CAV1腳手架樣結構域多肽抑制HEp2細胞生長的實驗研究

顧棟樺，付琳琳，平金良

CAV1腳手架樣結構域多肽抑制HEp2細胞生長的實驗研究

顧棟樺，付琳琳，平金良

目的研究CAV1腳手架樣結構域（CSD）多肽對喉鱗癌細胞株HEp2細胞生長的影響及其機制。方法CSD多肽和亂序多肽由人工合成得到，并在N'末端用生物素標記，用免疫細胞化學法檢測CSD多肽在HEp2細胞中的內化情況，細胞生長能力用MTT法檢測；流式細胞儀檢測HEp2細胞的細胞周期及細胞凋亡；免疫印跡法檢測HEp2細胞中Erk1/2蛋白的表達及磷酸化程度。結果免疫細胞化學檢測顯示CSD多肽能夠較好的進入HEp2細胞內；用CSD多肽處理細胞能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長，使更多的細胞處于G0/G1細胞靜止期，并能夠增加HEp2細胞的凋亡率；CSD多肽不影響HEp2細胞中Erk1/2蛋白的表達，但能明顯減少Erk1/2蛋白的磷酸化水平。結論CSD多肽能夠抑制HEp2細胞的生長，并且促進其細胞凋亡；Erk1/2蛋白的磷酸化水平下降可能是其重要的分子機制。

Caveilin-1；細胞生長；多肽；鱗狀細胞癌

Caveolin-1（CAV1）是一種細胞膜蛋白，是構成細胞膜上一種小凹結構的關鍵成分。目前研究發(fā)現(xiàn)CAV1在細胞膜上的信號轉導蛋白活性調節(jié)中發(fā)揮重要作用，并參與調控細胞的生物學行為。CAV1蛋白具有一個腳手架樣結構域（CSD），依賴這個結構可以和許多信號轉導相關蛋白結合，抑制蛋白的酪氨酸激酶活性［1］。本研究用體外細胞實驗來研究人工合成的CSD多肽對喉鱗癌細胞株 HEp2細胞生長的影響，并探討CSD多肽做為抗腫瘤藥物的可行性?，F(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1材料與試劑CSD多肽序列由上海翱博生物科技有限公司合成，氨基酸序列為DGI WKA SFT TFT VTK YWF YR，N端連接生物素標記，另外以同樣的氨基酸構成亂序排列的亂序多肽WFADGI SKT VRKYWFTFT YT做為陰性對照。多肽用細胞培養(yǎng)液DMEM （Sigma公司，美國）稀釋溶解至終濃度4.0 M后處理培養(yǎng)細胞。堿性磷酸酶標記的抗生物素（Biotin）小鼠單克隆抗體（工作濃度1：300）購于美國Jackson Im-

1.2方法

1.2.1免疫細胞化學法檢測多肽的細胞滲透能力細胞培養(yǎng)6孔板中放置24 mm×24 mm蓋玻片，把處于生長對數(shù)期的HEp2細胞接種于6孔板中，當細胞貼壁生長至蓋玻片上，細胞密度為70%時，加入CSD多肽，孵育6h后取出蓋玻片，用冷丙酮固定10 min，用堿性磷酸酶標記的抗生物素（Biotin）小鼠單克隆抗體37℃孵育2 h，PBS沖洗后加入NBT/BCIP顯色。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞生長至50%匯合時，加入多肽處理6 h后，用胰酶消化細胞制成細胞懸液，用冷檸檬酸緩沖液固定30 min，溴化丙啶染色后流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡，增殖指數(shù)（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。實驗組分為CSD多肽組、亂序肽組及未處理組，實驗重復3次。

1.2.3MTT法檢測細胞體外生長細胞消化后，按1 000個/孔密度接種于96孔板中，分為CSD多肽組、亂序肽組及未處理組。在培養(yǎng)的1、2、3、4、5、6、7 d加入MTT 20l/孔，繼續(xù)閉光培養(yǎng)4 h，棄上清加入150 l/孔二甲基亞砜溶解結晶，在酶聯(lián)免疫檢測儀（Molecular Devices公司）上讀取吸光值（A），測定波長490 nm?？瞻讓φ湛自O為不含細胞的完全培液。每組設4孔，結果取均值，實驗重復3次。以時間為橫軸，A490為縱軸做細胞生長曲線圖。

1.2.4免疫印跡法檢測細胞呈生長對數(shù)期時，用多肽處理，分組同前，處理48h后收集細胞，裂解細胞提取總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）變性電泳，然后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入相應的一抗，4℃孵育過夜，用PBS洗滌后，加入過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1 h，最后用ECL法試劑盒按產品說明書步驟顯色。條帶用 Pro Analyzer4.0軟件進行積分吸光度（IA）分析，以 -actin作為內參。所有實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，CSD多肽組、亂序肽組與未處理組數(shù)據(jù)分析采用檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

表1　流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡

2　結果

2.1CSD多肽在 HEp2細胞內滲透能力用CSD多肽處理HEp2細胞6 h后，用免疫細胞學檢測生物素標記的 SCD多肽，經(jīng)NBT/BCIP顯色，顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)HEp2細胞胞質中內出現(xiàn)藍紫色顆粒（圖1）。

2.2CSD多肽對 HEp2細胞生長的影響用多肽處理HEp2細胞后，用MTT法生成的生長曲線來看（圖2），未處理組和亂序多肽組的HEp2細胞在第5天開始進入生長平臺期；而用CSD多肽處理的HEp2細胞生長明顯減慢，從第2天開始其A490值（0.79±0.13）比未處理組（1.67±0.43）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（=3.38，＜0.05），亂序肽組和未處理組差異無統(tǒng)計學意義（=0.34，＞0.05）。

