRIP1可能在興奮性突觸AMPA受體的聚集與功能調(diào)節(jié)中有一定的作用［17-18］。變異型GluR2因不能與GRIP結(jié)合而使突觸后膜的AMPA受體數(shù)量下降，提示含有GluR2亞基的AMPA受體在突觸后膜的表達依賴于GRIP-GluR2的相互作用。

針灸具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理臟腑、平衡陰陽的作用，且操作簡便、經(jīng)濟實用。大量的臨床和實驗研究表明針灸對AD的學習記憶能力有明顯的改善作用［19-20］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬神經(jīng)元蛋白AMPA受體相關(guān)蛋白GRIP1、GRIP2表達顯著減少（P＜0.001），電針組蛋白表達較模型組增多（P＜0.05）。電針治療后，正常組和假手術(shù)組突觸后膜表達蛋白GRIP1、GRIP2含量變化無顯著性差異（P＞0.05），而假手術(shù)組與電針組和模型組之間有非常高度顯著性差異（P＜0.001），說明電針可能通過增加GRIP的表達量從而提高GluR1和GluR2在細胞膜表面以及突觸中的表達，從而增強AMPA的突觸傳導(dǎo)［21］，使AMPA受體能被運送至突觸部位并抵抗胞吞作用而穩(wěn)定表達于突觸后膜，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)突觸可塑性的作用，對學習記憶能力起到了一定的改善作用［22］。下一步，我們可對AMPA受體進行阻滯，進一步觀察電針對AD模型大鼠神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用，觀察電針是否僅通過或主要通過影響AMPA受體及其效應(yīng)相關(guān)蛋白的表達，調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性，從而發(fā)揮治療AD的作用。

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Effects of Electroacupuncture on Expression of Glutamate Receptor Interacting Proteins 1 and 2 in Hippocampus of Rats withAlzheimer's Disease

LIU Ruo-lan1，SHEN Chen2，SHEN Xiao-yan3，TIAN Jun1
1.Rehabilitation Department，Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan，Hubei 430071，China；2.Department of Acupuncture and Moxibustion，Hubei Provincial Hospital of TCM，Wuhan，Hubei 430061，China；3.Wuhan University，Wuhan，Hubei 430071，China
Correspondence to TIAN Jun.E-mail：18995540980@126.com

Objective To investigate the effect of electroacupuncture on the expression of α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole propionate（AMPA）receptor associated protein glutamate receptor interacting protein（GRIP）1 and GRIP2 in hippocampal neurons of rats with Alzheimer's disease（AD）model induced by Aβ25-35.Methods 40 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group，sham operation group，model group and electroacupuncture group with 10 rats in each group.The AD rat model was prepared by injecting Aβ25-35in the hippocampus CA1 of rats，while the sham operation group was injected with equal amount of normal saline at the same location.On the second day after successful modeling，the electroacupuncture group received electroacupuncture at Baihui（DU20）and bilateral Shenshu（BL23）acupoints，once a day，6 times a week for 2 weeks.The expression of GRIP1 and GRIP2 were detected with immunohistochemistry.Results There was no difference in the expression of GRIP2 and GRIP1 proteins in hippocampus between the normal group and sham operation group（t＜1.7438，P＞0.05），but was lower in the model group and the electroacupuncture group than in the sham operation group（t＞9.5928，P＜0.001），and was higher in the electroacupuncture group than in the model group（t＞9.5326，P＜0.05）.Conclusion Electroacupuncture may increase the number ofAMPAreceptors on the postsynaptic membrane by increasing GRIP1 and GRIP2.

Alzheimer's disease；electroacupuncture；glutamate receptor interacting protein；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.009

R749.1

A

1006-9771（2016）04-0413-04

湖北省自然科學基金面上項目（No.2012FFA095）。

1.武漢大學中南醫(yī)院康復(fù)科，湖北武漢市430071；2.湖北省中醫(yī)院針灸科，湖北武漢市430061；3.武漢大學，湖北武漢市430071。作者簡介：劉若蘭（1985-），女，漢族，湖北襄陽市人，碩士，醫(yī)師，主要研究方向：針灸防治腦病。通訊作者：田峻（1968-），男，漢族，湖北武漢市人，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)治療骨關(guān)節(jié)病。E-mail：18995540980@126.com。

隨著人口老齡化呈逐年上升趨勢［1］，阿爾茨海默?。ˋlzheime's disease，AD）患病人群也逐漸增多，已嚴重影響國民的健康和生活質(zhì)量。它的臨床最主要首發(fā)癥狀是學習記憶障礙，而神經(jīng)元的突觸可塑性改變是被公認的學習記憶的機制［2］。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙（α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole propionate，AMPA）受體是調(diào)節(jié)突觸可塑性的重要靶點，它是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜上的一種離子型谷氨酸受體，其在突觸后膜的定位插入是靜寂突觸轉(zhuǎn)化為功能突觸的必要環(huán)節(jié)［3］。AMPA受體在突觸后膜的錨定需要幾種突觸后蛋白的參與，谷氨酸受體相互作用蛋白（glutamate receptor interacting protein，GRIP）在其中起重要作用。已有大量基礎(chǔ)和臨床研究表明針刺治療可以促進學習記憶能力的改善，但針刺對突觸后與AMPA受體結(jié)合的膜蛋白的影響尚未見報道。本實驗通過觀察電針對大鼠學習記憶能力及GRIP表達的影響，探討電針對AD的防治作用及機制。?

（2015-09-21

2016-02-03）