丙酮酸乙酯對缺氧缺血性腦損傷仔鼠海馬區(qū)caspase-3表達及學(xué)習(xí)記憶能力影響①

曹　陽，張麗華

丙酮酸乙酯對缺氧缺血性腦損傷仔鼠海馬區(qū)caspase-3表達及學(xué)習(xí)記憶能力影響①

曹陽1，張麗華2

目的探討丙酮酸乙酯（EP）對新生大鼠缺氧缺血腦損傷（HIBD）后海馬區(qū)caspase-3表達及學(xué)習(xí)記憶能力影響。方法7日齡Wistar大鼠90只隨機分假手術(shù)組（n=15）、HIBD組（n=15）、EP1組（n=15，10 ml/kg）、EP2組（n=15，30 mg/kg）、EP3組（n=15，50 mg/kg）和EP4組（n=15，100 mg/kg）。采用經(jīng)典Rice法制備模型。EP各組于術(shù)前30 min及術(shù)后每24小時腹腔注射相應(yīng)劑量EP，共2周。免疫組化染色觀察caspase-3陽性細胞數(shù)，Morris水迷宮評測逃避潛伏時間和穿過目標象限次數(shù)。結(jié)果除EP1組caspase-3陽性細胞數(shù)與HIBD組無顯著性差異（P＞0.05）外，其余EP各組較HIBD組均明顯減少（P＜0.01），EP3組最少（P＜0.01）。Morris水迷宮測試：除EP1組逃避潛伏期、穿過目標象限次數(shù)與HIBD組無顯著性差異（P＞0.05）外，其余EP各組均優(yōu)于HIBD組（P＜0.01），EP3組最佳（P＜0.01）。結(jié)論EP可以減少HIBD大鼠海馬區(qū)caspase-3的表達，改善HIBD引起的遠期學(xué)習(xí)記憶能力障礙。

缺氧缺血性腦損傷；丙酮酸乙酯；caspase-3；學(xué)習(xí)記憶能力；大鼠

［本文著錄格式］曹陽，張麗華.丙酮酸乙酯對缺氧缺血性腦損傷仔鼠海馬區(qū)caspase-3表達及學(xué)習(xí)記憶能力影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（4）：409-412.

CITED AS：Cao Y，Zhang LH.Effect of ethyl pyruvate on expression of caspase-3 in hippocampus and learning and memory in rats with hypoxic ischemic brain damage［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：409-412.

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic ischemic brain damage，HIBD）是圍生期新生兒因缺氧引起的腦部病變，可能造成神經(jīng)元和腦白質(zhì)的損傷，并且在大腦的發(fā)育過程中形成極具破壞性的傷害［1］。HIBD是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因之一，也是引起小兒腦癱的重要原因之一［2-3］。有證據(jù)表明，在美國HIBD的發(fā)病率已由2‰～3‰上升到6‰，不發(fā)達國家發(fā)病率甚至高達26‰［4-6］。盡管醫(yī)療科學(xué)技術(shù)有了飛速的發(fā)展，人們對胎兒和新生兒的病癥有了更多的了解，但是對于HIBD仍然沒有一種明確、有效的療法。因此，尋找一種明確有效的藥物對HIBD的治療仍十分重要。大量的動物實驗證明，丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）可通過改善由氧化反應(yīng)介導(dǎo)的細胞損傷，減少細胞炎癥因子的分泌，抑制細胞凋亡，對許多內(nèi)臟器官起到保護作用［7-8］。本研究通過大鼠HIBD模型，探討EP對HIBD新生大鼠腦海馬區(qū)caspase-3表達及學(xué)習(xí)記憶能力的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物

7日齡Wistar大鼠90只，雄性47只，雌性43只，體質(zhì)量10～14 g，清潔級，由佳木斯大學(xué)動物實驗室提供，動物合格證號：SCXIL（黑）2013-001。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（n=15）、HIBD模型組（n=15）、EP1組（n=15）、EP2組（n=15）、EP3組（n=15）和EP4組（n=15）。

1.2試劑及儀器

兔抗大鼠IgG蛋白、山羊抗兔IgG蛋白：北京奧博森生物技術(shù)有限公司。CH30光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS。

1.3模型制備

采用經(jīng)典Rice法［9］進行模型制備。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液3 ml/kg麻醉，仰臥位固定于實驗臺上，在頸部正中位縱向切開一道長1～2 cm的切口，找到左側(cè)頸總動脈，將其游離并于近心端處永久性結(jié)扎，將大鼠創(chuàng)口縫合后放回籠中休息2.5～3 h，待蘇醒后再放入37℃恒溫的密閉箱內(nèi)，并向箱中通入8%氧氣和92%氮氣的混合氣體2 h，流量保持在1.5～2 L/ min。將缺氧后的大鼠送回原籠中，由母鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.4干預(yù)方法

