碰撞誘導(dǎo)解離和高能碰撞解離方式進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的比較

王　曌，孫　偉

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京　100005)

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碰撞誘導(dǎo)解離和高能碰撞解離方式進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的比較

王曌，孫偉

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京100005)

為了比較碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation，CID)和高能碰撞解離(high energy collision dissociation，HCD)兩種離子裂解模式在蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面的差異，分別應(yīng)用這兩種模式對(duì)牛血清白蛋白和細(xì)胞裂解物進(jìn)行分析。通過(guò)比較所鑒定到的多肽和蛋白數(shù)目，發(fā)現(xiàn)在牛血清白蛋白中，HCD碎裂方法所得的譜圖匹配率和多肽Mascot得分均較高，表明其質(zhì)譜圖質(zhì)量較好。在復(fù)雜樣品細(xì)胞裂解物分析中，CID碎裂方法鑒定到的譜圖數(shù)、多肽數(shù)和蛋白數(shù)目均較多，表明該模式的靈敏度較高；HCD碎裂方法所得的譜圖匹配率和Mascot得分均較高，表明其質(zhì)譜圖質(zhì)量較好。因此，這兩種模式均可用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析，CID模式可提供更高的靈敏度，而HCD模式則可獲得更高質(zhì)量的質(zhì)譜譜圖。

質(zhì)譜；碰撞誘導(dǎo)解離(CID)；高能碰撞解離(HCD)；蛋白質(zhì)組學(xué)分析

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的母離子碎裂方法主要有碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation, CID)和高能碰撞解離(high energy collision dissociation, HCD)[1]。二維線性離子阱質(zhì)譜(LTQ)的CID模式在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的使用最為廣泛，該模式通過(guò)CID方法碎裂母離子，然后子離子在LTQ分析器中以低分辨率和精度進(jìn)行掃描，其掃描速度快，但二級(jí)譜圖的質(zhì)量分辨率較低，同時(shí)有離子阱的“三分之一效應(yīng)”，限制了該模式在翻譯后修飾以及一些定量分析中的應(yīng)用。應(yīng)用傅里葉變換(FT)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(orbitrap)作為分析器的HCD模式，其碎裂過(guò)程類似于三重四極桿質(zhì)譜[2-3]，可以克服離子阱的“三分之一效應(yīng)”[2,4]，碎裂效率高，已成功應(yīng)用于翻譯后修飾[2,4-5]、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)的研究[1,6-7]中。

CID和HCD已廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析中[8-12]，一些文獻(xiàn)直接或間接地比較了這兩種碎裂模式的不同[6,13-15]，但并沒(méi)有全面分析二者在蛋白質(zhì)組鑒定上的差別以及各自的特點(diǎn)，也沒(méi)有同時(shí)使用不同復(fù)雜性、豐度范圍組成的蛋白質(zhì)樣品對(duì)這兩種碎裂模式進(jìn)行綜合比較。因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用簡(jiǎn)單樣品牛血清白蛋白(BSA)和復(fù)雜樣品細(xì)胞裂解物的酶切產(chǎn)物對(duì)CID和HCD模式的性能進(jìn)行全面地分析比較。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀、Advance CaptiveSpray噴霧源：美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Acquity UPLC液相色譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；反相C18毛細(xì)管液相色譜柱：美國(guó)Michrom Bioresources公司產(chǎn)品。

HPLC級(jí)乙腈(ACN)、甲酸(FA)、碳酸氫銨、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、測(cè)序級(jí)胰蛋白酶、苯甲基磺酰氟(PMSF)：均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；去離子水：由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白樣品制備人肝癌細(xì)胞系(Huh7.5.1)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含2 mmol/LL-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素，100 g/L鏈霉素)中培養(yǎng)。將細(xì)胞收獲在50 mL離心管中，以2 000 r/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌5次后，加入裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)，50 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L 核糖核酸(RNA)酶，1 mmol/L脫氧核糖核酸(DNA)酶)，冰上裂解。用Bradford法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。

1.2.2蛋白酶切首先將蛋白樣品加入到20 mmol/L DTT中，于95 ℃還原3～5 min，然后轉(zhuǎn)移至10 ku過(guò)濾器中，用8 mol/L尿素洗滌1次，以12 000 r/min離心40 min；向混合物中加入55 mmol/L IAA，在黑暗條件下進(jìn)行30 min烷基化反應(yīng)，然后用8 mol/L尿素洗滌2次；再用50 mmol/L碳酸氫銨洗滌蛋白溶液1次，加入胰蛋白酶(1 μg/50 μg蛋白)，于37 ℃下消化過(guò)夜；最后將所得的多肽混合物在Waters OASIS C18固相萃取柱上脫鹽；所有樣品都冷凍干燥，待質(zhì)譜分析。

