一種穩(wěn)定的人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)

李鵬昊，曲　婷，黃繼華，韓婷婷，溫子娜，崔淑艷，鐘　影

一種穩(wěn)定的人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)

李鵬昊，曲婷，黃繼華，韓婷婷，溫子娜，崔淑艷，鐘影*

（成都市錦欣生殖醫(yī)學(xué)與遺傳學(xué)研究所，成都市錦江區(qū)婦幼保健院，四川成都610066）

目的： 建立一種穩(wěn)定、簡便的人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)，為揭示母方減數(shù)分裂錯誤及其發(fā)生原因、探討非整倍性發(fā)生機制、評價外環(huán)境因素對人卵母細(xì)胞的遺傳學(xué)效應(yīng)提供有力工具。方法：經(jīng)簽訂知情同意書后，取體外受精術(shù)后廢棄的人卵母細(xì)胞，經(jīng)低滲、漸進固定處理、制備人卵母細(xì)胞染色體核型。應(yīng)用人16號染色體著絲粒熒光探針，經(jīng)變性處理后與人卵母細(xì)胞核型進行熒光原位雜交，再經(jīng)洗脫和染色等步驟，在熒光顯微鏡下分析。結(jié)果：經(jīng)過上百批次重復(fù)實驗，人卵母細(xì)胞染色體形態(tài)與分散良好，熒光信號明亮清晰、背景干凈。結(jié)論：成功建立人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)。

人卵母細(xì)胞；染色體；熒光原位雜交；減數(shù)分裂錯誤；非整倍性

【ABSTRACT】OBJECTIVE: In humans，aneuploidies occur in at least 5% of all clinically recognized pregnancies，among which about 90% can be caused by maternal meiotic error. In this study，a stable and simple method for fluorescence in situ hybridization (FISH) with human oocyte chromosomes was developed to explore causes of maternal meiotic error，mechanisms of aneuploidy and genetic effects of environmental factors on human oocytes. METHODS：The abandoned human oocytes were collected from IVF patients who signed consent forms. The oocytes were used to prepare chromosomal karyotype through hypotonic and gradual fixative treatments. Human oocyte metaphase FISH was performed using the CEP 16 Probe. RESULTS：From our observations，the morphology and dispersal of human oocyte chromosomes were excellent，and the fluorescence signals were bright and clear with clean background. CONCLUSION：We established successfully the method for FISH with human oocyte chromosomes.

【KEY WORDS】human oocyte；chromosome；fluorescence in situ hybridization；meiosis error；aneuploidy

人類精、卵的細(xì)胞遺傳學(xué)研究具有重大意義，因為精、卵的任何染色體異常都會對下一代造成嚴(yán)重后果。自1978年Rudak建立人精子染色體制備技術(shù)以來[1]，人精細(xì)胞遺傳學(xué)研究發(fā)展很快，而人卵細(xì)胞遺傳學(xué)研究由于實驗材料獲得困難，進展非常緩慢。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是利用熒光標(biāo)記探針與染色體上的靶DNA序列雜交，通過檢測熒光信號，從而對目的片段進行定性、定量或相對定位的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，具有特異性強、敏感率高、檢測時間短、直觀性好等優(yōu)點，將其與人卵母細(xì)胞染色體制備技術(shù)相結(jié)合，檢測人卵母細(xì)胞染色體異常，具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。人類輔助生殖技術(shù)的成功為科學(xué)家們獲得人卵母細(xì)胞用于實驗研究提供了可能。近些年來，國外學(xué)者利用體外受精(in vitro fertilization，IVF)術(shù)后廢棄的人卵母細(xì)胞進行了染色體核型分析[3]，國內(nèi)雖有個別文獻報道卵母細(xì)胞FISH，但僅對卵母細(xì)胞間期核或極體而言，應(yīng)用人卵母細(xì)胞染色體FISH進行核型分析迄今未見報道。我們建立了一種穩(wěn)定、簡便的人卵母細(xì)胞染色體FISH技術(shù)，為揭示母方減數(shù)分裂錯誤及其發(fā)生原因、探討非整倍性發(fā)生機制、評價外環(huán)境因素對人卵母細(xì)胞的遺傳學(xué)效應(yīng)提供了有力工具。

1　材料與方法

1.1卵母細(xì)胞和熒光探針

臨床上廢棄的人卵母細(xì)胞來自2013年10月—2015年7月因不育不孕到成都市錦江區(qū)婦幼保健院進行IVF的術(shù)后部分患者，經(jīng)患者知情同意書后用于實驗。人16號染色體著絲粒探針(CEP16)購自美國Vysis公司。

1.2主要儀器和試劑

1.2.1主要儀器原位雜交儀(Thermobrite-S500)購自美國雅培公司。

1.2.2卵母細(xì)胞洗滌液實驗當(dāng)天配制，取按表1配制的Biggers-Whitten-Whittingham (BWW)培養(yǎng)基70 mL加入牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 210 mg配制成含0.3% BSA的培養(yǎng)基用于卵母細(xì)胞洗滌。

