采用蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)檢測核設(shè)施周圍水域的遺傳毒性

鄧　冰，穆　龍，周銀行

采用蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)檢測核設(shè)施周圍水域的遺傳毒性

鄧冰，穆龍，周銀行

（中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所，四川綿陽621900）

目的： 利用蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)對核設(shè)施周圍水域的水質(zhì)污染情況進(jìn)行檢測。方法：分別于芙蓉溪橋河水、涪江河水、安昌河水等7個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行水樣采集，以采集水樣直接處理蠶豆根尖，測定各采樣點(diǎn)水樣的蠶豆根尖微核率(MNF)及污染指數(shù)(PI)和放射性水平，并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：各采樣點(diǎn)放射性污染水平均低于國家標(biāo)準(zhǔn)限值，但各采樣點(diǎn)的MNF有顯著差異，7個(gè)采樣點(diǎn)中有5個(gè)采樣點(diǎn)的PI在2以上，和對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論：核設(shè)施周圍水域污染主要是由兩岸工業(yè)、生活和垃圾等排污引起，核設(shè)施運(yùn)行所產(chǎn)生的放射性流出物對公眾和環(huán)境的影響輕微。

蠶豆根尖細(xì)胞；微核率；水體污染指數(shù)；核設(shè)施

【ABSTRACT】OBJECTIVE: The micronucleus test with Vicia faba root tip cells was used to study genotoxicity of pollutants from rivers around nuclear facilities. METHODS：7 samples collected from river of Furong bridge，F(xiàn)ujiang，Anchang，etc. were used to treat V. faba root tip cells directly. Micronuclei frequencies (MNF) and proliferation index (PI) were determined and statistics analyses were performed to evaluate the difference in MNF among different samples. RESULTS：There was significant differences in MNF for every site. PI values of 5 sites among 7 sampled sites were over 2，and it is highly significant compared with the contrast one (P＜0.01). CONCLUSION：The results show that the sampling points of radiation pollution levels were lower than the national standard limit value. However，water pollution of the rivers around the nuclear facilities was mainly caused by cross-strait industrial，life，and gabage pollution. Radioactive effluent generated by nuclear facilities operation affected the public and the environment lightly.

【KEY WORDS】Vicia faba root tip cell；micronucleus frequency；water pollution index；nuclear facilite

輻射環(huán)境監(jiān)測是從半個(gè)世紀(jì)前起步，伴隨著核污染事件、核泄露事故的發(fā)生，公眾的心理變化和關(guān)注而發(fā)展，世界上許多國家如美國、日本、英國、法國等一些發(fā)達(dá)國家建立了核設(shè)施環(huán)境輻射連續(xù)監(jiān)測系統(tǒng)，用于核事故的早期報(bào)警及事故監(jiān)測，其監(jiān)測數(shù)據(jù)成為安撫公眾、當(dāng)局決策的主要依據(jù)。我國環(huán)境輻射監(jiān)測工作自上世紀(jì)五十年代起步，近年來隨著核電站的興建及發(fā)展正逐步受到核電、環(huán)保等有關(guān)部門的重視，國家環(huán)境保護(hù)規(guī)劃中也明確將核安全和輻射環(huán)境監(jiān)測管理列為主要任務(wù)之一，建立和完善核安全、輻射防護(hù)與應(yīng)急、放射性廢物管理的法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)，制訂《放射性污染防治法》和《核安全法》，從而從法律和制度上確保了核設(shè)施周圍輻射環(huán)境監(jiān)測的重要性。核設(shè)施在正常的運(yùn)行條件下，釋放到環(huán)境中的放射性物質(zhì)通過各種途徑導(dǎo)致對人的照射，對當(dāng)?shù)鼐用癞a(chǎn)生附加劑量。評價(jià)個(gè)體和群體接受的劑量時(shí)，必須考慮到所有重要的照射途徑。但是，在放射性核素常規(guī)釋放的大多數(shù)情況下，環(huán)境介質(zhì)中的放射性核素活度濃度都低于探測限值，因而僅僅通過環(huán)境監(jiān)測不能夠計(jì)算出照射劑量。因而通過常規(guī)的理化方法監(jiān)測不能夠充分反映核設(shè)施周圍水體多種化學(xué)元素、核素混合暴露的健康風(fēng)險(xiǎn)。