1.2.3液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析將凍干樣品重溶于0.1%甲酸(緩沖液A)中，用反相C18毛細(xì)管液相色譜柱(100 μm×150 mm×3 μm)分離；再用5%～30%緩沖液B(0.1%甲酸-99.9%乙腈)進(jìn)行梯度洗脫，BSA樣品洗脫時(shí)間為15 min，細(xì)胞樣品洗脫時(shí)間為100 min；使用LTQ-Orbitrap Velos進(jìn)行樣品分析，儀器設(shè)置的3種模式列于表1。

表1LTQ-Orbitrap Velos三種模式的參數(shù)設(shè)置

Table 1LTQ-Orbitrap Velos parameter settings of three modes

儀器模式一級(jí)質(zhì)譜分辨率二級(jí)質(zhì)譜分析器二級(jí)質(zhì)譜激活時(shí)間/ms二級(jí)質(zhì)譜分辨率自動(dòng)增益控制二級(jí)質(zhì)譜最大注入時(shí)間/ms數(shù)據(jù)依賴掃描數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量二級(jí)質(zhì)譜觸發(fā)閾值FT-LTQ-CID60000LTQ10單位質(zhì)量50001002035500FT-FT-CID30000Orbitrap107500500005001035500FT-FT-HCD30000Orbitrap0.175005000050010405000

其他設(shè)置包括：內(nèi)部質(zhì)量校正(m/z445.120 025離子作為鎖定質(zhì)量且目標(biāo)鎖定質(zhì)量豐度為0%)；電荷狀態(tài)檢查(排除未知帶電狀態(tài)或+1電荷態(tài)的母離子)；動(dòng)態(tài)排除(排除列表為500個(gè)離子，排除持續(xù)時(shí)間為90 s)。

1.2.4數(shù)據(jù)處理采用Mascot(Matrix Science, version 2.3.02)對(duì)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行檢索，所用數(shù)據(jù)庫(kù)為IPI數(shù)據(jù)庫(kù)(bovine and human, www.ebi.ac.uk/IPI/, version 3.07)。檢索條件為：胰酶酶切，允許有2個(gè)漏切位點(diǎn)，固定修飾為半胱氨酸+57 u；肽段檢索誤差為5×10-6，子離子容許誤差分別為0.5 u(FT-LTQ-CID)、0.02 u(FT-FT-CID, FT-FT-HCD)。鑒定結(jié)果的假陽(yáng)性率均為譜圖水平的1%。

2　結(jié)果與討論

2.1簡(jiǎn)單樣品酶解產(chǎn)物的分析比較

目前，在LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀上進(jìn)行CID和HCD兩種碎裂方式的比較一般采用FT-LTQ-CID和FT-FT-HCD兩種模式。這兩種模式母離子碎裂后的譜圖采集方式分別為低分辨離子肼(CID)和高分辨軌道肼(HCD)，因此它們的采集模式、采集時(shí)間和二級(jí)譜圖質(zhì)量均不同。為了排除由于采集方式不同而造成的鑒定結(jié)果的不同，本研究嘗試用FT-LTQ-CID，F(xiàn)T-FT-HCD和FT-FT-CID 3種模式同時(shí)進(jìn)行分析比較，以全面分析CID和 HCD兩種碎裂方式在蛋白質(zhì)鑒定上的差別。

在BSA胰蛋白酶酶解產(chǎn)物分析中，考察了不同上樣量(0.1、1、10、100 fmol)在3種模式下的差異，每種上樣量重復(fù)分析3次，結(jié)果示于圖1。

由圖1a可見，當(dāng)上樣量為1～100 fmol時(shí)，F(xiàn)T-FT-HCD模式鑒定到的二級(jí)譜圖數(shù)最多。由圖1c可見，在各上樣量條件下，F(xiàn)T-LTQ-CID模式采集到的二級(jí)譜圖數(shù)目均為最多，F(xiàn)T-FT-HCD模式均為最少，表明這3種模式的二級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)間存在差異。

在1～100 fmol上樣量時(shí)，3種模式鑒定到的多肽數(shù)無(wú)明顯差異，示于圖1b。而FT-FT-HCD和FT-FT-CID模式的二級(jí)譜圖匹配率(鑒定到的二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)/采集到的二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù))高于FT-LTQ-CID，示于圖1d，表明前兩種模式獲得的譜圖質(zhì)量較高。

為了深入地比較這3種模式的差異，選取3種模式中每種上樣量條件下都能鑒定到的4種多肽(“CCTESLVNR”，“LVNELTEFAK”，“KVPQVSTPTLVEVSR”，“YICDNQDTISSK”)，計(jì)算其平均Mascot得分，結(jié)果示于圖1e。結(jié)果表明，在1～100 fmol上樣量時(shí)，F(xiàn)T-FT-CID和FT-FT-HCD模式的得分明顯高于FT-LTQ-CID模式，進(jìn)步說(shuō)明了FT-FT-CID和FT-FT-HCD模式下獲得的二級(jí)譜圖質(zhì)量更高。

