竇 亮,何 明,董克君,武紹勇,龐芳芳,2,王小明,楊旭冉,趙慶章,姜 山
(1.中國(guó)原子能科學(xué)研究院核物理研究所,北京 102413;2.廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 桂林 541004)
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利用AMS測(cè)量方法研究大鼠的鈣吸收率
竇亮1,何明1,董克君1,武紹勇1,龐芳芳1,2,王小明1,楊旭冉1,趙慶章1,姜山1
(1.中國(guó)原子能科學(xué)研究院核物理研究所,北京102413;2.廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣西 桂林541004)
鈣是人體所必需的元素之一,參與眾多的生命生理調(diào)控,準(zhǔn)確測(cè)量生物體的鈣吸收率,對(duì)于合理補(bǔ)鈣和預(yù)防鈣代謝疾病具有重要意義。本研究采用41Ca標(biāo)記SD大鼠體內(nèi)鈣庫(kù),利用加速器質(zhì)譜(AMS)法測(cè)量長(zhǎng)壽命放射性核素41Ca靈敏度高的特點(diǎn),開展對(duì)大鼠鈣吸收率的準(zhǔn)確測(cè)定。結(jié)果表明:大鼠每100 g體重每天攝入28 mg碳酸鈣、28 mg檸檬酸鈣、10 mg碳酸鈣的表觀吸收率分別為(67.57±2.79)%、(65.21±2.96)%、(87.50±1.10)%,凈吸收率分別為(73.19±3.60)%、(71.47±4.01)%、(92.74±1.81)%。該方法可以得出鈣的真實(shí)吸收率,且不受所評(píng)價(jià)的鈣劑中鈣的化學(xué)形式和種類的影響,進(jìn)一步拓展了同位素評(píng)價(jià)鈣吸收率的應(yīng)用領(lǐng)域,可為建立適宜于我國(guó)人民的鈣參考攝入量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
加速器質(zhì)譜(AMS);內(nèi)源鈣庫(kù)法;SD大鼠;真實(shí)吸收率;表觀吸收率
鈣是人體的必需元素,它參與調(diào)控眾多的生命生理過(guò)程,骨鈣的流失會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥(OP)等多種疾病[1]。據(jù)悉,2009年中國(guó)因缺鈣而患骨質(zhì)疏松癥的總?cè)藬?shù)達(dá)9千萬(wàn)[2],因此,補(bǔ)鈣已成為社會(huì)的流行趨勢(shì)。但研究表明,如果生物體內(nèi)攝入過(guò)量的鈣,會(huì)因鈣的代謝異常而產(chǎn)生多種疾病,例如腎臟、血管等軟組織異位鈣化[3-4]。目前,關(guān)于生物體鈣含量與骨質(zhì)疏松癥的臨床和機(jī)理研究存在2個(gè)主要問(wèn)題:1) 鈣在生物體內(nèi)的代謝調(diào)控機(jī)制尚不明確。目前,對(duì)攝入鈣的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)途徑以及與鈣離子通道的相互關(guān)系[5],骨質(zhì)疏松與動(dòng)脈硬化的關(guān)聯(lián)[6]以及異位鈣化的機(jī)理[7]等都不十分清楚。攝入鈣的吸收途徑、血鈣的代謝途徑、異位沉積機(jī)理等也都沒(méi)有明確的結(jié)論,這使得與鈣代謝相關(guān)疾病的防治存在隨意性和不確定性。鈣源的物理化學(xué)特性與個(gè)體吸收差異使統(tǒng)計(jì)學(xué)水平的研究結(jié)論難以指導(dǎo)對(duì)鈣代謝異常相關(guān)疾病的防治。2) 我國(guó)人民的鈣攝入量標(biāo)準(zhǔn)尚不確定。在2000年中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)上修訂了我國(guó)居民膳食鈣適宜的攝入量(AI),18歲以上為800 mg/d,50歲以上為1 000 mg/d。2002年中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報(bào)告表明:我國(guó)居民每標(biāo)準(zhǔn)人日鈣攝入量只有388.8 mg,其中,城市為438.6 mg,農(nóng)村為369.6 mg,僅為推薦值的50%左右。因?yàn)檫@個(gè)推薦值參考了美國(guó)的數(shù)據(jù),并沒(méi)有仔細(xì)的科學(xué)評(píng)價(jià),由此引發(fā)的問(wèn)題是:一方面,這個(gè)值與世界衛(wèi)生組織的推薦值500 mg[2]相差較大;另一方面,人體中鈣的攝入從400 mg增加到800 mg,是否會(huì)對(duì)人體鈣代謝產(chǎn)生影響。因此,鈣的攝入量是一個(gè)有待研究的重要問(wèn)題,我國(guó)急需建立一套符合國(guó)民身體需求的鈣參考攝入量標(biāo)準(zhǔn)。