蠶豆(Vicia faba)根尖細(xì)胞微核試驗(yàn)技術(shù)是一種以染色體損傷及紡錘絲毒性等為測試終點(diǎn)的植物微核檢測方法[1]，它具有簡便、快速、靈敏高等優(yōu)點(diǎn)。微核是染色體產(chǎn)生的斷裂片段，在細(xì)胞間期獨(dú)立于正常核而存在的微小的具有核形態(tài)的結(jié)構(gòu)。當(dāng)外界環(huán)境中存在一定濃度的致突變物時(shí)，可使細(xì)胞發(fā)生損傷，從而使有微核的細(xì)胞增多，即微核細(xì)胞率上升，微核試驗(yàn)是監(jiān)測致突變性污染的一種經(jīng)濟(jì)快速方法。致突變性和致癌高度相關(guān)，致突變污染物中可能存在致癌危險(xiǎn)物。目前，微核實(shí)驗(yàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。研究表明，以植物進(jìn)行微核測試和動物的一致率可達(dá)99%以上。我國已將這一技術(shù)列為水質(zhì)污染的規(guī)范檢測方法之一，已在環(huán)境監(jiān)測、化學(xué)物質(zhì)致突變性檢測等方面得到了廣泛的運(yùn)用[2-4]。目前已用于河流水質(zhì)遺傳毒性評價(jià)的短期生物毒性實(shí)驗(yàn)，在檢測水質(zhì)遺傳毒性時(shí)，均需對水樣進(jìn)行漫長、昂貴的濃縮過程。而采用植物遺傳毒性實(shí)驗(yàn)具有可原位監(jiān)測環(huán)境混合物毒效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。本研究通過采用蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)分析核設(shè)施周圍河流的遺傳毒性，探討蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于核設(shè)施周圍河流遺傳毒性原位監(jiān)測的可行性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

松滋青皮豆，購自華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。其他常用試劑均為化學(xué)純，購自Sigma公司。

1.2采樣點(diǎn)的布設(shè)依據(jù)和水樣采集

中國工程物理研究院(下稱“中物院”)科研基地主體集中于四川省綿陽市科學(xué)城。中物院核設(shè)施和放射性操作場所的自然環(huán)境特征是地屬中亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，雨量豐富，降水主要集中在6—9月。場址多位于龍門山脈，從區(qū)域上看，NE向的龍門山斷裂是我國地殼變形最強(qiáng)裂巖石破碎度最強(qiáng)的構(gòu)造帶之一。綿陽市的社會環(huán)境特征是市、縣、鄉(xiāng)鎮(zhèn)所在地和大、中型企事業(yè)單位生活區(qū)人口稠密，河川地區(qū)為農(nóng)業(yè)區(qū)，人口比較集中。在場址地區(qū)河谷地和臺階有一些農(nóng)田。中物院涉及核設(shè)施、放射性物質(zhì)操作和從事輻射研究的區(qū)域主要有3個(gè)：科學(xué)城城區(qū)、二所老點(diǎn)、Nuclear Plant(NP)廠區(qū)。其設(shè)施有：①反應(yīng)堆；②放射性材料研究設(shè)施；③放射化學(xué)實(shí)驗(yàn)室；④放射性同位素生產(chǎn)；⑤氚靶研制與制備、中子發(fā)生器等；⑥放射性廢物管理；⑦輻射源(電子加速器、鈷源輻照裝置、各類密封放射源及開放型反射性物質(zhì))。液態(tài)流出物經(jīng)特排輸送至廢水處理站處理，處理達(dá)標(biāo)后集中于排放槽定期或在豐水期排放。運(yùn)行期間環(huán)境監(jiān)測布的點(diǎn)是按照通常的環(huán)境監(jiān)測布點(diǎn)原則進(jìn)行的，同時(shí)考慮氣象條件、周圍地形、地貌、交通、水系和居民點(diǎn)等因素。共8個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)斷面設(shè)置左、中、右3個(gè)取樣點(diǎn)，采一個(gè)混合水樣。每斷面采水樣1 000 mL于塑料瓶內(nèi)，放于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩２蓸优c監(jiān)測時(shí)間是2015年9月。

