M3R拮抗劑對人小細(xì)胞肺癌增殖、凋亡及粘附的影響

吳文婷 張淑香 胡彩紅

毒蕈堿膽堿受體（muscarinic receptor, MR）是G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，共5個(gè)亞型M1R-M5R。近年來發(fā)現(xiàn)：M3R激動(dòng)劑能夠刺激黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、腦癌的細(xì)胞增殖；同時(shí)其拮抗劑很可能抑制腫瘤的生長[1]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖過度、凋亡受抑以及在其他臟器的粘附、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)的目的是首先觀察體外培養(yǎng)小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）細(xì)胞株表達(dá)M3R，進(jìn)而研究M3R拮抗劑對SCLC細(xì)胞株增殖、凋亡及粘附的影響，可為M3R拮抗劑在SCLC 輔助治療方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 細(xì)胞株：人SCLC細(xì)胞株SBC3購自日本JCRB細(xì)胞庫。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清（Gibco）；Trizol（Invitrogen）；First Strand cDNA Synthesis kit（Thermo）；全蛋白提取試劑盒（凱基）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；兔抗人M3R多克隆I抗（Abcam）；β-actin單克隆I抗（CST）；抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記II抗（CST）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（Thermo）；M3R拮抗劑4-DAMP（Sigma）；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-鋅（ITS）（Gibco）；四甲基偶氮唑（MTT）（Sigma）；Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒（貝博）；鼠抗人αv、α2、α5、α6、β1和β3整合素單克隆I抗（Chemicon公司）；抗鼠IgG異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記II抗（Chemicon公司）；Propidium iodide（PI）（Sigma公司）；人纖維結(jié)合蛋白（Fn）（Roche公司）；牛血清白蛋白（BSA）（Sigma公司）；膽堿受體激動(dòng)劑碘化乙酰膽堿（acetylcholine iodide, Ach）（Wako公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SBC3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS，1%青鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 RT-PCR檢測M3R mRNA表達(dá) 按Tirzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用Dnase I去除總RNA中殘留的基因組DNA，參照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑說明完成cDNA的合成，所得產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物（上海生工）如下：β-actin引物上游5’-AGAAAATCTGGCACCACACC-3’，β-actin引物下游5’-AGGAAGGAA GGCTGGAAGAG-3；M3R引物上游5’-TGGAACAACAATGATGCT GC-3’，M3R引物下游5’-CCTTTTCCGCTTAGTGATCTG-3’。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線照相。

1.4 Western blot檢測M3R蛋白表達(dá) 按全蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白。用酶標(biāo)儀測蛋白濃度后定量。加熱變性后，每樣本100 μg行SDS-PAGE電泳，后電轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉TBST封閉1 h，洗膜，后加兔抗人M3R多克隆I抗（1:500）兔抗人β-actin I抗（1:1,000）室溫孵育1 h，后4 ℃過夜，復(fù)溫1 h。洗膜后加入HRP標(biāo)記的抗兔II抗（1:1,500）室溫孵育1 h，加ECL顯影劑，暗室曝光顯影[2]。

1.5 MTT法檢測M3R拮抗劑對細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，每孔2,000個(gè)細(xì)胞種植于96孔板中。細(xì)胞經(jīng)24 h貼壁后棄去上清，換1%ITS無血清培養(yǎng)基同步化一天后加藥，共分為2組：①正常對照組：每孔加入100 μL 1%ITS+1%BSA的培養(yǎng)基；②4-DAMP組；每孔加入100 μL含有不同濃度的4-DAMP的1%ITS+1%BSA培養(yǎng)基，使4-DAMP終濃度分別為10-4M、10-5M、10-6M、10-7M。培養(yǎng)72 h后向每孔加10 μL MTT。在培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄掉上清，加入200 μL DMSO，置搖床震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。后在570 nm波長的酶標(biāo)儀下讀出OD值。計(jì)算藥物對細(xì)胞的抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。以4-DAMP濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖并擬合抑制曲線，50%抑制率所對應(yīng)的化合物濃度即為IC50值。每組不同濃度藥物處理的細(xì)胞樣本加5個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次[3]。

1.6 Annexin V-FITC/PI流式凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，2.0×105個(gè)細(xì)胞種植于60 mm培養(yǎng)皿中。細(xì)胞經(jīng)24 h貼壁后棄去上清，加1%ITS無血清培養(yǎng)基同步化一天后加藥。分正常對照組和10-4M 4-DAMP組。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后收集上清。用不含EDTA胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心，用PBS制備單細(xì)胞懸液洗滌兩次并計(jì)數(shù)。使各樣本細(xì)胞濃度大約為1×106/mL細(xì)胞。加入400 μL的1×Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞；避光條件下加入5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液后立即用流式細(xì)胞儀（BD公司Accuri C6）檢測，用BD Accuri C6軟件進(jìn)行分析。

