不隨意運(yùn)動型腦性癱瘓血清代謝輪廓的特征分析①

陳俊臣，何　霞，段　宇，彭云川，張明偉

不隨意運(yùn)動型腦性癱瘓血清代謝輪廓的特征分析①

陳俊臣1，2，何霞2，段宇2，彭云川2，張明偉1

目的利用代謝組學(xué)方法研究不隨意運(yùn)動型腦癱患兒血清代謝的輪廓特征，分析其異常代謝通路。方法收集2014年5～8月本院門診診斷的10例6～12歲不隨意運(yùn)動型腦癱患兒（患兒組）及7名正常兒童（對照組）的血清樣本，利用代謝組學(xué)方法，將所有血清樣本進(jìn)行核磁共振掃描，所得到的核磁圖譜進(jìn)行分段積分，利用偏最小二乘法模型對積分矩陣回歸分析，分離對照組，計算特征化學(xué)位移段。在代謝數(shù)據(jù)庫中查詢小分子代謝產(chǎn)物，分析不隨意運(yùn)動型腦癱患兒代謝輪廓擾動差別。結(jié)果在偏最小二乘法模型中，15個重要變化化學(xué)位移段被確定，其中2.04 ppm、2.12 ppm、3.00 ppm、3.24 ppm、3.76 ppm、6.50 ppm信號值有顯著性差異（P＜0.05）。通過生物核磁數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)谷氨酸、酮戊二酸、谷氨酰胺、亮氨酸、左旋丙氨酸水平升高；而?；撬帷⒀雍魉?、草酰乙酸、丙酮酸、檸檬酸、天門冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸、半胱氨酸水平下降。在代謝數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不隨意運(yùn)動型腦癱患兒血清中?；撬岽x通路、谷氨酸代謝通路和能量代謝通路波動異常。結(jié)論基于代謝組學(xué)偏最小二乘法模型能成功區(qū)分不隨意運(yùn)動型腦癱代謝輪廓，該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)異常波動的代謝產(chǎn)物及代謝通路可成為進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

腦性癱瘓；不隨意運(yùn)動型；代謝組學(xué)；核磁共振波譜；偏最小二乘法

作者單位：1.四川醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院（附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科），四川瀘州市646000；2.四川省康復(fù)醫(yī)院，四川成都市611135。作者簡介：陳俊臣（1982-），男，漢族，四川儀隴縣人，主治醫(yī)師，主要研究方向：小兒腦性癱瘓，顱腦創(chuàng)傷。通訊作者：張明偉（1973-），男，漢族，四川簡陽市人，主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：小兒腦性癱瘓，顱腦外傷創(chuàng)傷的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：drcc82@163.com。

［本文著錄格式］陳俊臣，何霞，段宇，等.不隨意運(yùn)動型腦性癱瘓血清代謝輪廓的特征分析［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（4）：448-454.

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腦癱是由發(fā)育不成熟的大腦（產(chǎn)前、產(chǎn)時或產(chǎn)后）先天性發(fā)育缺陷（畸形、宮內(nèi)感染）或獲得性（早產(chǎn)、低出生體重、窒息、缺氧缺血性腦病、核黃疸、外傷、感染）等非進(jìn)行性腦損傷所致［1］。腦癱是兒童時期最常見致殘因素，給個人帶來巨大生理及心理痛苦，也給家庭和整個社會造成巨大的負(fù)擔(dān)［2］。不隨意運(yùn)動作為腦癱的一種亞型，約占整個腦癱患者的17%，主要包括舞蹈性手足徐動和肌張力障礙；該型最明顯特征是非對稱性姿勢，頭部和四肢出現(xiàn)不隨意運(yùn)動，目前并沒有十分有效的治療方式［1，3］。研究發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)一部分患兒是由于本身攜帶致病基因或其他代謝因素失調(diào)，因診斷不明而歸為腦癱［4］。例如，多巴胺反應(yīng)型肌張力障礙，常與不隨意運(yùn)動型腦癱表現(xiàn)相似，因?yàn)樽陨砘蛉毕輰?dǎo)致體內(nèi)多巴胺代謝障礙，小劑量多巴胺制劑對其治療效果良好［5］；精氨酸血癥，為體內(nèi)精氨酸代謝障礙，在體內(nèi)堆積，是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，常導(dǎo)致兒童期的痙攣性癱瘓［6］；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1缺乏綜合征也可導(dǎo)致小兒難治性癲癇、發(fā)育遲緩、復(fù)雜性運(yùn)動障礙［7］。腦癱是一組典型征候群，常出現(xiàn)誤診誤治，其內(nèi)部代謝也可能出現(xiàn)特征性變化。