飲用水取樣布點(diǎn)示意圖見圖1。飲用水在實(shí)驗(yàn)中作為對照組。地表水取樣布點(diǎn)如示意圖2所示的7個(gè)取樣點(diǎn)。分別位于新橋芙蓉溪橋下游10 m處河水、鐵路橋下涪江水文站下游50 m處河水、東方紅大橋下游20 m處河水、安昌河水文站上游40 m處河水、三江總排口下游200 m處河水、老點(diǎn)排放口下游5 m處河水以及老點(diǎn)三區(qū)濱河橋下游5 m處河水。地表水化學(xué)檢測包括pH值、化學(xué)需氧量、氨氮、高錳酸鹽指數(shù)、溶解氧這5項(xiàng)指標(biāo)。飲用水化學(xué)檢測包括pH、總硬度、揮發(fā)酚、硫酸鹽、氰化物、氯化物在內(nèi)的28項(xiàng)指標(biāo)。

圖1　839水廠出廠水采樣布點(diǎn)圖

圖2　鐵路橋下涪江水文站處布點(diǎn)示意圖

1.3水中放射性物質(zhì)檢測方法

飲用水中總α和總β的測量根據(jù)GB/T 5750.13-2006中的殘?jiān)鼫y量法[5]進(jìn)行，HTO的測量根據(jù)GB 12375-1990中的直接測量法[6]進(jìn)行；地表水中總α的測量根據(jù)測量EJ/T 1075-1998的厚源法[7]進(jìn)行，總β的測量根據(jù)EJ/T 900-94中的蒸發(fā)法[8]進(jìn)行，137Cs的測量根據(jù)GB 11713-1989的殘?jiān)鼫y量法[9]進(jìn)行，HTO的測量用飲用水。

1.4蠶豆根尖細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1浸種先將松滋青皮豆種子洗干凈，按需要量放入盛有蒸餾水的燒杯中，置25 ℃的溫箱內(nèi)浸泡24～36 h，此期間至少換水兩次。待種子吸漲后，將其放入鋪有薄層濕潤脫脂棉的平皿內(nèi)，在25 ℃的溫箱中催芽36～48 h，其間換水2～3次，待大部分種子初生根長至1.5～2 cm，根毛發(fā)育良好時(shí)，可用來檢測水樣的誘變效應(yīng)。

1.4.2染毒每一處理組選取4粒初生根尖生長良好、根長較一致的種子，放入盛有被測液即核設(shè)施周圍水域不同采樣點(diǎn)水樣的培養(yǎng)皿中，讓被測液浸泡住根尖即可，處理時(shí)間為5 h，另設(shè)蒸餾水為對照組。

1.4.3根尖細(xì)胞修復(fù)培養(yǎng)將處理后的種子，用蒸餾水浸洗3次，每次2～3 min；洗凈的種子再放入新鋪好紗布的鋁盒內(nèi)，按1.4.1中的培養(yǎng)條件使根尖細(xì)胞修復(fù)22～24 h。

1.4.4根尖細(xì)胞固定將修復(fù)培養(yǎng)后的豆子，從根尖頂端切下1 cm長的幼根放入空青霉素瓶中，加入卡諾氏固定液固定24～48 h。

1.4.5孚爾根(Feulgen)染色固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗2次，每次5 min。吸凈蒸餾水，再加入5 mol/L HCl將幼根泡住，連瓶放入28 ℃水浴鍋中水解幼根15 min左右，視根軟化程度可適當(dāng)增減時(shí)間，當(dāng)幼根被軟化即可。

取根尖前端2～3 mm分生組織區(qū)置于載玻片上，染色5 min后壓片，鏡檢觀察。

1.5鏡檢與微核千分率、污染指數(shù)的計(jì)算

微核識別標(biāo)準(zhǔn)：凡是主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核；小核著色與主核相當(dāng)或稍淺；小核形態(tài)可為圓形、橢圓形、不規(guī)則形等。每一處理觀察3個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)至少1 000個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)，計(jì)算微核率(micronucleus frequency，MNF)，MNF用千分率表示。在計(jì)數(shù)微核的同時(shí)，計(jì)數(shù)有絲分裂的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算污染指數(shù)(pollution index，PI)。

MNF=含MN的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞數(shù)×1 000‰；

PI=樣點(diǎn)的MNF均值/對照組的MNF均值

對于各原水樣品，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的同時(shí)，我們使用污染指數(shù)(PI)來劃分污染程度。PI在[0，1.5]區(qū)間為基本無污染；(1.5，2]區(qū)間為輕度污染；(2，3.5]區(qū)間為中度污染；(3.5，+∝)區(qū)間為嚴(yán)重污染。此法可避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來的MNF本底的波動。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用 SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用Dunnett’s t檢驗(yàn)對各染毒組與對照組之間的 MNF、PI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1飲用水、地表水放射性檢測結(jié)果