假手術(shù)組：只將左側(cè)頸總動脈分離，不結(jié)扎，不進行缺氧處理。

HIBD組：結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，進行缺氧處理，生理鹽水10 ml/kg注射。

EP1、EP2、EP3、EP4組：首先結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，缺氧處理，術(shù)前30 min及術(shù)后每24小時分別腹腔注射EP 10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/ kg，持續(xù)2周。

按隨機數(shù)字表法在每組中抽取5只大鼠處死，取腦、切片，行免疫組化染色。余下大鼠進行連續(xù)4 d的Morris水迷宮訓(xùn)練。

1.5免疫組化染色

干預(yù)2周后，每組大鼠隨機取出5只，心臟灌注處死，并做腦冠狀切片，厚度8 μm。切片浸入3% H2O2去離子水中30 min，5%山羊血清封閉液封閉1 h。滴加一抗caspase-3抗體（兔抗大鼠IgG蛋白，1∶ 100），4℃孵育過夜，滴加二抗（山羊抗兔IgG蛋白1∶200），37℃恒溫水浴箱孵育1 h。室溫環(huán)境下，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。若鏡下細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)有棕黃色的顆粒，則視其為陽性細胞，若無棕黃色顆粒，則視其為陰性細胞［10］。每個標本取3張切片在100倍鏡下觀察，每張切片取4個視野對陽性細胞進行計數(shù)，計算平均值。

1.6 Morris水迷宮測定

將Morris水迷宮的水池平均劃分為4個象限，在其中1個象限中央設(shè)置一個略高于水面的平臺，并將此象限作為平臺象限。

1.6.1定位航行實驗

每天上午10時，將每組剩余大鼠依次從4個象限的入水點放入迷宮，記錄其逃避潛伏時間，即從大鼠頭朝池壁被放入水池開始，到四肢全部爬上平臺所消耗的時間，120 s/次，4次/d，間隔20 min，連續(xù)訓(xùn)練4 d，記錄第4天的訓(xùn)練結(jié)果。

1.6.2空間探索實驗

訓(xùn)練第5天，將水面的平臺撤走，將大鼠頭朝池壁放入水池中，并對120 s內(nèi)大鼠穿過平臺原來所在象限的次數(shù)進行記錄。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進行分析。數(shù)據(jù)采用（xˉ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α= 0.05。

2　結(jié)果

2.1 caspase-3陽性細胞情況

假手術(shù)組caspase-3陽性細胞數(shù)目與其余各組比較均存在非常顯著性差異（P＜0.01）。各組大鼠兩兩進行比較后發(fā)現(xiàn)，EP1組陽性細胞數(shù)目與HIBD組之間無顯著性差異（P＞0.05）；其余各組之間均存在非常顯著性差異（P＜0.01）。EP3組caspase-3陽性細胞數(shù)最少，抑制凋亡效果在6個組中最為明顯。見表1、圖1。

2.2 Morris水迷宮測試

假手術(shù)組大鼠逃避潛伏時間明顯短于其他各組（P＜0.01）。除EP1組與HIBD組逃避潛伏時間無顯著性差異（P＞0.05）外，EP2組、EP3組和EP4組均明顯短于HIBD組（P＜0.01）。按時間長短排列：假手術(shù)組＜EP3組＜EP4組＜EP2組＜EP1組≤HIBD組。

假手術(shù)組大鼠穿過目標象限次數(shù)明顯多于其他各組（P＜0.01）。除EP1組與HIBD組穿過目標象限次數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）外，EP2組、EP3組和EP4組均明顯多于HIBD組（P＜0.01）。按照次數(shù)多少排列：假手術(shù)組＞EP3組＞EP4組＞EP2組＞EP1組≥HIBD組。

圖1　各組caspase-3陽性表達（免疫組化染色，100×）

表1　各組caspase-3陽性細胞數(shù)（個/視野）

表2　各組逃避潛伏時間、穿過目標象限次數(shù)

3　討論

HIBD是急性、未知的圍產(chǎn)期窒息所導(dǎo)致的新生兒期較為常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾?。?1］。已有大量的研究證實，大腦供血的不足甚至終斷可導(dǎo)致腦組織氧氣和葡萄糖的缺乏，并觸發(fā)級聯(lián)性生化反應(yīng)的發(fā)生，如能量的消耗、酸中毒、興奮性中毒、細胞內(nèi)鈣離子大量積聚，以及氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和腦組織的大面積損傷，損傷部位包括大腦皮層、紋狀體、海馬體等［12-16］。海馬體又被稱為海馬區(qū)，其主要作用為學(xué)習(xí)、記憶和空間定位等，是人類用以處理長期學(xué)習(xí)、記憶的主要區(qū)域，而貧血、缺氧等狀態(tài)都容易使海馬區(qū)受到不同程度的損傷［17］。caspase-3是細胞凋亡過程的主要執(zhí)行者，已被了解的caspase-3底物幾乎都能被其水解［18］。在CD95抗體、CD3抗體、地塞米松、星形孢菌素誘導(dǎo)的凋亡實驗中，caspase-3缺陷小鼠的腦發(fā)育受到顯著影響，證明caspase-3在大腦的發(fā)育過程中也發(fā)揮了不可忽視的作用［19-21］。