為了考察實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)間BSA鑒定二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)目的變異系數(shù)(CV)分析，結(jié)果示于圖1f。由圖可見，在1～100 fmol上樣量時(shí)，3種模式的CV值都小于5%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性良好。在最低上樣量0.1 fmol時(shí)，3種模式的CV值分別為66%(FT-FT-CID)，30%(FT-LTQ-CID)和15%(FT-FT-HCD)。這表明，F(xiàn)T-FT-CID和FT-LTQ-CID 兩種模式的最低上樣量應(yīng)高于0.1 fmol，而FT-FT-HCD模式的最低上樣量可為0.1 fmol。因此，在簡(jiǎn)單樣品分析時(shí)，F(xiàn)T-FT-HCD模式靈敏度最高。

2.2復(fù)雜細(xì)胞樣品酶解產(chǎn)物的分析比較

本研究選用細(xì)胞裂解產(chǎn)物酶切后所得到的肽段進(jìn)行3種模式的復(fù)雜樣品分析比較，每種模式重復(fù)分析2次，結(jié)果列于表2。

圖1　三種模式分析BSA胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的結(jié)果比較Fig.1　Comparison of FT-FT-CID, FT-FT-HCD and FT-FT-CID modes on a BSA digest

儀器模式蛋白數(shù)(≥1肽段)(≥2肽段)a多肽數(shù)b二級(jí)譜圖采集的譜圖數(shù)鑒定的譜圖數(shù)匹配率/%cFT-LTQ-CID185711108873393791846846.90FT-FT-CID14608466586283401464251.67FT-FT-HCD16419787757319091831257.39

注：a.鑒定到2個(gè)及以上唯一多肽的蛋白數(shù)；b.唯一多肽數(shù)；c.二級(jí)譜圖匹配率=鑒定的譜圖數(shù)/采集的譜圖數(shù)

由表2可見，3種模式下，F(xiàn)T-LTQ-CID模式采集的二級(jí)譜圖數(shù)目、多肽數(shù)和蛋白數(shù)目均最多，表明該模式的靈敏度最高。FT-FT-HCD模式獲得的二級(jí)譜圖總掃描數(shù)比FT-LTQ-CID模式少20%，但二者可成功鑒定的二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)目卻相似，而且FT-FT-HCD的二級(jí)質(zhì)譜圖匹配率比FT-LTQ-CID模式高，表明HCD的譜圖質(zhì)量較高。但FT-FT-HCD模式鑒定到的蛋白和多肽數(shù)比FT-LTQ-CID少10%，表明該模式的檢測(cè)靈敏度較低。FT-FT-CID模式所得的總二級(jí)質(zhì)譜圖、蛋白和多肽數(shù)目均為最少，但二級(jí)質(zhì)譜圖匹配率卻比FT-LTQ-CID高，表明前者的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量較好。

本研究對(duì)每種模式進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列于表3。由表3可知，3種模式在蛋白質(zhì)水平的重復(fù)率均超過(guò)80%。分別對(duì)鑒定到的蛋白和多肽做一元線性回歸分析，其線性相關(guān)系數(shù)R2均大于95%，表明兩組實(shí)驗(yàn)之間的數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。

表3三種模式分析復(fù)雜蛋白樣品的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

Table 3Repeatability of FT-FT-CID,FT-FT-HCD and FT-LTQ-CID modes for assessing complex proteins samples

儀器模式蛋白鑒定重復(fù)率/%多肽鑒定重復(fù)率/%R2/%FT-LTQ-CID80.075.597.1FT-FT-CID86.884.295.8FT-FT-HCD87.986.298.0

利用多肽的Mascot得分進(jìn)一步分析3種模式的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量。3種模式的平均Mascot得分分別為68.73(FT-LTQ-CID)、76.63(FT-FT-CID)和74.83(FT-FT-HCD)。為了更好地展現(xiàn)3種模式二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量的差別，按Mascot得分區(qū)段將3種模式鑒定到的多肽進(jìn)行劃分，示于圖2。由圖可見：FT-LTQ-CID模式在Mascot得分小于50的多肽中所占比例最大，在得分大于100的多肽中所占比例最??；FT-FT-HCD模式在Mascot得分小于50的多肽中所占比例最少，而在得分大于100的多肽中所占比例最大。以上結(jié)果表明，F(xiàn)T-FT-HCD模式的平均Mascot得分比另外兩種模式高，進(jìn)而說(shuō)明FT-FT-HCD模式獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量最好。