1.7 M3R對細(xì)胞粘附的影響 流式細(xì)胞法檢測SBC3細(xì)胞整合素的表達(dá)：觀察細(xì)胞生長狀態(tài)良好，0.05%EDTA收集細(xì)胞，PBS液洗滌2遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/mL。分別取100 μL細(xì)胞液，加入抗人αv、α2、α5、α6、β1和β3整合素抗體，濃度為10 μg/mL，4 ℃孵育1 h。PBS液洗2遍，分別加入抗鼠IgG FITC抗體，濃度為10 μg/mL，4 ℃孵育30 min。細(xì)胞再次用PBS液洗滌2遍后，200 μL PBS液重懸，充分混勻后加入PI，濃度為10 μg/mL。FACScanTM（Becton-Dickinson，美國）檢測分析整合素的表達(dá)。其次，按上述方法收集細(xì)胞、調(diào)整細(xì)胞濃度后，加入10-5M 4-DAMP，作用30 min后加入10-4M Ach，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，流式細(xì)胞法觀察整合素αv、β1和α5的表達(dá)在上述藥物作用后有無改變。

體外細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：PBS液配制的20 μg/mL Fn和10 mg/mL BSA分別包被96孔板（Corning Incorporated，美國），4 ℃放置過夜。第2日，PBS液洗3遍，各孔加入10 mg/mL BSA 100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h，再次用PBS液洗2遍。0.05%EDTA收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，1%ITS RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1遍并重懸細(xì)胞。試驗(yàn)組分為6組，10-5 M 4-DAMP、5 μg/mL抗人αv、β1、α5或αv和α5整合素抗體分別加入其中5組細(xì)胞，30 min后加入10-4M Ach，第6組只加入10-4M Ach。各組細(xì)胞以5×105個(gè)/孔分別種植于BSA和Fn包被好的96孔板，BSA和Fn包被的孔中加入未經(jīng)任何藥物處理的細(xì)胞分別作為陰性和陽性對照。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 h后，離心并PBS液清洗各孔以去除沒有粘附的細(xì)胞。顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野（400倍）的細(xì)胞數(shù)，求平均值計(jì)作粘附細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞每板加5個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M3R在SBC3的表達(dá) RT-PCR電泳結(jié)果所示：以不加模板作為陰性對照，未見條帶，說明PCR體系無污染。加入模板的可見特異性M3R mRNA（432 bp）目的條帶的表達(dá)。Western blot結(jié)果如圖1B所示：SBC3細(xì)胞可檢測出分子量約為66 kDa的M3R蛋白的表達(dá)（圖1）。

2.2 M3R對SBC3增殖的影響 4-DAMP濃度依賴性地抑制SBC3細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物對細(xì)胞的IC50為22.8 μM（圖2）。

2.3 M3R拮抗劑對SBC3凋亡的影響 為檢測4-DAMP對SBC3細(xì)胞的凋亡影響。我們采用了Annexin-V-FITC/PI雙染法進(jìn)行檢測。與對照組相比，10-4M 4-DAMP能夠明顯地增加SBC3細(xì)胞凋亡。正常對照組早期凋亡率為（1.56±0.11）%，藥物組早期凋亡率為（6.46±1.50）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005），對照組總凋亡率為（4.43±0.15）%，藥物組總凋亡率為（16.03±1.27）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖3，圖4）。

圖 1 SBC3細(xì)胞株表達(dá)M3R。A：PT-PCR檢測M3R mRNA在SBC3中的表達(dá)。B：Western blot檢測M3R蛋白在SBC3中的表達(dá)。Fig 1 SBC3 cells expressed M3R. A:Expression of M3R mRNA in SCLC cell line SBC3. B: Western blot detected the protein of M3R in SBC3 cells.