2.3CSD多肽對 HEp2細胞的細胞周期和凋亡的影響與未處理組相比，CSD多肽組更多的細胞處于生長靜止期（G0/G1期）（=5.02，＜0.05），而且S期和G2/M期的細胞比例低于未處理組（=4.06、4.28，均＜0.05），亂序肽組和未處理組差異均無統(tǒng)計學意義（均＞0.05）。CSD多肽組的細胞凋亡率明顯高于未處理組（=4.93，＜0.05），而未處理組和亂序肽組差異無統(tǒng)計學意義（=0.17，＞0.05）。見表1。

2.4CSD多肽對HEp2細胞Erk1/2蛋白磷酸化的影響用多肽處理24h后，CSD多肽組磷酸化ERK1/2蛋白明顯低于未處理組，用 -actin作為內參校正后，CSD多肽組磷酸化ERK1/2蛋白相對表達量為未處理組的61.29%，差異有統(tǒng)計學意義（=2.94，＜0.05）；未處理組和亂序肽組差異無統(tǒng)計學意義（=0.42，＞0.05）。見圖3。

3　討論

CAV1是 caveolae的主要功能蛋白，其基因位于7號染色體q31.1，這個區(qū)域是許多腫瘤容易發(fā)生丟失的脆性位點，形成的蛋白大小為21～24 kD，其N端第14位氨基酸殘基具有酪氨酸磷酸化位點，C端具有棕櫚?；稽c，第82 ～101氨基酸序列為CAV1的重要功能區(qū)域，具有CSD，依賴這個結構可以和許多信號轉導相關蛋白（如EGFR、G蛋白等）結合，抑制其酪氨酸激酶活性，并調節(jié)其下游信號轉導通路［1］。

近年來的研究結果表明許多腫瘤中存在著 CAV1基因表達及功能的異常，雖然CAV1在不同腫瘤中的作用報道不一，但在一部分腫瘤中，CAV1表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用，例如很多腫瘤細胞株的CAV1表達處于低水平狀態(tài)［2］，增加CAV1基因的表達水平可以抑制腫瘤細胞的生長和轉移、促進腫瘤細胞的凋亡［3-4］。而且一些腫瘤中，如乳腺癌［5］、肝癌［6］及腺泡狀橫紋肌肉瘤［7］等腫瘤組織中，CAV1表達水平明顯減少，并且CAV1低表達的患者預后更差。Jung等［8］的研究中，CAV1陰性的頭頸部鱗癌更易發(fā)生上皮-間質轉化，更容易發(fā)生轉移，并且預后不良。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)HEp2細胞高表達CAV1基因后，腫瘤細胞的生長能力能明顯被抑制［9］，說明CAV1在喉鱗癌細胞中可能起著抑癌基因的作用。

圖1　免疫細胞化學法檢測（NBT/BCIP顯色，×400）

圖2　細胞生長曲線

圖3　免疫印記法檢測蛋白表達水平

CAV1蛋白的腳手架結構是它發(fā)揮生物學功能的重要結構，Tahir等［10］用CSD肽處理前列腺癌細胞，能夠有效地減少腫瘤新生血管的生成、抑制腫瘤的生長。本研究結果表明，用合成的CSD多肽能夠順利滲入HEp2細胞內。用CSD多肽處理HEp2細胞，能明顯抑制細胞的生長，更多的細胞處于生長靜止期，并且細胞凋亡率也明顯上升。結果說明利用CAV1的CSD氨基酸序列體外合成的多肽能夠發(fā)揮其生物學效應，并且抑制HEp2細胞的生長，并促進凋亡。

細胞的生長受許多信號轉導通路的調節(jié)，胞外信號調節(jié)激酶（ERK）是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員，是調節(jié)細胞生長和發(fā)育信號網(wǎng)絡的重要環(huán)節(jié)［11］，目前研究表明CAV1能夠與上皮生長因子受體（EGFR）結合，并能夠抑制期下游Erk1/2蛋白的磷酸化程度［1］。本研究結果顯示用CSD多肽處理HEp2細胞后，細胞 Erk1/2蛋白的磷酸化水平明顯下降，提示CSD多肽抑制HEp2細胞生長可能與降低 Erk1/2蛋白磷酸化水平以及相關的生長信號通路被抑制有關。

綜上所述，體外合成的CSD多肽能夠有效進入HEp2細胞內，并且能夠抑制HEp2細胞的生長，促進腫瘤細胞的凋亡，CSD多肽還能抑制Erk1/2蛋白的磷酸化水平，其抑制細胞生長能力可能和 Erk1/2蛋白相關的生長信號通路被抑制有關，CSD多肽的抑制腫瘤的功能及具體的分子機制還有待深入研究。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.049

R739.6；R392

A

1671-0800（2016）07-0937-03

湖州市科技計劃項目（2012YSB19、2013GYB11）

313000浙江省湖州，湖州市中心醫(yī)院

顧棟樺，Email：donghuagu @sohu.communoResearch公司，兔抗人Erk1/2多克隆抗體（工作濃度1：1 000）、兔抗人磷酸化Erk1/2多克隆抗體（工作濃度1：1000）購自美國cell signaling公司，鼠抗人 -actin單克隆抗體（工作濃度1：1000）購自美國Sigma公司，過氧化物酶標記的二抗（工作濃度1：2 000）購于上海鼎國公司，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍（NBT/BCIP）購于瑞士Roche公司，ECL法試劑盒購于美國Pierce公司。細胞株及培養(yǎng)條件：人喉鱗癌細胞HEp2細胞購于美國ATCC公司，細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下用含10%胎牛血清（hyclone公司，美國）的無菌DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞生長至70%～80%細胞密度時傳代。

2016-03-22（本文編輯：陳志翔）