本實驗通過采用經(jīng)典的Rice法制備HIBD模型，該模型價格低廉，成功率也相對較高，并且制作較為容易，為新生兒缺氧缺血性腦損傷的藥物治療研究打下基礎(chǔ)。本研究顯示，HIBD組海馬區(qū)caspase-3陽性細胞數(shù)目明顯增加，且在水迷宮測試中，HIBD組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，提示模型建立成功。

已有研究顯示，EP對于腦組織損傷具有保護作用，能夠有效抑制凋亡細胞的發(fā)生［22-24］。在本研究中，經(jīng)過EP治療后的HIBD大鼠腦海馬區(qū)caspase-3陽性細胞的數(shù)目較未經(jīng)治療的HIBD大鼠明顯減少，這一結(jié)果也證實了EP的神經(jīng)保護作用。

目前，在關(guān)于大鼠的空間、位置學(xué)習(xí)記憶能力的研究中，Morris水迷宮測試已被廣泛應(yīng)用［25］。定位航行和空間探索實驗已經(jīng)證實海馬細胞是空間記憶能力的基礎(chǔ)［26］。

通過對不同劑量EP組caspase-3陽性細胞數(shù)目的對比，發(fā)現(xiàn)藥量為30 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，對HIBD大鼠腦海馬區(qū)均有保護作用，并且這種保護作用具有劑量依賴性。藥量為10 mg/kg時，不具備明顯的保護作用。隨著劑量不斷增加，30 mg/kg時，有明顯的保護作用；50 mg/kg時，保護作用最大；100 mg/kg時，保護作用明顯，卻較50 mg/kg略差。

綜上所述，EP可以改善新生兒期腦缺氧缺血造成的學(xué)習(xí)記憶障礙，該作用與其抑制海馬區(qū)凋亡蛋白caspase-3的表達有關(guān)，且EP的治療效果具有劑量依賴性。目前EP僅適用于動物實驗中，它的安全、有效性仍有待研究。

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Effect of Ethyl Pyruvate on Expression of Caspase-3 in Hippocampus and Learning and Memory in Rats with Hypoxic Ischemic Brain Damage

CAO Yang1，ZHANG Li-hua2
1.Rehabilitation College of Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154000，China；2.Department 2 of Cerebral Palsy，The ThirdAffiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154000，China
Correspondence to ZHANG Li-hua.E-mail：zhanglihua59597@163.com

Objective To investigate the effect of ethyl pyruvate（EP）on the expression of caspase-3 in the hippocampus and the learning and memory ability in neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage（HIBD）.Methods 90 Wistar rats of 7 days old were randomly divided into sham operation group（n=15），HIBD group（n=15），EP1 group（n=15，10 ml/kg），EP2 group（n=15，30 mg/kg），EP3 group（n= 15，50 mg/kg）and EP4 group（n=15，100 mg/kg）.The model was established with Rice's method.30 minutes before operation，and every 24 hours after operation，EP groups were injected with 10 ml/kg，30 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg EP in abdomen respectively，for 2 weeks.After treatment，the caspase-3 positive cells were observed by immunohistochemical staining，and the latency and the times crossing the target quadrant were tested by Morris water maze test.Results The caspase-3 positive cells were less in EP groups than in HIBD group（P＜0.05），expect EP1 group（P＞0.05），especially in EP3 group（P＜0.01）.The latency and the times crossing the target quadrant were better in EP groups than in HIBD group（P＜0.05），expect EP1 group（P＞0.05），especially in EP3 group（P＜0.01）.Conclusion Ethyl pyruvate can decrease the expression of caspase-3 in hippocampus，and improve the ability of memory and learning in neonatal rats with HIBD.

hypoxic ischemic brain damage；ethyl pyruvate；caspase-3；learning and memory；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.008

R743

A

1006-9771（2016）04-0409-04

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目（No.LM2015-053）。

1.佳木斯大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯市154000；2.佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院腦癱康復(fù)二科，黑龍江佳木斯市154000。作者簡介：曹陽（1989-），女，漢族，黑龍江齊齊哈爾市人，碩士研究生，主要研究方向：小兒腦癱的綜合康復(fù)。通訊作者：張麗華，女，漢族，黑龍江佳木斯市人，教授，主任醫(yī)師，主要研究方向：小兒腦癱的綜合康復(fù)。E-mail：zhanglihua59597@163.com。

（2015-11-16

2016-01-05）