表1　BWW培養(yǎng)基

1.2.3低滲液和固定液實驗當(dāng)天配制，取0.068 mol/L的KCl溶液30 mL加入BSA 30 mg配制成含0.1% BSA的低滲液。取甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水按如下體積比例配制成固定液I(5∶1∶2.5)、固定液II(3∶1∶0)和固定液III(3∶3∶1)。

1.2.4原位雜交用緩沖液和洗滌液取20×檸檬酸鈉鹽溶液(saline sodium citrate，SSC)100 mL加入850 mL純水，用NaOH調(diào)pH值至6.8～7.2，加純水至1 L制備成原位雜交用緩沖液。取100 mL 20×SSC、850 mL ddH2O和1 mL Nonidet P-40 (NP-40)，室溫下混勻溶解，用NaOH調(diào)pH值至6.8～7.2，加純水至1 L制備成原位雜交用洗滌液。兩種溶液室溫保存，超過6個月、出現(xiàn)沉淀或者污染棄用。

1.3方法

1.3.1人卵母細(xì)胞染色體制片將卵母細(xì)胞加入盛有低滲液的凹玻板孔底部，低滲處理5～8 min。吸取卵母細(xì)胞放入盛有固定液I的凹玻板孔底部，此時卵母細(xì)胞變成棕褐色；隨著固定時間的延長，顏色逐漸變淺；固定至5～7 min時，將卵母細(xì)胞吸移至載玻片上標(biāo)記圓圈的中心；吸取固定液II，用其揮發(fā)的氣體在卵母細(xì)胞上方薰蒸，再將吸管頭退至圓圈邊緣，緩慢釋出固定液II，覆蓋載玻片上所有卵母細(xì)胞，將載片放入固定液II中固定至少5 min；再在固定液III中固定1 min，用溫濕蒸氣將樣本吹干。繼后將樣本在70%、85%、100%乙醇中各處理2 min脫水；在65 ℃烤箱中處理15～30 min使制片老化；制片可立即用于FISH，或在低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2熒光原位雜交在原位雜交儀上設(shè)置程序為：83 ℃變性5 min；37 ℃雜交16 h。在200 μL微量離心管中加入Buffer 7 μL，ddH2O 2 μL，探針1 μL，離心1～3 s；將充分混勻的探針變性溶液加在靶染色體區(qū)域，覆以蓋玻片，去氣泡后用封片膠密封，放入雜交儀進行變性與雜交過夜。從原位雜交儀中取出制片，在室溫下于2×SSC溶液中去除封口膠和蓋片；將其放入預(yù)溫至46 ℃的2×SSC中，洗滌10 min；轉(zhuǎn)入預(yù)溫至46 ℃的2×SSC/0.1% NP-40液中，洗滌7～8 min；轉(zhuǎn)入70% 乙醇處理2 min，在室溫下風(fēng)干；加10 μL DAPI II于靶染色體區(qū)域，用蓋玻片封片，置冰箱(-20 ℃)10～15 min，取出鏡檢或在-70 ℃低溫冰箱中避光保存。

2　結(jié)果

鑒于人16號染色體是在IVF臨床中常發(fā)生非整倍性的染色體之一，本研究選其著絲粒探針用于方法學(xué)的建立。我們用人16號染色體著絲粒探針與人外周血染色體核型進行熒光原位雜交作陽性對照，用人16號染色體著絲粒探針與小鼠卵母細(xì)胞染色體核型進行熒光原位雜交作陰性對照，結(jié)果在人外周血和人卵母細(xì)胞核型的16號染色體著絲粒區(qū)均見明亮清晰的熒光信號，而在陰性對照中未見熒光信號。除了應(yīng)用人16號染色體著絲粒探針外，我們用人X染色體著絲粒探針與人卵母細(xì)胞核型進行熒光原位雜交也獲得了同樣的效果。應(yīng)用本文報道的方法，我們在上百批次實驗中所制備的人卵母細(xì)胞染色體形態(tài)與分散良好，熒光信號明亮、清晰，背景干凈(圖1)。