圖 2 M3R受體拮抗劑4-DAMP濃度依懶性抑制細(xì)胞增殖。Fig 2 Muscarinic receptor antagonist 4-DAMP significantly inhibited SBC3 cells proliferation

2.4 M3R對SBC3粘附的影響 整合素在SBC3的表達(dá)：本研究檢測了SBC3細(xì)胞上αv、α2、α5、α6、β1和β3整合素的表達(dá)。SBC3細(xì)胞主要表達(dá)αv和β1整合素，同時(shí)也少量表達(dá)α5整合素。這個(gè)結(jié)果提示，SBC3細(xì)胞主要表達(dá)αvβ1，其次是α5β1整合素（圖4）。

M3R對SBC3細(xì)胞上整合素αv、β1和α5表達(dá)的影響：流式法進(jìn)一步檢測經(jīng)4-DAMP和Ach處理過的SBC3細(xì)胞上αv、β1和α5整合素表達(dá)情況。SBC3細(xì)胞上αv、β1或α5整合素的表達(dá)水平較藥物處理前沒有發(fā)生變化（圖5）。

M3R對SBC3細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)作用：SBC3細(xì)胞幾乎不能粘附于BSA包被的96孔板，但可以粘附于Fn包被的96孔板。同時(shí)，10-4M Ach明顯地刺激SBC3細(xì)胞對Fn的粘附（P＜0.01），Ach的刺激作用幾乎完全被10-5M的M3R拮抗劑4-DAMP所阻斷（P＜0.01），部分被5 μg/mL抗-αv或抗-α5整合素抗體所阻斷（P＜0.05），幾乎完全被5 μg/mL抗-β1整合素抗體或5 μg/mL抗-αv和抗-α5整合素抗體所阻斷（P＜0.01）。圖6B所示為10-5M 4-DAMP對Ach刺激的SBC3細(xì)胞粘附抑制作用的顯微鏡下所見。圖7B所示為整合素抗體對Ach刺激的SBC3細(xì)胞粘附抑制作用的顯微鏡下所見（圖6，圖7）。

圖 3 采用Annexin V-FITC/PI 流式凋亡試劑盒檢測4-DAMP對SBC3細(xì)胞凋亡的影響。A：陰性對照組，未加任何干擾因素。B：終濃度為10-4 M 4-DAMP處理組。C：與正常組相比，4-DAMP處理組的早期凋亡率高于正常組。D：與正常組相比，4-DAMP組總凋亡率明顯高于正常組（◆P＜0.01）。Fig 3 4-DAMP promoted SBC3 cell apoptosis. A: The cells treated without drug was negative control. B: The cells treated with 4-DAMP (10-4 M).After harvested, cells were stained with Annexin-v-FITC and PI. C: Representative analysis of flow cytometry for the detection of early apoptosis in SBC3 cells stimulated with and without 4-DAMP. D: Compared with control. The ratio of apoptosis was higher after exposure to 4-DAMP for 72 h (◆P＜0.01 vs control)

3 討論

Wessler等[4]提出非神經(jīng)元性膽堿能系統(tǒng)的概念，非神經(jīng)元性Ach從細(xì)胞中分泌出來，通過自分泌或旁分泌機(jī)制，作用于自身或鄰近細(xì)胞上的尼古丁膽堿受體（nicotinic receptor, NR）和MR，調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能，如基因表達(dá)、擴(kuò)增、分化、細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞間接觸等，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)M3R和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。我們研究發(fā)現(xiàn)SCLC細(xì)胞株SBC3表達(dá)M3R，M3R拮抗劑4-DAMP抑制SBC3的增殖、粘附并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

Williams[5]發(fā)現(xiàn)，膽堿受體激動(dòng)劑卡巴膽堿減少SCLC細(xì)胞DNA的合成繼而抑制細(xì)胞增殖；而Song[6]的研究發(fā)現(xiàn)，膽堿受體激動(dòng)劑Ach刺激SCLC的增殖，選擇性的M3R拮抗劑能夠抑制SCLC的增殖。我們的結(jié)果與Song的結(jié)果一致。這種不同的結(jié)果在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道。乳腺癌細(xì)胞LM2.LM3表達(dá)MRs，卡巴膽堿在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖，但在長時(shí)間內(nèi)卻能抑制細(xì)胞增殖[7]。小鼠成纖維細(xì)胞NIH3TS處于不同生長環(huán)境中，卡巴膽堿既有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，也有抑制細(xì)胞增殖的作用，作者認(rèn)為這種矛盾的結(jié)果與細(xì)胞類型、受體水平、實(shí)驗(yàn)條件、觀察時(shí)間等因素有關(guān)[8]。我們認(rèn)為細(xì)胞是向惡性轉(zhuǎn)化還是向良性轉(zhuǎn)化是由多個(gè)因素決定的過程，需要更多的細(xì)胞株通過不同的實(shí)驗(yàn)方法去驗(yàn)證。

圖 4 流式細(xì)胞法檢測SBC3整合素表達(dá) SBC3主要表達(dá)αv和β1整合素，少量表達(dá)α5整合素。Fig 4 Flow cytometry detected the expression of integrin. The αv and β1 integrin were predominantly expressed in the SBC cells and α5 was minor.