水中放射性檢測，包括總α、總β、氚檢測及137Cs的化學(xué)分析。在各采樣點(diǎn)分別采集飲用水和地表水共8個(gè)樣品進(jìn)行放射性水平檢測，結(jié)果表明飲用水和地表水中總α、總β濃度均未超過GB 5749-2006規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)限值，HTO濃度均處于較低的水平范圍。地表水中均未檢出人工核素137Cs。

放射性流出物檢測和評價(jià)結(jié)果表明，中物院從事放射性物質(zhì)操作和輻射研究的核設(shè)施及場所運(yùn)行情況良好，環(huán)境保護(hù)有效，放射性流出物對公眾和環(huán)境無顯著影響。

2.2核設(shè)施周圍水樣對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)效應(yīng)

2.2.1鏡檢結(jié)果從圖3可知，以核設(shè)施周圍水域不同采樣點(diǎn)水樣處理蠶豆根尖后，不僅可誘導(dǎo)根尖細(xì)胞形成微核，同時(shí)還觀測到核異常的現(xiàn)象，如核質(zhì)外凸、雙核等。

圖3　核設(shè)施周圍水樣誘發(fā)蠶豆根尖微核

2.2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果[10]如表1和表2所示。核設(shè)施周圍水域不同取樣點(diǎn)水樣對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘導(dǎo)隨采樣點(diǎn)不同而存在差異。所有取樣點(diǎn)水域處理蠶豆根尖細(xì)胞后的微核率在5.61‰～18.27‰，其中安昌河水文站樣點(diǎn)水樣可誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞微核率顯著增加(PI＞5)，與對照水樣比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0. 01)。結(jié)果表明，核設(shè)施周圍水域部分水樣具有核損傷作用，產(chǎn)生相應(yīng)的遺傳誘變效應(yīng)，造成不可逆的遺傳損傷。

從表2可知，核設(shè)施周圍水域的水質(zhì)存在各地段均受到不同程度的污染，多數(shù)斷面水質(zhì)屬于中度污染，其中安昌河水樣的微核率高達(dá)18.27‰，為重度污染。綜合表1和表2可知，流經(jīng)中心市區(qū)地帶的水體污染加重，而其污染的形成與核設(shè)施的運(yùn)行無關(guān)，其主要原因是，當(dāng)河水自西向東穿城區(qū)而過時(shí)，受沿途兩岸工業(yè)、生活和垃圾等排污的影響，致使水體污染沿程加重，直至出市區(qū)后，由于水體自凈作用能力，下游三江大壩斷面污染略有緩解。研究表明涪江中段已受到不同程度的污染，水樣對遺傳物質(zhì)產(chǎn)生損傷可形成較高的微核率。

表1　核設(shè)施周圍飲用水、地表水各檢測斷面的微核千分率(MNF)及污染指數(shù)(PI)

表2　微核千分率的方差分析

3　討論

中物院建院50多年來，在確保完成國防科研生產(chǎn)任務(wù)的同時(shí)，我院將軍工技術(shù)擴(kuò)展到國民經(jīng)濟(jì)和社會生活的許多領(lǐng)域，設(shè)計(jì)核技術(shù)應(yīng)用、材料、信息、精細(xì)化工、環(huán)境保護(hù)、石油探井、計(jì)算機(jī)控制等諸多方面。由于中物院工作特點(diǎn)，目前，全院從事放射性作業(yè)的設(shè)施和場所種類較多、地點(diǎn)分散，其放射性流出物源項(xiàng)較弱，且多為間斷排放。分析核設(shè)施周圍水域的放射性水平，可知，包括地表水和飲用水在內(nèi)的8個(gè)水樣的放射性濃度均低于國標(biāo)限值，因此不會造成本文實(shí)驗(yàn)中所采用方法的蠶豆根尖細(xì)胞微核。但分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，7個(gè)采樣點(diǎn)水樣與對照組比較，所致蠶豆根尖細(xì)胞微核率顯著升高，污染指數(shù)均在1.5以上，說明相應(yīng)河段水質(zhì)都存在除放射性污染以外，不同程度的致突變的其他有毒物污染。也表明直接用采樣點(diǎn)水樣對蠶豆進(jìn)行處理，獲得淡水水域污染結(jié)果明顯，應(yīng)用微核技術(shù)進(jìn)行檢測，方法簡單，結(jié)果靈敏可靠與河段同期的水化學(xué)監(jiān)測資料相比，微核檢測評價(jià)結(jié)果與樣品化學(xué)污染檢測結(jié)果基本一致。 一般認(rèn)為化學(xué)檢測結(jié)果是以各項(xiàng)污染物參數(shù)指標(biāo)為主，難以反映這些污染物對生物的綜合毒性效應(yīng)，而本方法可以直接顯示河水中的有害物對生物遺傳物質(zhì)的毒性危害，在一定程度上彌補(bǔ)了化學(xué)分析的不足。此外，增強(qiáng)核設(shè)施周圍水域水質(zhì)的物化和生物檢測，及時(shí)掌握水質(zhì)變化的動態(tài)規(guī)律，可有效防范核設(shè)施運(yùn)行可能產(chǎn)生的污水和生活污水中的致突變物對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的破壞以及對水體生物及人類健康造成潛在的威脅[11]。