代謝組學(xué)是通過考察生物體系內(nèi)小分子代謝產(chǎn)物圖譜及其隨時間動態(tài)變化特點(diǎn)的學(xué)科，與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)共同構(gòu)成了系統(tǒng)生物學(xué)的研究體系?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于包括疾病的診斷、藥理學(xué)、病理生理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和材料學(xué)等重要領(lǐng)域［8］。常用的檢測手段包括核磁共振（nuclear magnetic resonance）、質(zhì)譜和色譜分析等，其檢測的生物體液波譜具有高通量特征，包含上千種小分子物質(zhì)信息。對不同特點(diǎn)的波譜，需要建立數(shù)學(xué)模型分析，其中非監(jiān)督性模式識別中的主成分分析（principal component analysis，PCA）和監(jiān)督性模式識別中的偏最小二乘法-判別分析（partial leastsquares discriminant analysis，PLS-DA）是最常用的分析方法［9］。

目前基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)，在許多兒科疾病的發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)揮重要作用，如孤獨(dú)癥［10］、Ⅰ型糖尿病［11］、哮喘［12］及中樞性腫瘤［13］等已有運(yùn)用。雖然也有文章提示代謝組學(xué)作為一種新的研究方法在肌張力障礙疾病中研究的可行性，但并沒有提出具體的代謝擾動途徑［14］。

本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)對不隨意運(yùn)動型腦癱與正常兒童的血清進(jìn)行核磁共振波譜分析，希望從中發(fā)現(xiàn)有關(guān)該型患兒的異常代謝狀態(tài)關(guān)鍵點(diǎn)，為進(jìn)一步研究提供可靠線索。

1　資料與方法

1.1一般資料

2014年5～8月，四川省康復(fù)醫(yī)院功能神經(jīng)外科門診，經(jīng)副主任醫(yī)師以上的專家確診的不隨意運(yùn)動型腦癱患兒納入研究。

診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］：①中樞性運(yùn)動障礙持續(xù)存在；②運(yùn)動和姿勢發(fā)育異常；③以錐體外系受損為主，不隨意運(yùn)動增多的臨床表現(xiàn)；④反射異常；⑤肌力、肌張力異常。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡6～12歲；②有明確的圍產(chǎn)期及發(fā)育期的腦損傷病史；③粗大運(yùn)動功能分級Ⅰ～Ⅲ級；④頭部MRI腦損傷表現(xiàn)為陳舊、靜止性；⑤6個月內(nèi)未服用任何藥物。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性或進(jìn)行性運(yùn)動障礙??；②其他嚴(yán)重的并發(fā)癥，如癲癇、智力障礙、行為異常等；③伴有牽張反射亢進(jìn)、病理反射陽性的臨床表現(xiàn)；④其他發(fā)育遲緩疾病。

對照組為相仿年齡段健康兒童。實(shí)驗(yàn)實(shí)施前，每名兒童監(jiān)護(hù)人被告知實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮拖嚓P(guān)方案，并征得同意。實(shí)驗(yàn)計劃經(jīng)四川省康復(fù)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

納入實(shí)驗(yàn)兒童均記錄性別、年齡、身高、體質(zhì)量并計算體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。

采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對患兒組及對照組年齡、身高、體質(zhì)量及BMI進(jìn)行分析。

1.2樣本采集和制備

所有入選對象于清晨6時，空腹8 h后，采集靜脈血4 ml。采血前1 d按日常生活飲食活動，禁止高脂高蛋白飲食及劇烈活動或康復(fù)訓(xùn)練。血液樣本在室溫下自然凝固1 h，采集上層血清，置-70℃超低溫冰箱備用。