圖 5 Ach和4-DAMP對SBC3細(xì)胞表面整合素表達(dá)的影響。10-4 M Ach、10-4 M Ach+10-5 M 4-DAMP不改變SBC3細(xì)胞表面αv、β1及α5整合素的表達(dá)水平。Fig 5 Ach and 4-DAMP did not have an effect on cells integrin expression. αv, α5 and β1 expression was not altered after the cells were treated with 10-4 M Ach or 10-4 M Ach+10-5 M 4-DAMP.

圖 6 M3R對SBC3細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)作用。A：10-4 M Ach明顯地增強(qiáng)SBC3細(xì)胞對Fn的粘附，10-5 M 4-DAMP完全阻斷Ach對細(xì)胞粘附的刺激作用（◆P＜0.01）。B：4-DAMP對Ach刺激的SBC3細(xì)胞粘附作用顯微鏡下表現(xiàn)（400×）。B1：Fn；B2：10-4 M Ach；B3：10-5 M 4-DAMP+10-4 M Ach。Fig 6 Role of M3R on cells adhesion. A: 10-4 M Ach promoted cells adhesion towards Fn, but fully blocked by 10-5 M 4-DAMP. B: The influence of M3R on cells adhesion were shown under microscope (400×). B1: Fn; B2: 10-4 M Ach; B3: 10-5 M 4-DAMP+10-4 M Ach.

圖 7 整合素對SBC3細(xì)胞粘附的調(diào)節(jié)作用。A：αv或α5整合素抗體部分阻斷Ach對細(xì)胞粘附的刺激作用（ *P＜0.05），αv和α5或β1整合素抗體完全阻斷Ach對細(xì)胞粘附的刺激作用（◆P＜0.01）。B：整合素抗體對Ach刺激的SBC3細(xì)胞粘附作用顯微鏡下表現(xiàn)（400×）。B1：Fn；B2：10-4 M Ach；B3：10-4 M Ach+5 μg/mL anti-αv整合素；B4：10-4 M Ach+5 μg/mL anti-α5 整合素；B5：10-4 M Ach+5 μg/mL anti-αv+5 μg/mL anti-α5 整合素；B6：10-4 M Ach+5 μg/mL anti-β1整合素。Fig 7 Integrin regulated cell adhesion. A: anti-αv integrin antibody or anti-α5 integrin antibody could partially block the effect of cell adhesion stimulated by Ach, anti-αv integrin combine with anti-α5 integrin or anti-β1 integrin fully blocked the influence of Ach on cell adhesion. B: The photos under microscope show the role of integrin antibody have an inhibitory effect of cell adhesion stimulated by Ach (400×). B1: Fn; B2: 10-4 M Ach; B3: 10-4 M Ach+5 μg/mL anti-αv integrin; B4: 10-4 M Ach+5 μg/mL anti-α5 integrin; B5: 10-4 M Ach+5 μg/mL anti-αv integrin+5 μg/mL anti-α5 integrin; B6: 10-4 M Ach+5 μg/mL anti-β1 integrin.

MRs和細(xì)胞凋亡的關(guān)系的研究主要集中在神經(jīng)元細(xì)胞，有研究[9]發(fā)現(xiàn)與Gq亞型單位偶聯(lián)的M1R、M3R、M5R活化后能夠保護(hù)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷從而抑制凋亡的發(fā)生，而與Gi亞單位偶聯(lián)的M2R、M4R沒有這樣的特性。Budd等[10]報(bào)道轉(zhuǎn)染MRS的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，MR激動(dòng)劑卡巴膽堿抑制依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這種作用被阿托品所阻斷。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，慢性阻塞性肺疾病患者外周血T淋巴細(xì)胞表面的M3R水平明顯升高，M3R拮抗劑噻托溴銨能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡。目前，尚沒有MRS與SCLC凋亡的相關(guān)研究，我們在倒置顯微鏡下觀察到4-DAMP對SBC3細(xì)胞凋亡有明顯影響，同時(shí)通過流式細(xì)胞儀檢測了4-DAMP對SBC3細(xì)胞凋亡的影響。4-DAMP能夠明顯促進(jìn)SBC3細(xì)胞的凋亡。4-DAMP濃度為10-4M時(shí)，正?；罴?xì)胞比例降低；早期凋亡、晚期凋亡比例明顯升高；并且晚期凋亡比例高于早期凋亡比例，與對照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤的發(fā)生，發(fā)展與細(xì)胞增殖過度，凋亡抑制有關(guān)，細(xì)胞凋亡對腫瘤起負(fù)調(diào)控作用。目前細(xì)胞凋亡途徑有兩條：死亡受體途徑和線粒體途徑，關(guān)于M3R對SCLC凋亡的具體機(jī)制，需要我們進(jìn)一步深入研究。