在鈣的吸收率研究中,常用的方法有藥代動(dòng)力學(xué)法、尿增量法、鈣平衡法、同位素(45Ca,47Ca,46Ca,48Ca)示蹤法等[8-11],但都缺乏系統(tǒng)、深入地研究,數(shù)據(jù)可比性差。同時(shí),各種方法都存在較明顯的局限性,因此,文獻(xiàn)報(bào)道中的鈣吸收率,尤其是較長(zhǎng)時(shí)間的鈣吸收率數(shù)據(jù)并不準(zhǔn)確。
目前,測(cè)量生物體鈣吸收率的黃金方法是雙標(biāo)穩(wěn)定性同位素示蹤法[12]。其基本原理是,將待測(cè)鈣源用一種鈣的穩(wěn)定同位素標(biāo)記,以口服方式攝入,然后靜脈注射另一種鈣穩(wěn)定同位素;一定時(shí)間后,這兩種鈣穩(wěn)定同位素在體內(nèi)達(dá)到代謝平衡,具有相同的代謝行為;收集24~48 h尿液,通過(guò)測(cè)定同位素鈣比值推算鈣的吸收率。但該方法仍存在一些問(wèn)題:首先,該方法是以口服和靜脈注射的兩種穩(wěn)定性同位素鈣在生物體內(nèi)的代謝過(guò)程相同為前提的,然而這一假設(shè)并沒(méi)有得到證實(shí);其次,盡管實(shí)驗(yàn)中使用的是濃縮的穩(wěn)定同位素,但人體內(nèi)也有該穩(wěn)定同位素,存在內(nèi)源鈣的干擾,所以靈敏度和準(zhǔn)確性受到限制;此外,對(duì)于口服鈣劑,鈣元素存在多種化學(xué)形式;最后,用同位素標(biāo)記市售鈣劑必須保證每一種化學(xué)形式鈣的同位素豐度保持一致,這是普通同位素外標(biāo)法無(wú)法滿足的,因此會(huì)導(dǎo)致操作復(fù)雜,數(shù)據(jù)可信性較差,而且費(fèi)用極其昂貴。
41Ca輻射低、半衰期長(zhǎng),作為研究生物體鈣代謝的示蹤核素具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)[13]。41Ca標(biāo)記內(nèi)源鈣庫(kù)法是用41Ca標(biāo)記大鼠體內(nèi)鈣庫(kù)后,再以口服方式喂食鈣劑,通過(guò)測(cè)定糞便中的總鈣以及41Ca與40Ca的比值來(lái)實(shí)現(xiàn)鈣吸收率的準(zhǔn)確測(cè)定,由此可以實(shí)現(xiàn)任意條件下(鈣的化學(xué)形式、劑量、藥物等)鈣吸收率的準(zhǔn)確測(cè)定。本工作利用加速器質(zhì)譜(AMS)法測(cè)量長(zhǎng)壽命放射性核素41Ca靈敏度高的特點(diǎn),通過(guò)41Ca標(biāo)記SD大鼠體內(nèi)鈣庫(kù)的方法,分別測(cè)量SD大鼠對(duì)不同劑量的碳酸鈣和檸檬酸鈣的吸收率,并對(duì)鈣劑進(jìn)行評(píng)價(jià)。希望通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的模型建立、示蹤方法與測(cè)定,從根本上解決傳統(tǒng)生物示蹤技術(shù)的不足,從而為合理補(bǔ)鈣、建立適宜于我國(guó)人民的鈣參考攝入量標(biāo)準(zhǔn)奠定研究基礎(chǔ)。
1.141Ca標(biāo)記內(nèi)源鈣庫(kù)法測(cè)量鈣吸收率的原理
本實(shí)驗(yàn)采用的41Ca標(biāo)記內(nèi)源鈣庫(kù)法測(cè)量大鼠的鈣吸收率是在平衡法的基礎(chǔ)上,將含有41Ca的氯化鈣溶液以肌肉注射形式注入大鼠體內(nèi),標(biāo)記體內(nèi)鈣庫(kù)。待41Ca在體內(nèi)達(dá)到平衡后,即糞鈣中41Ca與40Ca的比值相對(duì)恒定后,喂食一定量的口服鈣劑,根據(jù)式(1)[8]可得到鈣的吸收率,即:
吸收率=((口服攝入鈣總量-糞鈣總量+糞鈣中內(nèi)源鈣總量)/口服攝入鈣總量)×100%
(1)
在式(1)中,口服攝入鈣總量已知,糞鈣總量可以通過(guò)原子光譜法測(cè)得。如何計(jì)算糞鈣中內(nèi)源鈣總量是問(wèn)題的關(guān)鍵,理想的計(jì)算方式示于式(2)[8],即:
糞鈣中內(nèi)源鈣總量=
(2)
由于口服鈣劑中不含有41Ca,糞鈣中的41Ca均來(lái)自于內(nèi)源鈣,因此,首先要計(jì)算糞鈣中內(nèi)源鈣所含有41Ca的豐度。這需要在建立大鼠體內(nèi)41Ca/40Ca平衡的前提下,跟蹤并計(jì)算糞鈣中內(nèi)源鈣所占有的量。
1.2動(dòng)物飼養(yǎng)及建模
大鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的斷乳3周后SD大鼠)正常飼養(yǎng)至3月齡,選取48只體重相近的雄性大鼠(SPF級(jí)),分為4組,分別標(biāo)記為A、B、C、D組,每組12只大鼠。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 14923—2010、GB 14924.3—2010、GB 14925—2010、GB 14922.2—2011)對(duì)大鼠進(jìn)行選擇和飼養(yǎng)。
采用肌肉注射法向A、B、C組大鼠右大腿注入540 μL氯化鈣儲(chǔ)備液(含54 ng41Ca);向D組大鼠右大腿注入540 μL不含41Ca的氯化鈣溶液(Ca2+濃度與儲(chǔ)備液相同)。大鼠的代謝與取樣情況列于表1。
表1 大鼠的代謝與取樣
注:1) 灌胃量為每只100 g的大鼠每天的灌胃量;2) 無(wú)鈣飼料的鈣含量低于0.03 g/kg,大鼠從飼料中攝入的鈣可忽略不計(jì)
A組和B組大鼠用于比較不同化學(xué)形式的鈣劑對(duì)鈣吸收率的影響,灌胃的碳酸鈣和檸檬酸鈣的劑量不同,但鈣含量相同;A組和C組大鼠用于比較不同劑量的鈣劑對(duì)鈣吸收率的影響;D組大鼠作為對(duì)照組。
注射41Ca后,收集大鼠每天的糞便樣品,并測(cè)量其41Ca/40Ca值,結(jié)果示于圖1。
從圖1可以看出,注射41Ca后第28天,41Ca/40Ca值趨于平衡。實(shí)驗(yàn)取注射后第35天到第49天糞便(除去第42天)中41Ca/40Ca的平均值作為糞便中41Ca/40Ca值,記為R總,攝入鈣的平均值記為S總,糞鈣總量為F總。由于第42天喂食的飼料中不含鈣,大鼠糞便中41Ca/40Ca值即為內(nèi)源鈣的比值,記為R內(nèi)。因此,表觀吸收率可表示為:
圖1 注射41Ca后,大鼠糞便中41Ca/40Ca值Fig.1 Ratio of 41Ca/40Ca in rat feces after injecting 41Ca
(3)
真實(shí)吸收率可以表示為:
(4)
2.1主要儀器與試劑
HI-13串列加速器質(zhì)譜(AMS):中國(guó)原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品;AA700CRT原子吸收分光光度計(jì):美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)品;5840R冰凍離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品;GSL1300型真空管式高溫爐:沈陽(yáng)科晶設(shè)備制造有限公司產(chǎn)品。
碳酸鈣、雙氧水、草酸胺均為分析純,鹽酸和氨水均為優(yōu)級(jí)純:北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品;硝酸和氫氟酸:均為MOS級(jí),北京化學(xué)試劑研究所產(chǎn)品。所有離心管、試管、坩堝、研缽、移液管、槍頭在使用前均用20%鹽酸浸泡48 h以上,然后用去離子水沖洗干凈、烘干備用。
2.2樣品制備
將100 g大鼠糞便樣品經(jīng)80 ℃烘干后,于瑪瑙研缽內(nèi)研碎;將研碎后的糞便樣品置于瓷坩堝內(nèi),在900 ℃馬弗爐中灼燒灰化3 h,冷卻后用硝酸-雙氧水混合溶液(4∶1,V/V)消解,蒸至近干,然后用去離子水稀釋至15 mL;加入等體積的飽和草酸胺,必要時(shí)滴加氨水維持pH 10左右,混勻后靜置3 h,以3 600 r/min離心5 min,去除上清液,用2 mL 2.5%草酸胺和2 mL去離子水分別洗滌沉淀2次;加入適量的(一般約為2 mL)4 mol/L硝酸溶解沉淀,然后用去離子水稀釋至15 mL;再加入6 mL氫氟酸,隔夜放置;以3 600 r/min離心10 min,用1 mL去離子水洗滌氟化鈣沉淀2次。將上述濕法制成的CaF2樣品由真空管式高溫爐充氬氣二次氟化并烘干,以進(jìn)一步提高氟氧比,具體流程如下:
1) 容器清洗:對(duì)爐管進(jìn)行嚴(yán)格的清洗并烘干,分別將聚四氟乙烯反應(yīng)料盒及支架先用硝酸,再用氫氟酸各浸泡24 h,然后用去離子水沖洗3次以上,烘干備用。
2) 樣品準(zhǔn)備:將濕法制得的氟化鈣與適量的濃氫氟酸混合,然后裝入料盒內(nèi),固定在支架上,一同放入真空爐內(nèi)。
3) 氟化反應(yīng):密封真空爐,啟動(dòng)機(jī)械泵抽真空后再充氬氣,重復(fù)3次,充氬氣至常壓,關(guān)閉兩端閥門,停止真空泵,緩慢升溫至150 ℃左右,保溫使其反應(yīng)4 h;然后抽真空分離過(guò)量的氟化氫,停止加熱;待爐內(nèi)溫度降低后小心取出,稱其質(zhì)量、真空干燥保存。
2.3原子吸收法測(cè)量總鈣
采用標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)原子吸收光譜儀進(jìn)行刻度,結(jié)果列于表2。
表2 刻度原子吸收光譜儀
以吸光度為橫坐標(biāo)x,鈣含量為縱坐標(biāo)y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,示于圖2。得到的線性回歸方程為y=34.726x,線性回歸系數(shù)R2=0.993 7。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的線性擬合曲線Fig.2 Linear fitting curve of standard samples
2.4AMS法測(cè)量糞便中41Ca/40Ca值
將制得的氟化鈣與氟化鉛按質(zhì)量比1∶4混合后壓入內(nèi)徑為1.5 mm的靶錐,在AMS測(cè)量過(guò)程中,離子源引出CaF3-負(fù)離子,加速器端電壓選為8.27 MV,膜剝離后的電荷態(tài)選為+7態(tài)。探測(cè)器為多陽(yáng)極充氣電離室,其中4塊陽(yáng)極板分別記錄不同粒子在同一氣體中的能量損失(ΔE1、ΔE2、ΔE3和剩余能量ΔER),從而實(shí)現(xiàn)同量異位素的鑒別[14]。電離室中充有丙烷氣體,氣壓為4.5 kPa。用偏置法拉第杯記錄束流強(qiáng)度,采用VME-MIDAS系統(tǒng)獲取數(shù)據(jù)。結(jié)合原子吸收光譜儀對(duì)總鈣進(jìn)行測(cè)量,其結(jié)果列于表3。
表3 測(cè)量結(jié)果列表
注:大鼠體重的多樣性是導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果多樣性的主要原因,模型采用每100 g大鼠的鈣吸收率代替整只大鼠的鈣吸收率,以減小相對(duì)誤差
綜合上述數(shù)據(jù),可以得到:
(6)
(7)
(8)
其中,φA、φB、φC分別為A、B、C組大鼠鈣的表觀吸收率。
100%=(73.19±3.60)%
(9)
100%=(71.47±4.01)%
(10)
100%=(92.74±1.81)%
(11)
其中,ηA、ηB、ηC分別為A、B、C組大鼠鈣的真實(shí)吸收率。
結(jié)果表明,大鼠對(duì)鈣的真實(shí)吸收率明顯高于表觀吸收率。在相同劑量下,A、B組大鼠對(duì)鈣的真實(shí)吸收率在誤差范圍內(nèi)大致相等。大鼠鈣攝入量在10 mg/100 g(大鼠體重)~30 mg/100 g(大鼠體重)范圍內(nèi)時(shí),A、C組大鼠對(duì)鈣的真實(shí)吸收率與鈣攝入量呈反比,當(dāng)鈣攝入量低于10 mg/100 g(大鼠體重)時(shí),口服攝入的鈣幾乎被大鼠完全吸收。
本實(shí)驗(yàn)采用輻射低、半衰期長(zhǎng)的41Ca標(biāo)記體內(nèi)鈣庫(kù),通過(guò)AMS法測(cè)量鈣吸收率,能避免傳統(tǒng)測(cè)量鈣吸收率的不足,排除內(nèi)源性鈣的干擾,得出真實(shí)的鈣吸收率,且不受所評(píng)價(jià)的鈣劑中鈣的化學(xué)形式和種類的影響,進(jìn)一步拓展了同位素評(píng)價(jià)鈣吸收率的應(yīng)用領(lǐng)域,為合理補(bǔ)鈣、建立適宜于我國(guó)人民的鈣參考攝入量標(biāo)準(zhǔn)奠定了研究基礎(chǔ)。該模型在市售鈣劑評(píng)價(jià)及臨床鈣代謝監(jiān)測(cè)方面有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。
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Study on Calcium Absorptivity of Rats by41Ca-AMS Measurement
