非小細(xì)胞肺癌切除組織中常用免疫組織化學(xué)指標(biāo)尚不能預(yù)測遠(yuǎn)期生存

申潞艷 康曉征 孫宇 付浩 戴亮 閆萬璞 陳克能

以免疫組織化學(xué)手段檢測非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）切除標(biāo)本中的相關(guān)蛋白用于組織分類、治療選擇及預(yù)后判斷，似乎已廣泛見諸于NSCLC的臨床實踐。然而，回顧各主要臨床指南及主要文獻(xiàn)卻發(fā)現(xiàn)在診斷方面較為成熟的指標(biāo)僅有鑒別鱗癌（P63、P40、CK5/6）與腺癌（TTF-1、Napsin A、CK7）的少數(shù)指標(biāo)[1]；用于治療選擇的也僅包括表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、MET、ROS-1及KRAS等幾個為數(shù)不多的指標(biāo)[2]；更多的免疫組化分子則是臨床嘗試用于判斷NSCLC預(yù)后的研究。相信國內(nèi)各家醫(yī)院隨著這一領(lǐng)域的研究進(jìn)展與變遷，也曾選用過許多不同的免疫組化分子標(biāo)記物，這些分子種類繁多，對預(yù)后影響的結(jié)果眾說紛紜，使臨床應(yīng)用產(chǎn)生過一些混亂。本研究就我院2008年-2013年在NSCLC中曾選用的免疫組化分子作一總結(jié)，尤其是這些分子與預(yù)后的關(guān)系在我們單醫(yī)生組前瞻性數(shù)據(jù)庫中作了驗證，供大家參考。

1 資料與方法

1.1 患者來源 北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院胸外科單一手術(shù)組（陳克能）2008年1月-2013年9月行根治性手術(shù)治療NSCLC患者共計722例。病理分期采用國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）/美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）第七版腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期系統(tǒng)[3]；病理分型采用2004年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）分型[4]；手術(shù)方式包括：肺葉切除術(shù)（n=598）、雙肺葉切除術(shù)（n=39）、全肺切除術(shù)（n=31）、袖式成型術(shù)（n=10）及其他（n=44）。

1.2 免疫組化指標(biāo) 共有12個指標(biāo)在不同時期被用于檢測，分別是血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor, PDGFR）、切除修復(fù)交叉互補1（excision repair cross complementing 1, ERCC1）、表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor, EGFR）、人血管內(nèi)皮生長因子受體 3（vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3）、NM23、MRP、P170、TS、Tubulin、核糖核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase M1, RRM1）、環(huán)氧酶2（cyclooxygenase 2, COX2）和TOPII。

1.3 免疫組化方法及判讀標(biāo)準(zhǔn) 由于該研究為回顧性研究，歷經(jīng)各種免疫組化方法，因此各指標(biāo)的具體染色方法及抗體來源等均予以忽略。但對再次判讀的方法做了規(guī)定：由兩位不了解臨床病理資料及研究內(nèi)容的病理科醫(yī)生采用盲法判讀。以陽性對照及陰性對照控制反應(yīng)體系質(zhì)量。分別從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核3方面判斷目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布特征。每張切片隨機選擇有代表性的10個高倍視野（×400），連續(xù)計數(shù)視野下染色陽性的腫瘤細(xì)胞。按照染色強度和染色面積（陽性細(xì)胞所占構(gòu)成比）進(jìn)行評分，最后將兩者相乘。無著色為0級計0分，淺黃色為1級計1分，棕黃色為2級計2分，棕褐色為3級計3分；染色面積評分如下：無著色為0分，≤30%計1分，30%-60%計2分，＞60%計3分，兩者相乘最終將得到0分、1分、2分、3分、4分、6分、9分七組數(shù)據(jù)。

1.4 生存隨訪信息 本研究組自2000年始建立了單一手術(shù)組的NSCLC前瞻性數(shù)據(jù)庫，其中隨訪原則為：術(shù)后2年內(nèi)每3個月隨訪檢查1次，2年-5年內(nèi)每6個月隨訪檢查1次，5年后每年隨訪檢查1次。全組生存計算為總生存隨訪，全病因死亡。隨訪起點為手術(shù)日，終點為死亡日期，末次隨訪時間為2015年8月。研究隊列隨訪主要為門診隨訪，達(dá)到80.0%，電話或書信隨訪僅占10.6%。門診隨訪內(nèi)容：記錄癥狀學(xué)、檢查包括血液學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)記物、胸部增強計算機斷層掃描（computed tomography, CT）、頭顱增強磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）、頸、腹部超聲、全身骨掃描檢查，2010年后部分患者有正電子發(fā)射型計算機斷層顯像（positron emission computed tomography, PET-CT）檢查。全組中位隨訪時間為36.1個月，存活患者中位隨訪時間為39.6個月。全組死亡患者117例，存活患者537例，失訪患者68例，全組隨訪率達(dá)90.6%。

