臨床來(lái)源副溶血弧菌毒力基因及耐藥性分析

周方滿，謝紅意，葉鴻雁，顧大磊，葛婷婷

臨床來(lái)源副溶血弧菌毒力基因及耐藥性分析

周方滿，謝紅意，葉鴻雁，顧大磊，葛婷婷

目的了解急性腹瀉患者中副溶血弧菌的分布、毒力基因及耐藥性。方法對(duì)急性腹瀉病例的糞便標(biāo)本進(jìn)行致病菌分離培養(yǎng)，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法開(kāi)展tlh、tdh和trh毒力基因檢測(cè)，采用VITEK2 Compact細(xì)菌分析系統(tǒng)對(duì)副溶血弧菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果從2 307例腹瀉病患者糞便標(biāo)本中檢出副溶血弧菌180株，分離率為7.8%。副溶血弧菌感染主要發(fā)生在7—10月份，其中8月份最多。毒力基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)171株tdh陽(yáng)性，占95.0%；4株trh陽(yáng)性。副溶血弧菌對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢西叮的耐藥率分別為96.7%、88.9%、23.3%，對(duì)其他實(shí)驗(yàn)藥物敏感，未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株。結(jié)論副溶血弧菌感染在本地區(qū)夏秋季急性腹瀉中占有重要地位，對(duì)青霉素類(lèi)、第一代和第二代頭孢藥物的耐藥率較高，tdh是副溶血弧菌最主要的毒力基因。

副溶血弧菌；毒力；耐藥性

1　資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源與鑒定收集寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院2014年4月至2015年10月急性腹瀉患者2307例，符合年齡1～80歲，每天排便≥3次，且大便性狀有改變（呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等），病程≤14 d的腹瀉患者。標(biāo)本采集后直接接種于堿性蛋白胨水進(jìn)行增菌，18～24 h后接種至TCBS平板，VP的分離培養(yǎng)與鑒定按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第三版）［2］進(jìn)行。所需生化培養(yǎng)基和生化試劑購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，采用法國(guó)生物梅里埃VITEK2 Compact細(xì)菌分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。1.2毒力基因檢測(cè)將分離鑒定的VP菌株，接種血平板，經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取3～5個(gè)火柴頭大小菌量懸浮于滅菌蒸餾水，煮沸10 min，然后13 000 r/min離心10 min，留取上清（含VPDNA模板）。毒力基因tdh、tlh和trh的引物序列參考文獻(xiàn)［3］（由上海生工生物工程有限公司完成）。引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

1.3藥敏試驗(yàn)采用VITEK2Compact細(xì)菌分析系統(tǒng)對(duì)分離的VP進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922、銅 綠 假 單 胞菌ATCC27853 和金黃色葡萄球菌ATCC25923。

2　結(jié)果

2.1分布情況共分離出 VP 180株，分離率為7.8%。180例VP陽(yáng)性的腹瀉患者男102例，女78例；年齡10個(gè)月至80歲；7—9月份檢出率最高，共分離出125株VP，占69.4%。

2.2毒力基因檢測(cè)所有VP tlh基因均陽(yáng)性；171株tdh基因陽(yáng)性，占95.0%；4株為trh陽(yáng)性。

2.3藥物敏感性試驗(yàn)VP對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉的耐藥率較高，分別為96.7%、88.9%；對(duì)頭孢西叮耐藥率23.3%，中度敏感率23.3%；對(duì)其他實(shí)驗(yàn)藥物敏感，未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株，見(jiàn)表2。

表1　毒力基因引物及反應(yīng)條件

表2　180株副溶血弧菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果　%

3　討論

在我國(guó)由VP引起感染事件呈上升趨勢(shì)。本文從寧波市北侖區(qū)2 307例急性腹瀉患者中分離VP 180株，分離率高達(dá)7.8%，高于陳海麗等［4］報(bào)告結(jié)果，可能與本地居民生食海鮮習(xí)慣有關(guān)。金培婕等［5］報(bào)告浙江沿海地區(qū)海產(chǎn)品及環(huán)境中VP檢出率達(dá)70%，因此改變生食海鮮習(xí)慣，加強(qiáng)飲食衛(wèi)生十分重要。

目前認(rèn)為VP的致病性與其攜帶tdh 和trh基因產(chǎn)生的毒素有關(guān)［6］，本文應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，180 株VP tdh、trh基因攜帶率分別是95.0% 和2.2%與文獻(xiàn)［7-8］研究結(jié)果基本一致。

本文藥物敏感性試驗(yàn)顯示，急性腹瀉患者VP對(duì)青霉素類(lèi)藥物（如氨芐西林）、第一代和第二代頭孢藥物（如頭孢唑啉、頭孢西叮）的耐藥率較高，分別為96.7%、88.9%、23.3%。對(duì)喹諾酮類(lèi)、復(fù)合青霉素類(lèi)、碳?xì)涿赶╊?lèi)、復(fù)方新諾明、第三代和第四代頭孢等藥物敏感性較好，未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株，與國(guó)內(nèi)報(bào)道基本一致［9-10］。喹諾酮類(lèi)藥物如環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的藥物敏感性較好且價(jià)格低廉?dāng)M推薦作為治療VP感染首選藥物。

本文VP系臨床分離菌株，對(duì)復(fù)方新諾明敏感，未發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株，與吳蓓蓓等［11］報(bào)告本地區(qū)海產(chǎn)品及環(huán)境分離株差異很大，究其原因可能與其采樣的海產(chǎn)品養(yǎng)殖場(chǎng)的使用抗生素有關(guān)，能否椐此說(shuō)明自然生態(tài)環(huán)境中VP的耐藥性差異有待于進(jìn)一步研究分析，但是筆者認(rèn)為禁止或限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中濫用抗生素刻不容緩。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.056

R446.6

A

1671-0800（2016）07-0949-02副溶血弧菌（VP）是一種嗜鹽性革蘭陰性病原菌，通過(guò)食源性途徑引起的中毒事件已經(jīng)超過(guò)沙門(mén)菌和志賀菌，可引起食物中毒和腹瀉，成為我國(guó)首要的食源性致病菌［1］。北侖的海產(chǎn)品食用比較盛行，是VP感染的高發(fā)區(qū)。本文收集北侖區(qū)腹瀉患者的糞便標(biāo)本，通過(guò)對(duì)VP的毒力基因和耐藥性型分析，了解本地區(qū)VP的毒力和耐藥性，以指導(dǎo)臨床治療，報(bào)道如下。

寧波市醫(yī)學(xué)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A41）

315800寧波，寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院

謝紅意，Email：xiehongyi 2000@126.com

2016-02-05（本文編輯：孫海兒）