3　討論

3.1人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)要點

人卵母細(xì)胞來之不易且數(shù)量有限，因此要求實驗成功率高，不致浪費珍貴的材料；而且高質(zhì)量的染色體核型制片是成功進行熒光原位雜交的保證，所以本技術(shù)的重點在于人卵母細(xì)胞染色體制片：①使用了3種固定液，它們除含甲醇和冰醋酸外，還含有不同比例的水。由于固定液I中含有一定比例的水，使從含有大量水的低滲液轉(zhuǎn)入固定液I的卵母細(xì)胞，環(huán)境變化不像直接到常規(guī)固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)中那樣激烈，而且還起到邊低滲邊固定的作用；固定液III中的水有使細(xì)胞軟化的作用，這種漸進固定法使得卵母細(xì)胞染色體形態(tài)和分散良好，且不至丟失。②當(dāng)卵母細(xì)胞由低滲液轉(zhuǎn)入盛有固定液I的凹玻板底部時，應(yīng)用吸管中隨卵帶來的少量低滲液覆蓋卵母細(xì)胞，這樣處理使固定液逐漸透過覆蓋卵母細(xì)胞的低滲液去固定卵母細(xì)胞，達(dá)到更好的固定效果。此處的關(guān)鍵是要掌握好覆蓋卵母細(xì)胞的低滲液量，過少則卵母細(xì)胞很快就飄動在固定液中，難以捕捉而丟失；過多則固定時間較長，染色體制片胞漿太厚，影響熒光原位雜交效果。③用固定液II揮發(fā)的氣體在卵母細(xì)胞上方薰蒸，可使卵母細(xì)胞迅速變得扁平，能更好地固定在制片上。此處的關(guān)鍵是薰蒸卵母細(xì)胞的時間要掌握恰當(dāng)。過快則染色體容易丟失；過慢則制片上的胞漿起皺，影響熒光原位雜交效果。④熒光素暴露在光線下會迅速褪色，為了避免熒光衰減，對所有涉及熒光素的溶液和制片的操作步驟都必須避光進行。⑤染色體制片和熒光探針變性時必須確保達(dá)到設(shè)定溫度。

圖1　熒光原位雜交(FISH)結(jié)果圖

3.2人卵母細(xì)胞染色體熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用前景

減數(shù)分裂是生物實現(xiàn)有性生殖的核心和根本。人類減數(shù)分裂，特別是在卵子發(fā)生過程中，最易發(fā)生錯誤[4]。據(jù)統(tǒng)計，人類臨床妊娠至少有5%為非整倍體患兒，其中約90%系母方減數(shù)分裂錯誤所致，錯誤發(fā)生頻率隨著母方年齡增高而增加[5]；因此非整倍性發(fā)生機制及其與母方年齡的關(guān)系一直是學(xué)者們高度關(guān)注的課題。在IVF項目中，受精率與治療結(jié)果密切相關(guān)。有研究報道，染色體異常是卵母細(xì)胞不受精的原因之一，并認(rèn)為這是人類受精機理的知識中尚未涉及到的一種新的病理現(xiàn)象[6]，需要進一步研究證實。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，大量化學(xué)物質(zhì)釋放到自然界中，對人類居住環(huán)境造成極大的污染。有資料表明，近半個世紀(jì)以來，由于環(huán)境因素的影響，我國男性精子數(shù)量降幅已達(dá)40%以上；而且工業(yè)化程度越高的地區(qū)，精子質(zhì)量下降速度越快[7]。環(huán)境因素對人卵母細(xì)胞有何負(fù)面的遺傳學(xué)影響，迄今尚是一片空白。本文建立的技術(shù)可通過檢測人卵母細(xì)胞染色體畸變來揭示母方減數(shù)分裂錯誤及其發(fā)生的原因、探索卵母細(xì)胞染色體異常在受精機制中的作用和評價環(huán)境因素對人卵母細(xì)胞的遺傳學(xué)效應(yīng)，對于人類生殖健康具有十分重要的理論與實踐意義。

[1] Rudak E，Jacobs PA，Yanagimachi R. Direct analysis of the chromosome constitution of human spermatozoa[J]. Nature，1978，274(5674)：911-913.

[2] Garcia-Cruz R，Casanovas A，Brie?o-Enríquez M，et al.

Cytogenetic analyses of human oocytes provide new data on nondisjunction mechanisms and the origin of trisomy 16[J]. Hum Reprod，2010，25(1)：179-191.

[3] Fauser BC，Devroey P，Diedrich K，et al. Health outcomes of children born after IVF/ICSI：a review of current expert opinion and literature[J]. R eprod B iomed O nline，2014，28(2)：162-182.

[4] Warburton D. Human female meiosis：new insights into an error-prone process[J]. Am J Hum Genet，1997，61(1)：1-4.

[5] Hassold T，Abruzzo M，Adkins K，et al. Human aneuploidy：incidence，origin，and etiology[J]. Environ Mol Mutagen，1996，28(3)：167-175.

[6] Smith R，Walker L，Cobo AC，et al. Contribution of chromosomal abnormalities to in vitro fertilization failures[J]. Rev Med Chil，1998，126(5)：511-519.

[7] 張樹成，王宏毅，王介東. 1981-1996年我國男性精液質(zhì)量的變化分析[J]. 生 殖與避孕，1999，19(1)：27-33.

A refined technique for fluorescence in situ hybridization with human oocyte chromosomes

LI Penghao，QU Ting，HUANG Jihua，HAN Tingting，WEN Zina，CUI Shuyan，ZHONG Ying*
(Jinxin Research Institute for Reproductive Medicine and Genetics, Chengdu Jinjiang Hospital for Maternal and Child Health Care, Chengdu 610066, Sichuan, China)

R394-3

A

1004-616X(2016)02-0131-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.010

2015-10-12；

2016-01-19

四川省科技計劃項目(2012JY0066)

作者信息： 李鵬昊，E-mail：marklee20017@hotmail.com。*

，鐘影，E-mail：yzhong08@126.com