DOU Liang1, HE Ming1, DONG Ke-jun1, WU Shao-yong1, PANG Fang-fang1,2,WANG Xiao-ming1, YANG Xu-ran1, ZHAO Qing-zhang1, JIANG Shan1
(1.ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China; 2.CollegeofPhysicalScienceandTechnology,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China)
Calcium is one of the essential elements that form human bone (the main form of calcium is Ca10(PO4)6(OH)2)), and it participates and regulates many life processes. Osteoporosis is the most common disease of calcium deficiency, while recent research shows that organisms(especially osteoporosis organisms) take in too much calcium, possibly causing some other diseases. Thus, the accuracy of calcium absorption rate measurement is very meaningful for reasonable calcium supplement and prevention diseases of calcium metabolism. Based on the high sensitivity of41Ca measurement with accelerator mass spectrometry and the innovative methods of41Ca labeling endogenous calcium, the calcium absorption rate of rats was studied. The results show that rats intake 28 mg calcium carbonate, 28 mg calcium citrate and 10 mg calcium citrate per 100 g body weight each day, the apparent absorption rates are (67.57±2.79)%, (65.21±2.96)% and (87.50±1.10)%, the static absorption rates are (73.19±3.60)%, (71.47±4.01)% and (92.74±1.81)%, respectively. This method can obtain the true absorption of calcium without extrinsic labeling, and it is not affected by the chemical structure and sorts of calcium supplements.
accelerator mass spectrometry (AMS);41Ca labeling endogenous calcium; SD rats; real absorption rate; apparent absorption rate
2015-04-30;
2015-08-06
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11375272)資助
竇亮 (1984—),男(漢族),山東日照人,助理研究員,從事粒子物理與原子核物理研究。E-mail: douer-2@163.com
O657.63
A
1004-2997(2015)05-0180-06
10.7538/zpxb.youxian.2015.0054
網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-11-16;網(wǎng)絡(luò)出版地址:http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20151116.1349.014.html