表 1 免疫組化指標(biāo)染色情況與患者一般臨床病理資料之間的關(guān)系Tab 1 Association between biomarkers staining and tumor characteristics of patients with NSCLC

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采取卡方檢驗比較NSCLC各指標(biāo)表達(dá)與各臨床病理因素之間的關(guān)系。采取Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗分析判斷各指標(biāo)表達(dá)在NSCLC患者生存間的關(guān)系。采取Cox風(fēng)險比例模型分析NSCLC患者的獨立預(yù)后因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 12種免疫組化指標(biāo)的判讀結(jié)果 722例NSCLC患者中，1 2種免疫組化指標(biāo)染色的病例數(shù)分別為PDGFR（n=460）、ERCC1（n=461）、EGFR（n=460）、VEGFR3（n=451）、NM23（n=359）、MRP（n=351）、P170（n=353）、TS（n=431）、Tubulin（n=307）、RRM1（n=381）、COX2（n=364）、TOPII（n=235）（表1）。12種指標(biāo)的染色結(jié)果按照染色面積及染色強度的乘積計算得分，分為0分、1分、2分、3分、4分、6分、9分，不同分值的分布情況如圖1所示。

2.2 12種免疫組化指標(biāo)在NSCLC組織中的表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系 12種蛋白在NSCLC組織中均有不同程度的表達(dá)，表達(dá)陽性率分別為：PDGFR為78.9%（363/460）、ERCC1為 45.6%（304/461）、EGFR為66.1%（304/460）、VEGFR3為81.6%（368/451）、NM23為90.0%（323/359）、MRP為92.0%（323/351）、P170為60.1%（212/353）、TS為21.1%（91/431）、Tubulin為81.8%（251/307）、RRM1為53.8%（205/381）、COX2為72.0%（262/364）、TOPII為88.5%（208/235）（表1）。卡方檢驗分析12個指標(biāo)的表達(dá)與病理分期，組織類型之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR、VEGFR3、NM23、P170在腺癌中的陽性表達(dá)率明顯高于非腺癌，Tubulin在I期NSCLC中的陽性表達(dá)率明顯高于II期和III期NSCLC（表1）。

表 2 免疫組化指標(biāo)的表達(dá)水平不同對總生存的影響Tab 2 Overall survival according to biomarkers expression level

圖 1 免疫組化指標(biāo)染色評分的分布情況。o、★代表離散值。Fig 1 Distribution of immunohistochemistry scores. o, ★ represent discrete values.

圖 2 VEGFR3的表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后之間的關(guān)系（n=451）Fig 2 Association between VEGFR3 expression and prognosis of patients with NSCLC (n=451)

表 3 NSCLC患者Cox風(fēng)險比例模型分析Fig 3 Independent predictors of disease-free survival time in multivariate analysis

2.3 12種免疫組化指標(biāo)在NSCLC組織中的表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系 單因素生存分析結(jié)果顯示，在12個指標(biāo)中僅有VEGFR3的表達(dá)與本組患者的總生存明顯相關(guān)，其中VEGFR3陰性表達(dá)者的5年生存率明顯低于陽性表達(dá)者（65%vs77.6%）（圖2）；其他11種指標(biāo)的表達(dá)與患者的總生存間均無明顯相關(guān)性（表2）。但在多因素分析結(jié)果顯示，VEGFR3不是NSCLC的獨立預(yù)后因素（表3）。

3 討論

肺癌成功的治療始于1933年外科切除[5]，但直到1959年-1962年才從病理上區(qū)別了NSCLC與SCLC，隨后確立了SCLC不宜手術(shù)的概念[6]。至1967年才有了肺鱗癌、肺腺癌的分類[7]。但長期以來仍有相當(dāng)多的NSCLC從HE染色上不能區(qū)分鱗癌和腺癌，尤其是在活檢標(biāo)本中不能區(qū)分者高達(dá)30%-50%，然而隨著治療方法的改進(jìn)與更新要求我們對NSCLC應(yīng)該更準(zhǔn)確地進(jìn)行組織分類，尤其是肺腺癌的確認(rèn)直接關(guān)乎治療手段的選擇（化療、靶向治療）。因此，2011年確立了P63、P40、TTF-1、Napsin A作為區(qū)分NSCLC的除HE染色后又一金標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對HE不能分類者是必查項目[8]。同時，Ventana法檢測ALK在判斷是否應(yīng)用克唑替尼方面起了決定作用[9]，應(yīng)該說免疫組化分子檢查已成為當(dāng)今NSCLC臨床不可或缺的檢測手段。