1.3樣本檢測

在四川大學(xué)分析測試中心核磁共振實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。血清樣本編號加入重水后置于核磁管中，放于600 MHz核磁儀中進(jìn)行檢查。實(shí)驗(yàn)參數(shù)：譜寬8000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 K，采樣時間2 s，累加次數(shù)64次，t為400 ms，2 nt為320 ms，弛豫延遲為2 s，其間采用低功率脈沖對水峰進(jìn)行預(yù)飽和。以甲乳酸基雙峰信號的左側(cè)峰定義為d1.33，然后調(diào)整相位并進(jìn)行基線校正。后將所有樣本的自由感應(yīng)衰減信號導(dǎo)入核磁解析MESTREC（version 4.4.0）軟件，進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換后，獲得氫核核磁共振波譜（1H-NMR）。將0.00～8.00 ppm范圍內(nèi)的化學(xué)位移在MESTREC按照0.04 ppm進(jìn)行分段積分，得到200個波譜強(qiáng)度值。為了減少系統(tǒng)誤差，在進(jìn)行模式識別分析前對分割后的目標(biāo)積分段值進(jìn)行加合和歸一化處理。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件。

1.4多元統(tǒng)計分析

將a名患兒和b名正常兒童的核磁波譜信號分段積分，得到矩陣A和矩陣B。行代表每個納入實(shí)驗(yàn)兒童，列代表200個化學(xué)位移段積分后的信號強(qiáng)度值。A代表不隨意運(yùn)動腦癱患兒組，B代表正常兒童組，用于模式識別分析。

本實(shí)驗(yàn)首先將A矩陣和B矩陣無差別地在Matlab平臺中進(jìn)行主成分分析，其作為無監(jiān)督判別模式，并沒有將兩組樣本有效區(qū)分。

再對A矩陣和B矩陣在Matlab偏最小二乘法平臺中中提前分組（監(jiān)督模式），進(jìn)行PLA-DA判別。

目的一：建立PLS-DA模型，并了解模型是否具有可重復(fù)性和可預(yù)測性。目的二：如果模型穩(wěn)定，設(shè)定模型重要變量參數(shù)（variable important parameter，VIP）值為1.70，計算出在模型中影響A、B矩陣分離最大的化學(xué)位移段。在SPSS下，通過配對樣本的t檢驗(yàn)驗(yàn)證VIP化學(xué)位移段信號值是否具有統(tǒng)計學(xué)意義（α=0.05）。

1.5代謝產(chǎn)物的確定

特定的化學(xué)位移段是不同分子或化學(xué)結(jié)構(gòu)在磁場中不同的衰減變化信號，通過代謝數(shù)據(jù)庫（http：//www. hmdb.ca/）推測代謝產(chǎn)物。

人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物之間的相互作用關(guān)系、基因調(diào)控和酶作用變化，可以通過查閱KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫（KEGG Pathway Database），進(jìn)一步分析得出。

2　結(jié)果

2.1納入對象

經(jīng)嚴(yán)格篩選，10例不隨意運(yùn)動型腦癱患兒納入本實(shí)驗(yàn)，其中男性6例，女性4例，年齡6～12歲，平均8.9歲。病因包括產(chǎn)時缺氧、黃疸、高熱驚厥和腦出血，頭顱MRI檢查，除10號患兒外，均有異常表現(xiàn)（表1）。10例患兒均有不隨意運(yùn)動表現(xiàn)，但查體均無病理征或反射亢進(jìn)；患兒都有不同程度的語言障礙（表2），但均能聽懂指令，無明顯智力障礙和行為異常。

對照組7名健康兒童，年齡6～11歲，平均8.9歲。年齡與患兒組無顯著性差異（P＞0.05）。

不隨意運(yùn)動型腦癱患兒身高、體質(zhì)量均落后于正常兒童，但無顯著性差異（P＞0.05）?；純捍蠖嗌眢w瘦小，BMI小于對照組（P＜0.05），見表3。

2.2多變量分析

血清的核磁波譜信分段積分后數(shù)值導(dǎo)入到Matlab偏最小二乘法判別工作平臺，PLS-DA模型成功建立后，通過得分圖可以觀察到患兒組和對照組代表散點(diǎn)在第一主成分（t1）和第二主成分（t2）區(qū)分情況（圖1）。模型的參數(shù)R2表示模型的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測率。該模型R2=0.832，Q2=-0.184，說明該模型算法有較高的可重復(fù)性和預(yù)測性。