由于受試驗(yàn)條件和時(shí)間限制，本次研究隨機(jī)瞬時(shí)采樣，由于水樣中浮游藻類和微生物群落的數(shù)量變化受營養(yǎng)鹽、溫度、光照及流域水文條件及季節(jié)等因素的影響，因此，細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果只能在一定程度上反映流域境內(nèi)水環(huán)境質(zhì)量，而不能完全客觀地評價(jià)各流域水環(huán)境污染現(xiàn)狀，有待進(jìn)一步深入研究。

目前，水環(huán)境污染監(jiān)測主要使用化學(xué)監(jiān)測法，其主要優(yōu)點(diǎn)是可以詳細(xì)報(bào)告水體中所含污染物質(zhì)的種類和數(shù)量。但由于核工業(yè)科研院所放射性流出物排放的特點(diǎn)是污染源強(qiáng)度弱、排放間斷，但排放源分散且涉及的放射性核素種類復(fù)雜，因此取樣監(jiān)測的范圍較寬。這一點(diǎn)特別容易造成流出物監(jiān)測的顧此失彼，尤其是異常排放下的適時(shí)監(jiān)測難度較大。微核試驗(yàn)法所得的結(jié)果反映的，則是各種因素綜合的遺傳毒性效應(yīng)，其優(yōu)點(diǎn)除靈敏高、可靠性和實(shí)用性強(qiáng)，無需昂貴儀器和深奧技術(shù)，實(shí)驗(yàn)周期短，條件易控制，取材簡便，不受季節(jié)及氣候條件限制，便于開展實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測等以外，還可以反映出化學(xué)法所不能表現(xiàn)出的各污染因子拮抗或疊加效應(yīng)，反映出的遺傳毒性是根據(jù)真核

細(xì)胞DNA 損傷試驗(yàn)得出的，因而對人類自身有更好的可比性。一直以來，河流水質(zhì)的監(jiān)督監(jiān)測主要采用常規(guī)的物理和化學(xué)監(jiān)測方法，理化方法雖能精確分析廢水的污染成分，但不能直接反映出水質(zhì)污染后可能引起的生物學(xué)效應(yīng)及污染物質(zhì)長期的潛在危害性，尤其是污染物質(zhì)的遺傳毒性。對于污染成分復(fù)雜的河流水，單用理化指標(biāo)往往難以全面反映其污染程度，而物理和化學(xué)因素誘發(fā)微核的劑量與效應(yīng)及微核率與畸變率間的相關(guān)性非常顯著，因此，微核試驗(yàn)法和化學(xué)監(jiān)測法配合使用可以為全面評估核設(shè)施附近水域水質(zhì)污染程度和可能產(chǎn)生的遺傳效應(yīng)提供依據(jù)。

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Use of the Vicia foba root tip micronucleus test to monitor genotoxicity of river samples from around nuclear facilities

DENG Bing，MU Long，ZHOU Yinhang
(Institute of Nuclear Physics and Chemistry, China Academy of Engineering Physics, Mianyang 621900, Sichuan, China)

Q345

A

1004-616X(2016)02-0141-05

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.02.012

2015-12-08；

2016-02-28

核物理與化學(xué)研究所創(chuàng)新基金(2013CX02)；中國工程物理研究院科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金(2014B0301035)

作者信息： 鄧冰，E-mail：dengbing_48@163.com