2.3討論

FT-LTQ-CID模式的母離子碎裂和子離子掃描都在離子阱中進(jìn)行，因此該模式的循環(huán)時(shí)間最短、掃描速度最快、所得總譜圖數(shù)量最多；FT-FT-HCD模式先將母離子轉(zhuǎn)移至八極桿中進(jìn)行碎裂，然后在Orbitrap中進(jìn)行子離子掃描，該模式的掃描時(shí)間最長(zhǎng)、掃描速度最慢、所得總譜圖數(shù)量最少；FT-FT-CID模式母離子碎裂在離子阱中進(jìn)行，子離子掃描在Orbitrap中進(jìn)行，該模式的掃描時(shí)間、循環(huán)時(shí)間、所得總譜圖數(shù)量均介于FT-LTQ-CID模式和FT-FT-HCD模式之間[16-18]。

FT-LTQ-CID模式掃描速度快、循環(huán)周期短，采集到的二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)最多，鑒定到的蛋白和多肽數(shù)目最多，但由于掃描時(shí)間的限制，該模式所得的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量較低，因此二級(jí)質(zhì)譜圖的鑒定率、多肽Mascot得分也較低；FT-FT-HCD模式掃描速度慢，所采集到的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量最好，多肽的Mascot得分最高，因此具有最高的二級(jí)質(zhì)譜圖鑒定率[19-20]。

圖2　三種模式下，在復(fù)雜樣品中鑒定到的多肽Mascot得分分布Fig.2　Mascot score distribution of FT-FT-CID, FT-FT-HCD and FT-LTQ-CID modes from cell lysates

有兩個(gè)因素可以解釋這些現(xiàn)象：首先，F(xiàn)T-FT-HCD模式使用Obitrap作為分析器，其產(chǎn)生的二級(jí)譜圖具有更高的分辨率和準(zhǔn)確性，從而在Mascot搜索引擎中更容易將二級(jí)質(zhì)譜圖分配給多肽，且得分更高；其次，在都使用Obitrap分析器的前提下，F(xiàn)T-FT-HCD模式比FT-FT-CID模式鑒定到了更多的蛋白質(zhì)和多肽，而且成功匹配率和Mascot得分分布均較高，表明FT-FT-HCD模式獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖質(zhì)量比FT-FT-CID模式好，這可能是由于HCD碎裂模式可以克服離子阱的“三分之一效應(yīng)”，獲得了更多的子離子信息，因此比CID碎裂更高效。

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)FT-LTQ-CID、FT-FT-HCD、FT-FT-CID進(jìn)行同時(shí)分析比較，發(fā)現(xiàn)FT-LTQ-CID模式的靈敏度最高、掃描速度最快，可用于蛋白質(zhì)樣品的定性和定量分析；而FT-FT-HCD模式的碎裂效率更高、二級(jí)譜圖質(zhì)量更好，同樣也可以用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析，特別是細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC)和iTRAQ定量方法中。

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Comparison of Collision Induced Dissociation and High Energy Collision Dissociation for Proteomic Analysis

WANG Zhao, SUN Wei

(InstituteofBasicMedicalSciencesofChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicineofPekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

To comprehensively compare the difference of collision induced dissociation (CID) and high energy collision dissociation (HCD), the tryptic digests of bovine serum albumin (BSA) and cell lysates were analyzed by LTQ-Velos Orbitrap. The HCD fragmentation identified more peptides and this mode showed higher MS/MS success rate and higher Mascot score in the tryptic digests of BSA. The results demonstrated that the HCD fragmentation has higher MS/MS spectra quality than CID. But in the tryptic digests of cell lysates, the CID fragmentation identified more MS/MS spectra, peptides and proteins, which indicated that it produces higher sensitivity. The HCD fragmentation shows higher MS/MS success rate and higher Mascot score distribution, demonstrating higher quality of MS/MS spectrum. Therefore, based on these findings, both CID and HCD modes could be used for large-scale proteomic analysis. The CID mode has higher sensitivity, and HCD mode can achieve higher quality of MS/MS spectrum.

mass spectrometry; collision induced dissociation (CID); high energy collision dissociation (HCD); proteomic analysis

2015-06-11;

2015-08-11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB530805、2014CBA02005)；中國(guó)科技部重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2013FY114100)資助

王曌(1989—)，女(漢族)，山東人，碩士研究生，藥理學(xué)專業(yè)。

E-mail: wangzhao_0508@163.com

孫偉(1973—)，男(漢族)，吉林人，副研究員，從事臨床蛋白質(zhì)組學(xué)及生物信息學(xué)研究。E-mail: sunwei1018@sina.com

O657.63

A

1004-2997(2016)01-0140-07

10.7538/zpxb.youxian.2016.0004

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-01-19；網(wǎng)絡(luò)出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160119.0905.002.html