在軟件中將VIP值標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整到1.70，篩選特征化學(xué)位移段（單位：ppm）。0～1.00 ppm化學(xué)位移段1個：0.96；2.02～3.00 ppm段9個：2.04、2.12、2.16、2.36、2.40、2.48、2.52、2.80、3.00；3.02～4.00 ppm段3個：3.24、3.76、3.92；4.00～6.00 ppm段2個：4.28、6.50。通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，確定6個有統(tǒng)計學(xué)意義的信號化學(xué)位移段：2.04 ppm、2.12 ppm、3.00 ppm、3.24 ppm、3.76 ppm、6.50 ppm。通過人類代謝數(shù)據(jù)庫（http：//www.hmdb.ca/），設(shè)置在上述特征位移段±0.02 ppm查詢代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)14種最能反映與對照組區(qū)別的小分子代謝產(chǎn)物（表4）。

2.3代謝特征分析

通過查閱KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步分析以上小分子物質(zhì)所位于的代謝路徑。課題組進(jìn)行最后分析，確定了不隨意運(yùn)動型腦癱患兒的異常特征代謝，表明在腦癱患兒中?；撬岽x通路、三羧酸循環(huán)活動下降，而谷氨酸代謝通路上升。見圖2。

表1　不隨意運(yùn)動型腦癱患兒性別、年齡、病因及MRI

表2　患兒步態(tài)及語言基本臨床表現(xiàn)

表3　兩組一般資料比較

圖1　偏最小二乘法模型得分圖

表4　根據(jù)VIP值及代謝數(shù)據(jù)庫確定相關(guān)性高的小分子物質(zhì)

圖2　不隨意運(yùn)動型腦癱代謝異常擾動圖

3　討論

在以往眾多研究中，都有證據(jù)表明腦癱患兒與正常兒童機(jī)體代謝有著顯著差異。腦癱患兒常生長發(fā)育遲緩，在粗大運(yùn)動功能分級重度到極重度的患兒中，發(fā)現(xiàn)骨密度較正常兒童明顯降低［15］；另外，肌纖維和Ⅰ型膠原蛋白會在腦癱患兒肌細(xì)胞內(nèi)過量堆積，也造成肌細(xì)胞的不可逆損害和粗大運(yùn)動功能的提升受限［16］；除了在運(yùn)動系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，腦癱患兒在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等也存在不同程度的缺陷［17］。本實(shí)驗(yàn)納入的不隨意運(yùn)動型腦癱患兒BMI低于對照組，說明患兒在腦癱致病條件下，全身骨骼肌肉不自主收縮，加重消耗，也可對消化功能及生長發(fā)育產(chǎn)生一定影響。更加說明作為臨床醫(yī)生及康復(fù)醫(yī)生，應(yīng)將患兒作為一個整體，全面看待其身體功能轉(zhuǎn)歸及代謝變化。雖然國內(nèi)也曾有報道對類似的運(yùn)動障礙、肌張力障礙疾病的代謝組學(xué)研究，但還沒有針對不隨意運(yùn)動型腦癱患兒的報道，也沒有較明確的代謝網(wǎng)絡(luò)異常通道比較分析［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，?；撬?、谷氨酰胺和能量代謝通路擾動異常在患兒體內(nèi)有意義，其中?；撬岽x通路擾動明顯。人體內(nèi)含有大量?；撬帷Ｋ粌H僅是作為一種必需能量物質(zhì)，參與機(jī)體的生長代謝，而且還能夠參與維持機(jī)體的免疫功能，調(diào)節(jié)全身多系統(tǒng)正常工作。已有研究發(fā)現(xiàn)?；撬嵬反x異常與許多運(yùn)動障礙性疾病有關(guān)。有研究表明，在舞蹈病大鼠中，腦組織中多個區(qū)域的牛磺酸含量下降［18］，給予?；撬嶂委熀螅嚓P(guān)酶活性上調(diào)，患病大鼠的運(yùn)動能力明顯提高［19］。在帕金森病患者腦脊液中，?；撬岷拷档?，給予立體定向高頻電刺激手術(shù)后，在運(yùn)動能力改善的患者中發(fā)現(xiàn)，殼核和尾狀核中牛磺酸含量較術(shù)前升高［20］。一系列研究顯示，?；撬嵬ㄟ^減弱氧化反應(yīng)途徑，抵抗凋亡，穩(wěn)定細(xì)胞膜通透性，來保護(hù)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的?；撬岽x異常，如果在不隨意運(yùn)動型腦癱患兒中具有普遍性，干預(yù)?；撬岽x有可能成為治療腦癱的新方向。