細(xì)胞粘附于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc, ECM）的能力和腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散密切相關(guān)。在Quigley[12]的研究中發(fā)現(xiàn)，卡巴膽堿誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株SCC-9粘附于IV型膠原，非選擇性MR拮抗劑阿托品R和抗-β1整合素抗體都能夠阻斷卡巴膽堿的這種作用。目前尚沒有M3R對SCLC粘附作用的研究。整合素是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間連接的一種主要的跨膜受體，是由α和β亞單位組成的異源二聚體。在哺乳動(dòng)物，目前發(fā)現(xiàn)共有19個(gè)α和8個(gè)β亞單位[13]。Fn是ECM中一種糖蛋白，細(xì)胞表面的整合素和Fn結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲[14]。本研究檢測了整合素αv、α2、α5、α6、β1和β3在SBC3細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SBC3細(xì)胞主要表達(dá)αv和β1，也有少量α5的表達(dá)。說明SBC3細(xì)胞主要表達(dá)αvβ1，其次是α5β1整合素。α5β1整合素是經(jīng)典的Fn受體。αvβ1最早在神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株IMR32中發(fā)現(xiàn)[15]，之后在SCLC和鱗癌中都發(fā)現(xiàn)了αvβ1的表達(dá)[16,17]。αvβ1的一個(gè)主要功能也是調(diào)節(jié)細(xì)胞向Fn的粘附和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，SBC3細(xì)胞幾乎不能粘附在10 mg/mL BSA包被的96孔板中，20 μg/mL Fn包被的96孔板中粘附的細(xì)胞明顯增多，這間接說明在SBC3細(xì)胞α5β1和αvβ1是有功能的整合素。10-4M外源性Ach刺激細(xì)胞對Fn的黏附，10-5M 4-DAMP幾乎完全阻斷了外源性Ach的這種作用，說明Ach是通過作用于M3R刺激細(xì)胞粘附的。另外，抗-β1整合素抗體或抗-αv和抗-α5整合素抗體也能夠完全阻斷外源性Ach刺激的SBC3細(xì)胞對Fn的粘附，抗-αv或抗-α5整合素抗體部分地阻斷Ach刺激的SBC3細(xì)胞對Fn的粘附，這表明，M3R調(diào)節(jié)SBC3細(xì)胞粘附于Fn的作用是通過含有β1亞單位的整合素受體（αvβ1和α5β1）實(shí)現(xiàn)的。我們推測，Ach或許能夠增強(qiáng)細(xì)胞表面整合素受體的表達(dá)從而刺激細(xì)胞粘附于Fn，而且這種作用會(huì)被4-DAMP所阻斷。然而，和我們的推測相反，外源性的Ach、4-DAMP都不能改變SBC3細(xì)胞表面αv、α5或β1整合素的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明M3R通過含有β1亞單位（αvβ1和α5β1）的整合素調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附是通過改變整合素的活性和功能實(shí)現(xiàn)的，而不能改變細(xì)胞表面整合素的表達(dá)水平。我們認(rèn)為Ach作用于M3R，通過增加含有β1亞單位整合素的活性，刺激細(xì)胞在ECM中的粘附和運(yùn)動(dòng)，能夠加速SCLC的轉(zhuǎn)移，M3R拮抗劑阻斷Ach和受體的結(jié)合，從而抑制SCLC的轉(zhuǎn)移。當(dāng)然，在體內(nèi)，會(huì)不會(huì)得到同樣的結(jié)果，還需要在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人SCLC細(xì)胞株SBC3表達(dá)M3R，M3R的拮抗劑4-DAMP能抑制細(xì)胞增殖、粘附并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，SCLC患者癌組織較正常肺組織高表達(dá)M3R，尤其是吸煙的SCLC患者；雖然M3R和SCLC臨床分期無明顯相關(guān)，但M3R高表達(dá)患者的生存期明顯縮短[18]。SCLC通常發(fā)生在年齡較大而且長期吸煙的患者身上，患者肺功能欠佳，而且很早就發(fā)生全身轉(zhuǎn)移，M3R拮抗劑具有擴(kuò)張支氣管平滑肌、減少粘液分泌、抗氣道炎癥的作用，若同時(shí)能夠抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，將會(huì)為SCLC尤其是同時(shí)合并慢性阻塞性肺病的患者的治療帶來新的出路。