回顧各國制定的NSCLC的各種指南，并沒有將任何免疫組化分子引入NSCLC的預(yù)后判斷系統(tǒng)，即便有學(xué)者將ERCC1用于判斷化療療效的指標(biāo)[10]，由于缺乏持續(xù)的臨床證據(jù)，也在隨后的實踐中停止應(yīng)用[11]。然而，探討免疫組化分子對NSCLC預(yù)后的影響的研究從未停止過，大規(guī)模研究可以追溯到2008年，迄今沒有得出較統(tǒng)一的認(rèn)識，究其原因如下：①抗體的來源和質(zhì)量不一；②染色流程不一；③評分體系不一；④統(tǒng)計方法不一；⑤小樣本的研究降低統(tǒng)計效能。正如近期Lindskog等[12]在綜述中指出的一樣，目前關(guān)于預(yù)測NSCLC預(yù)后的免疫組化標(biāo)記物的研究層出不窮，所涉及的分子繁多，但大量研究樣本量較小導(dǎo)致所得到的結(jié)論說服力不足；同時缺乏驗證數(shù)據(jù)；即使有少數(shù)的研究做了外部驗證，結(jié)果往往不一致。作者共納入2008年1月1日-2013年6月30日期間的347篇文獻(xiàn)，涉及342種蛋白分子；樣本量＜100的研究占三分之一以上，這些研究大多數(shù)為單個隊列的分析，僅有10項研究進(jìn)行了外部驗證。所涉及的分子中，有168個（49%）在兩項以上的研究中被報道，其中至少在兩篇報道中結(jié)果一致的分子僅有67個。這些分子目前沒有一個可用于臨床常規(guī)工作中。Zhu等[13]總結(jié)了1987年-2005年關(guān)于CCND1在NSCLC患者中的預(yù)后意義的15項研究，其中5項研究表明CCND1高表達(dá)，預(yù)后差；3項研究表明CCND1高表達(dá)預(yù)后好；其余7項研究都未發(fā)現(xiàn)CCD1表達(dá)與預(yù)后之間的相關(guān)性。因此，可以看出免疫組化分子用于判斷預(yù)后遇到極大的挑戰(zhàn)，染色流程的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范，更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯吭O(shè)計以及解讀方法等都是亟需解決的問題。

除了復(fù)習(xí)文獻(xiàn)外，我們回顧了我院2008年-2013年間NSCLC曾選用的免疫組化分子PDGFR、ERCC1、EGFR、VEGFR3、NM23、MRP、P170、TS、Tubulin、RRM1、COX2、TOPII的染色情況，分析這些指標(biāo)與NSCLC患者預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)只有VEGFR3的表達(dá)與患者生存相關(guān)，VEGFR3陽性表達(dá)者的5年生存率高于陰性表達(dá)者。關(guān)于這一指標(biāo)已有相關(guān)研究報道，Donnem等[14]在335例可切除的I期-IIIa期NSCLC患者的組織芯片中檢測了PDGFR-α、PDGFR-β、以及VEGFR-3蛋白水平的表達(dá)，進(jìn)而分析發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞共表達(dá)VEGFR-3和PDGF-B與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，且是獨立的預(yù)后不良因素（HR=4.8, 95%CI: 2.80-8.31,P＜0.001）。Andersen等[15]在55例可切除的I期-IIIa期行術(shù)后輔助化放療的患者組織中檢測了VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的表達(dá)，并分析了他們的表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系，發(fā)現(xiàn)僅單因素分析結(jié)果顯示VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3的高表達(dá)與患者預(yù)后較差相關(guān)。我們與以往研究的結(jié)果相反，同時我們的結(jié)果在多因素分析中也未能證實，這也反映了免疫組化檢測預(yù)后分子標(biāo)記物的現(xiàn)狀與困境，由于免疫組化固有的缺陷導(dǎo)致目前仍然難以形成規(guī)范用于臨床。綜上所述，無論是以往研究的文獻(xiàn)檢索還是我們單中心的驗證數(shù)據(jù)均說明目前所采用的免疫組化指標(biāo)不能預(yù)測NSCLC切除后的預(yù)后。

本研究存在如下缺陷：①回顧性研究；②時間跨度大，免疫組化指標(biāo)染色非同一時期完成，試劑不統(tǒng)一，各指標(biāo)行免疫組化染色的病例數(shù)不等，以上缺陷均會影響結(jié)果的判讀。因此，我們還需慎重解讀，且需進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)。對NSCLC生物學(xué)本質(zhì)的深入理解和尋找新的分子標(biāo)記物將是未來研究的方向。