谷氨酰胺含量升高及其代謝通路異常，是本實(shí)驗(yàn)另一發(fā)現(xiàn)。在缺血缺氧體外模型中，隨著損傷的加重，谷氨酰胺也釋放增多［22］。谷氨酸酰胺的興奮性毒性也被證明與許多神經(jīng)退化性疾病相關(guān)。例如在多發(fā)性硬化患者中，過度的谷氨酰胺釋放，導(dǎo)致其離子型和代謝型受體活性升高，加速細(xì)胞漿內(nèi)的Ca2+堆積而后加速細(xì)胞凋亡［23］。谷氨酰胺代謝通路在不隨意運(yùn)動型腦癱患兒中上升也進(jìn)一步印證其作為興奮性毒性產(chǎn)物對患兒的損害。

在本研究中，患兒血清三羧酸能量循環(huán)減弱也是另一重要發(fā)現(xiàn)。三羧酸循環(huán)不僅是人體內(nèi)能量代謝的中心，也是糖、蛋白質(zhì)、脂類三大物質(zhì)代謝的樞紐。在本研究中發(fā)現(xiàn)檸檬酸、延胡索酸、丁酮二酸等循環(huán)網(wǎng)絡(luò)中重要物質(zhì)含量下降，一方面可能與腦癱患兒產(chǎn)生能量物質(zhì)能力下降或循環(huán)路徑不暢有關(guān)；另一方面也可能是由于患兒消耗增加所致。三羧酸代謝異常也會導(dǎo)致一系列運(yùn)動障礙疾病。延胡索酸缺乏癥是一種在胎兒期極其少見的常染色體隱性遺傳病，可導(dǎo)致不隨意運(yùn)動、癲癇等［24］。而通過口服二甲基延胡索酸，可以作為治療多發(fā)性硬化的方法之一［25］。

雖然納入患兒都應(yīng)被歸為不隨意運(yùn)動型腦癱，但病因包括出生后黃疸、產(chǎn)時缺氧、產(chǎn)后腦出血和高熱驚厥，且腦損傷部位、臨床表現(xiàn)并不完全相同。本研究樣本量偏少，組內(nèi)患兒身體狀態(tài)、腦損傷程度、臨床表現(xiàn)等具有一定差異。今后的工作將繼續(xù)收集相關(guān)的病例資料，分析相關(guān)影響因素，利用代謝組學(xué)方法，結(jié)合其他分子學(xué)方法，定量分析本研究得出的通路上擾動代謝產(chǎn)物上下游關(guān)系。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)方法研究不隨意運(yùn)動型腦癱患兒內(nèi)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)包括?；撬岽x通路、谷氨酰胺代謝通路及能量代謝通路異常，為病理生理機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

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Metabolic Profile of Dyskinetic Cerebral Palsy Based on Metabonomics

CHEN Jun-chen1，2，HE Xia2，DUAN Yu2，PENG Yun-chuan2，ZHANG Ming-wei1
1.Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；2.Sichuan Rehabilitation Hospital，Chengdu，Sichuan 611135，China
Correspondence to ZHANG Ming-wei.E-mail：drcc82@163.com

Objective To analyze the metabolic profile of children with dyskinetic cerebral palsy by metabolomics，and its abnormal metabolic pathway.Methods The serum of 10 children with dyskinetic cerebral palsy（patient group）and 7 healthy children（control group）aged 6 to 12 years were collected at clinic from May to August，2014.The serum samples were tested by the nuclear magnetic resonance spectrometer and the spectroscopies were discriminated by partial least squares-discriminant analysis.According to the human metabolome database，the final metabolites disturbed would be figured out.Results 15 chemical shifts were defined，and 6 of them，including 2.04 ppm，2.12 ppm，3.00 ppm，3.24 ppm，3.76 ppm，6.50 ppm，were significantly different between 2 groups（P＜0.05）.The KEGG Pathway Database showed that the levels of taurine，fumarate，oxaloacete，pyruvate，citrate，aspartate，succinate，malate，cysteine decreased，and the levels of glutamate，2-oxoglutarate，glutamine，leucine，alanine increased.The abnormal metabolism was found in taurine metabolism，glutamine metabolism and energy metabolism pathways.Conclusion Based on metabolomics，the metabolic profile of children with dyskinetic cerebral palsy was discriminated out successfully.The further research can focus on the small molecules found out.

cerebral palsy；dyskinetia；metabolomics；nuclear magnetic resonance spectroscopy；partial least square discriminant analysis

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.016

R742.3

A

1006-9771（2016）04-0448-07

（2015-09-27

2015-10-28）